袁祖君 左松 王佳 張炯 馮勝剛

·實(shí)驗(yàn)研究·

蘆丁對(duì)腎臟缺血－再灌注損傷的保護(hù)作用

袁祖君 左松 王佳 張炯 馮勝剛

目的探討蘆丁對(duì)腎臟缺血－再灌注損傷（ischemia－reperfusion injury，IRI）的作用及其機(jī)制。方法將30只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、腎臟缺血－再灌注損傷組（IRI組）和蘆丁預(yù)處理組（Rutin組），每組10只。利用血管夾夾閉左側(cè)腎蒂，并切除右腎的方法構(gòu)建大鼠IRI模型。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)各組血清中尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF－α）、干擾素γ（interferon－γ，IFN－γ）和白細(xì)胞介素8（interleukin－8，IL－8）的表達(dá)水平，硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）檢測(cè)丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)過(guò)腎臟氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT－PCR）檢測(cè)腎組織TNF－α、IFN－γ和IL－8的信使RNA（mRNA）表達(dá)水平，蘇木精—伊紅染色法（hematoxylin－eosin staining，HE）檢測(cè)腎臟病理形態(tài)。結(jié)果與IRI組相比，Rutin組BUN、SCr、TNF－α、IFN－γ、IL－8和MDA的表達(dá)水平明顯降低（P＜0．01），而CAT、GPx和SOD的活性明顯增高（P＜0．05）。此外，Rutin預(yù)處理可明顯減輕腎組織病理形態(tài)改變（P＜0．05）。結(jié)論蘆丁可通過(guò)抑制炎癥和氧化應(yīng)激而減輕腎臟缺血－再灌注損傷。

蘆?。荒I臟缺血－再灌注損傷；炎癥；氧化應(yīng)激

腎臟缺血－再灌注損傷（ischemia－reperfusion injury，IRI）是因腎臟血供中斷或減少引起腎臟血流和腎臟需求之間不平衡而導(dǎo)致的腎臟損害，重新恢復(fù)腎臟血流引起腎臟損傷反而加重的臨床危象，容易誘發(fā)腎功能受損或腎衰竭，故嚴(yán)重威脅人類生命健康和生活質(zhì)量［1－4］。蘆?。≧utin）是從中藥槐米、槐角中分離的一種黃酮苷類成分，研究發(fā)現(xiàn)其多種生物學(xué)活性，如抗炎、抗凋亡、抗腫瘤等［5－6］。因此本實(shí)驗(yàn)探討蘆丁對(duì)IRI的作用及機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

蘆丁（Sigma，USA，經(jīng)HPLC鑒定純度超過(guò)99%）、水合氯醛（武漢谷歌）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）購(gòu)自美國(guó)Sigma，過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF－α）、干擾素γ（interferon－γ，IFN－γ）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)盒（Ebioscience，USA），實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real time reverse transcription polymerase chain reaction，RT－PCR）試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司，RTPCR引物由擎科生物技術(shù)有限公司合成。顯微鏡（Olympus BX51）及成像系統(tǒng)（HITMAS－30）和蘇木精－伊紅（hematoxylin－eosin staining，HE）染色后均為南充市中心醫(yī)院病理科提供。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和模型構(gòu)建

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 30只健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)別，體質(zhì)量220～250 g，由北京華?？祵?shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。放置在SPF動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)喂養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，狀態(tài)良好。隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、腎臟缺血－再灌注損傷組（IRI組）和蘆丁預(yù)處理組（Rutin組），每組10只。Rutin組術(shù)前1 h給予蘆丁腹腔注射（16 mg／kg），Sham組和IRI組則給予等量生理鹽水腹腔注射，IRI組和Rutin組施予腎缺血－再灌注手術(shù)。

2．腎缺血－再灌注手術(shù)方式 大鼠水合氯醛麻醉狀態(tài)下，行腹部正中切口，游離組織，分離暴露腎蒂，用血管夾閉左側(cè)腎蒂，紗布覆蓋切口置于恒溫水浴箱45 min，然后松開(kāi)血管夾，恢復(fù)腎臟血流灌注，去除右側(cè)腎臟，縫合腹部，術(shù)畢放回動(dòng)物房。假手術(shù)與上述類似，僅開(kāi)腹后不夾閉左側(cè)腎蒂。松開(kāi)血管夾后24 h處死大鼠，收集血清和腎臟標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物狀態(tài)較好，蘇醒較快，無(wú)死亡動(dòng)物，術(shù)后給予正常飲食飲水。具體手術(shù)方法參考文獻(xiàn)［7］。

