李 蒙 張 璐 胡 玥 呂 賓

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科，浙江 杭州 310000)

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應(yīng)激大鼠腸道樹突細(xì)胞的免疫功能

李 蒙 張 璐 胡 玥 呂 賓

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科，浙江 杭州 310000)

目的 研究應(yīng)激大鼠腸道樹突細(xì)胞(DC)表型及功能狀態(tài)的改變。方法 選用20只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組、實(shí)驗(yàn)組，各10只。給予實(shí)驗(yàn)組大鼠結(jié)直腸擴(kuò)張聯(lián)合束縛刺激，對照組大鼠不處理，采用大鼠腹部收縮反射(AWR)對兩組大鼠進(jìn)行直腸氣囊擴(kuò)張，測量腸道容量感覺閾值。成功建立模型后，磁珠分選技術(shù)分離腸系膜淋巴結(jié)DC，檢測其表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ、Toll樣受體(TLR)4的表達(dá)，將MLNDC與脾臟單個核細(xì)胞體外混合培養(yǎng)，流式標(biāo)記CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞，檢測MLNDC促CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組大鼠的疼痛閾值明顯低于對照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組大鼠MLNDC表達(dá)MHCⅡ水平高于對照組(P<0.05)，而表達(dá)CD80、CD86、MHCI與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組大鼠MLNDC表達(dá)TLR4高于對照組(P<0.05)；與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠MLNDC促CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P>0.05)。結(jié)論 大鼠應(yīng)激刺激后腸道DC上調(diào)表達(dá)TLR4，刺激其本身分化成熟，進(jìn)一步表達(dá)MHCⅡ，后者通過介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化，引起腸道低度炎癥，從而引起腸道內(nèi)臟高敏感的產(chǎn)生。

應(yīng)激；樹突細(xì)胞；Toll樣受體4

樹突細(xì)胞(DC)具有抗原遞呈作用，DC的樹突經(jīng)緊密連接能對抗原進(jìn)行直接識別，或其胞體能間接接受M細(xì)胞遞呈抗原，DC產(chǎn)生的信息能誘導(dǎo)免疫激活、免疫耐受，與癌癥發(fā)生、發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)〔1,2〕。成熟DC能介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答、體液免疫應(yīng)答，未成熟DC細(xì)胞能誘導(dǎo)免疫抑制、免疫耐受，通過檢測DC相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)能對DC在炎癥發(fā)生機(jī)制中可能起到的作用進(jìn)行探討〔3,4〕。腸易激綜合征(IBS)是一種常見的消化道疾病，治療難度大，多與腸道感染、免疫、腸道菌群失調(diào)等有關(guān)，但發(fā)病機(jī)制、病因尚未完全明確，是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的重難點(diǎn)〔5,6〕。本研究擬進(jìn)一步探討應(yīng)激對腸黏膜免疫功能的影響，對大鼠腸道DC進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選用20只雄性SD大鼠，體重(182.0±18.0)g，6～8周齡，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心提供。實(shí)驗(yàn)前2 w將所有大鼠放進(jìn)25℃恒溫飼養(yǎng)室，安排專人飼養(yǎng)，維持12 h∶12 h的晝夜交替，根據(jù)所需原則為大鼠提供水、食物。

1.2 方法

1.2.1 建立模型與分組 所有大鼠飼養(yǎng)2 w后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對照組，各10只。實(shí)驗(yàn)組大鼠采用結(jié)直腸擴(kuò)張聯(lián)合束縛應(yīng)激建立應(yīng)激大鼠模型，實(shí)驗(yàn)組大鼠采用結(jié)直腸擴(kuò)張刺激2 w：8F氣囊導(dǎo)尿管以石蠟潤滑后經(jīng)肛門插入直腸，氣囊遠(yuǎn)端距肛門1 cm，導(dǎo)尿管肛門外部分以棉線固定鼠尾根部，以60 mmHg氣囊壓力予以刺激，2次/d，間隔30 min，每次持續(xù)1 min。結(jié)直腸擴(kuò)張刺激結(jié)束后予以束縛應(yīng)激5 d：大鼠置入特殊制動籠器內(nèi)，束縛前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓頭面部，可少許前后活動，束縛時間為2 h。正常對照組大鼠不予任何刺激，結(jié)直腸擴(kuò)張聯(lián)合束縛應(yīng)激共19 d。造模結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)研究者采用國際通用的大鼠腹部收縮反射(AWR)評分標(biāo)準(zhǔn)評估腸道敏感性，具體方法如下：將大鼠于清醒狀態(tài)，不限制其活動情況下將8F帶氣囊導(dǎo)尿管外涂石蠟后經(jīng)肛門插入，氣囊末端距肛緣1 cm。導(dǎo)尿管肛門外部分以棉線固定鼠尾根部。30 min后大鼠適應(yīng)環(huán)境呈安靜狀態(tài)，擴(kuò)張球囊使球囊內(nèi)壓力逐漸升高，觀察腹部抬離桌面(AWR=3)時的氣囊壓力，由非實(shí)驗(yàn)者記錄AWR=3時的球囊壓力，共進(jìn)行3次，每次持續(xù)30 s，間隔3 min，取平均壓力值。

1.2.2 采集標(biāo)本 模型建立成功后，將大鼠處死，浸入75%酒精10 min后置于超凈臺內(nèi)，快速剖腹取脾臟，玻璃棒輕敲，剪刀剪小破口，使被膜下組織碎塊流出，可以附加碾碎，200目濾網(wǎng)過濾，獲得單細(xì)胞懸液；在無菌條件下，將小腸翻出體外，見在腸系膜近根部存在一排粟粒狀淋巴結(jié)，取下淋巴結(jié)，置入無血清RPMI1640備用。

1.2.3 分離腸系膜淋巴結(jié)DC(MLNDC) 將置入無血清RPMI1640的淋巴結(jié)用無菌載玻片將組織塊碾磨并過濾銅網(wǎng)，制成懸浮液體，離心10 min，PBS重懸并離心2次；以含10%胎牛血清的RPMI1640(含雙抗)懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，離心棄上清，每107個細(xì)胞加入80 μl緩沖液和20 μl Anti-RatDC(OX62)MicroBeads(德國Miltenyi公司)，混勻，在冰箱(4℃～8℃)孵育15 min，嚴(yán)格按照說明書分選OX62+DC，所獲細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的RPMI1640全培養(yǎng)基中。將分離得到的腸道單個核細(xì)胞均與PE標(biāo)記的OX62抗體孵育，4℃，避光30 min。同時孵育同型對照抗體。流式細(xì)胞儀檢測，CellQuest軟件進(jìn)行分析。細(xì)胞活力檢測：將0.4%臺盼蘭和分離前后的細(xì)胞懸液以1∶1混合后鏡下觀察并計(jì)數(shù)染色細(xì)胞比例。

1.2.4 檢測腸道MLNDC表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ、Toll樣受體(TLR)4的表達(dá) 各組MLNDC調(diào)整至1×107/ml，PBS漂洗離心后重懸約0.5 ml，分別與APC標(biāo)記的MHCⅠ抗體、FITC標(biāo)記的MHCⅡ抗體、APC標(biāo)記的CD86抗體、FITC標(biāo)記的CD80抗體、PE標(biāo)記的TLR4抗體孵育(美國eBioseience公司)，4℃，避光30 min，1 ml PBS漂洗，離心后以0.5 ml重懸，同時孵育各自同型對照抗體。流式細(xì)胞儀檢測相應(yīng)熒光強(qiáng)度，Cell Quest軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.5 檢測MLNDC促T淋巴細(xì)胞增殖能力 將獲得的脾臟單細(xì)胞懸液離心10 min，PBS重懸離心10 min共2次，離心后以含10%胎牛血清的RPMI1640(含雙抗)懸浮細(xì)胞，采用大鼠淋巴細(xì)胞分離液按照說明書要求密度梯度離心(20℃，20 min)，將分離得到的單個核細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋到1×107/ml細(xì)胞懸液備用。

CFSE標(biāo)記脾臟單個核細(xì)胞：使用DMSO配制5 mmol/L CFSE母液，在避光環(huán)境中，110 μl PBS溶液中加入1.1 μl的CFSE母液，迅速混勻，轉(zhuǎn)入已備好的1 ml單個核細(xì)胞懸液中，充分混勻，室溫反應(yīng)5 min，加入10 ml含有5%滅活FBS的PBS液終止標(biāo)記，離心5 min，收集沉淀，以含5%滅活FBS的PBS液離心5 min漂洗2遍，收集離心后沉淀，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，制備CFSE標(biāo)記的單個核細(xì)胞懸液。

將分離得到的MLNDCs調(diào)整濃度至5×106/ml，用含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(含雙抗)懸浮，分別以0.1 ml DC(5×105細(xì)胞/孔)加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)3復(fù)孔，每孔預(yù)孵育OVA(10 ng/ml)2 h，再加入同種大鼠脾臟CFSE標(biāo)記的單個核細(xì)胞懸液0.1 ml(MLNDC與其細(xì)胞濃度比值為1∶1)，另設(shè)MLNDC、脾臟單個核細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組，在含5%的CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，分別用抗CD4-PE及抗CD8-PE抗體標(biāo)記表面分子，流式細(xì)胞儀檢測，以CFSE為第一熒光，PE標(biāo)記抗體為第二熒光，用Cell Quest軟件獲取數(shù)據(jù)，Modfit軟件分析不同細(xì)胞亞群的CFSE。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 模型驗(yàn)證結(jié)果 造模后大鼠逐漸表現(xiàn)為大便質(zhì)稀、焦躁及體重減輕等，對照組大鼠一般情況良好。造模結(jié)束后第3天，以AWR=3分時所需的氣囊壓力作為評價指標(biāo)進(jìn)行模型驗(yàn)證，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組較對照組大鼠內(nèi)臟敏感性顯著增高，感覺閾值實(shí)驗(yàn)組(69.4±3.72)mmHg，對照組(84.2±3.61)mmHg(P<0.05)，提示應(yīng)激模型成功建立。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測OX62+MLNDC分選結(jié)果 平均每1只成年雄性SD大鼠的腸系膜淋巴結(jié)經(jīng)磁珠分選后可獲得約1×107個MLNDC，收集磁珠分選后的MLNDCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示OX62陽性率為87.91%±8.12%，臺盼藍(lán)染色后鏡下觀察并計(jì)數(shù)顯示細(xì)胞活性>90%。

2.3 MLNDC表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ、TLR4的表達(dá)水平 流式檢測結(jié)果表明，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)室小鼠MLNDC表面高表達(dá)MHCⅡ類分子(P<0.05)，而CD86、CD80及MHCⅠ類分子的表達(dá)無明顯變化(P>0.05)；與對照組相比，實(shí)驗(yàn)室小鼠MLNDC表面高表達(dá)TLR4(P<0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠MLNDC表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ、TLR4、TLR9的表達(dá)

與對照組相比：1)P<0.05

2.4 MLNDC促T淋巴細(xì)胞增殖能力 與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠腸道MLNDC可以顯著促進(jìn)CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞增殖，見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)

3 討 論

DC是目前所知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，能對一系列外來病原體信號進(jìn)行整合，并傳遞至淋巴細(xì)胞，使適宜的免疫應(yīng)答反應(yīng)啟動〔7〕。成熟DC的吞噬能力降低，但細(xì)胞表面的共刺激分子、黏附分子的相關(guān)表達(dá)增高，促使促炎癥細(xì)胞因子分泌，使初始T細(xì)胞介導(dǎo)的相關(guān)免疫應(yīng)答反應(yīng)啟動；而未成熟的DC通過微生物感染、移植后識別及吞噬外源性抗原，能快速成熟〔8,9〕。DC廣泛分布于多種組織，在腸道黏膜免疫系統(tǒng)，DC主要分布于腸道黏膜固有層、Peyer結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)，其中分布于腸道黏膜固有層、Peyer結(jié)的DC可以直接攝取抗原或通過伸出樹突進(jìn)入腸腔內(nèi)攝取抗原以呈遞給T細(xì)胞而引起免疫應(yīng)答反應(yīng)。DC可通過向T細(xì)胞提供活化所必需的抗原肽-MHC第一信號及CD80、CD86(即B7-Ⅰ、B7-Ⅱ)等共刺激分子第二信號，誘導(dǎo)初始型T細(xì)胞(Th0)向Th1和Th2分化并啟動T細(xì)胞免疫應(yīng)答，分別產(chǎn)生特征性細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ(Th1途徑)及IL-4、IL-5、IL-9(Th2途徑)。DC表達(dá)的Ⅰ類和Ⅱ類MHC分子是抗原多肽的載體，分別提呈內(nèi)源性和外源性抗原肽，介導(dǎo)CD8+及CD4+T淋巴細(xì)胞增殖活化。本研究結(jié)果說明，大鼠腸道MLNDC本身處于一個比較成熟的狀態(tài)，應(yīng)激刺激進(jìn)一步促使MLNDC上調(diào)表達(dá)MHCⅡ，刺激T淋巴細(xì)胞活化能力增強(qiáng)，引起其成熟水平的進(jìn)一步提高。

DC表面表達(dá)多種模式識別受體，其中TLR就是一類重要的模式識別受體，在識別微生物感染的過程中發(fā)揮重要作用。TLRs識別病原體的一些高度保守的分子結(jié)構(gòu)即病原體相關(guān)分子模式而啟動固有免疫應(yīng)答，介導(dǎo)抗感染免疫。TLRs在DC和巨噬細(xì)胞等專職抗原提呈細(xì)胞表面，表達(dá)尤其豐富。其中，TLR4在DCs分化和功能成熟過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，TLR4可以識別來源于腸腔的革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分脂多糖，通過胞內(nèi)的相應(yīng)信號通路傳遞信息，誘導(dǎo)DCs成熟，并促使其分泌細(xì)胞因子，活化T細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激大鼠腸道中，上調(diào)表達(dá)的TLR4可以通過識別相應(yīng)配體引起DC成熟活化，主要表現(xiàn)為表面MHCⅡ的上調(diào)表達(dá)，后者進(jìn)一步刺激T淋巴細(xì)胞活化，引起大鼠腸道低度炎癥的產(chǎn)生，從而介導(dǎo)應(yīng)激相關(guān)內(nèi)臟高敏感。

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〔2017-01-20修回〕

(編輯 李相軍)

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The immune function of intestinal dendritic cell in stressed rats

LI Meng,ZHANG Lu,HU Yue,etal.

Department of Digestive,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310000,Zhejiang,China

Objective To analyze the phenotype and function of intestinal dendritic cell (DC) in stressed rats.Methods 20 male SD rats were randomly divided into experimental and control groups,10 cases in each. Experimental group was established by combining colorectal distention with restraint stress,which underwent abdominal withdrawal reflex (AWR) to evaluate visceral sensitivity. After successful modeling,mesenteric lymph node DC (MLNDC) of rats was isolated and purified by magnetic label-based technique. The surface marker CD80,CD86,MHC Ⅰ,MHC Ⅱ,TLR 4 of MLNDC were tested by the technique of flow cytometry,and mixed lymphocyte reaction (MLR) was used to evaluate the capacity to stimulate T cell proliferation. Results The OX62 positivity cell population following magnetic sorting was about 87.91%±8.12%. Compared with control group，high level of MHC Ⅱ was expressed on the surface of MLNDCs (P<0.05),whereas the expression of CD80,CD86,and MHC Ⅰ were not significant (P>0.05). Compared with control group，high level of TLR4 was expressed on the surface of MLNDCs (P<0.05).CD4+or CD8+T cells proliferated when the DC/T ratio was increased. Conclusions Stress induces the increased expression of TLR4 in rats MLNDC,which stimulates T cells proliferation by upregulating the surface maker of MHC Ⅱ,resulting in the generation of intestinal low-grade inflammation and visceral hypersensitivity in IBS rats.

Stress;Dendritic cells;Toll-like receptors 4

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81600426)

呂 賓(1963-)，男，主任醫(yī)師，主要從事消化病研究。

李 蒙(1986-)，女，博士，住院醫(yī)師，主要從事胃腸道疾病研究。

R56

A

1005-9202(2017)14-3386-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.003