三、標(biāo)本收集

各組大鼠在腎臟再灌注24 h后，行腹主動(dòng)脈取血，室溫下3 000 r／min離心10 min后取上清液送連云港中心醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)血尿素氮（BUN）和血肌酐（SCr）。開(kāi)腹取左腎，1／3腎置于多聚甲醛做石蠟切片，其余腎組織凍于－80℃冰箱。

四、腎臟病理檢查

左腎蠟塊4μm切片，脫蠟透明后由病理科實(shí)驗(yàn)室行HE染色，光鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)并評(píng)分。

分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：損傷＜10%，病理評(píng)分為0分；損傷在10%～25%，病理評(píng)分為1分；損傷在25%～50%，病理評(píng)分為2分；損傷在50%～75%，病理評(píng)分為3分；損傷在75%～100%，病理評(píng)分為4分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［7］。

五、RT－PCR檢測(cè)腎臟促炎癥細(xì)胞因子的信使RNA水平

采用RT－PCR法檢測(cè)腎臟TNF－α、IFN－γ和IL－8的信使核糖核酸（mRNA）表達(dá)水平。稱取適量腎臟組織，于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量濃度。引物序列見(jiàn)表1。采用兩步法PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件95°C預(yù)變性30 s；95°C變性5 s，60°C退火延伸1 min。共40個(gè)循環(huán)，得到每個(gè)樣本的循環(huán)值（threshold cycle，CT）法，用得到的各樣本的CT值按公式2－ΔΔCT計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用基因的引物序列

六、血清促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平的檢測(cè)

按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，檢測(cè)血清中TNF－α、IFN－γ和IL－8的表達(dá)水平。

七、腎組織MDA含量的檢測(cè)

利用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法檢測(cè)腎組織MDA的含量，具體操作按照說(shuō)明書(shū)。

八、腎組織氧化應(yīng)激酶類活性的檢測(cè)

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)利用黃嘌呤氧化鎂法測(cè)定腎組織CAT、GPx、SOD活性。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA），P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、蘆丁可以減輕腎臟IRI

與Sham組比較，IRI組SCr和BUN明顯增加（P＜0．01）；與IRI組比較，Rutin組SCr和BUN明顯降低（P＜0．05），這提示蘆丁可減輕腎臟IRI。（表2）

表2 蘆丁對(duì)腎臟IRI的影響

二、蘆丁可明顯減輕腎臟病理改變

與Sham組相比，IRI組腎小管壞死、管腔充血和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，其損傷評(píng)分為（3．5± 0．5）分，而Sham組損傷評(píng)分為（0．2±0．1）分，提示腎小管病理改變明顯增加（P＜0．01）。Rutin組與IRI組相比，腎小管壞死、管腔充血和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，其損傷評(píng)分為（1．5±0．5）分，提示蘆丁可明顯減輕腎臟損傷（P＜0．05）。本結(jié)果顯示，蘆丁在最佳濃度可明顯減輕IRI導(dǎo)致的腎臟病理改變。（圖1）

圖1 HE染色檢測(cè)蘆丁對(duì)腎臟形態(tài)的影響

三、蘆丁可降低腎臟MDA的含量

與Sham組比較，IRI組MDA表達(dá)水平明顯增高（P＜0．05）；與IRI組比較，Rutin組MDA水平明顯降低（P＜0．05）。結(jié)果提示蘆丁可明顯減少促氧化應(yīng)激酶MDA的表達(dá)。（表3）

表3 蘆丁對(duì)腎臟MDA表達(dá)的影響（±s）

表3 蘆丁對(duì)腎臟MDA表達(dá)的影響（±s）

注：與Sham組比較，aP＜0．05；與IRI組比較，bP＜0．05

組別 n MDA（nmol／mg）41 IRI組 10 14．68±3．15aRutin組（16 mg／kg） 10 7．22±1．58 Sham組 10 2．11±0．b

四、蘆丁可增加腎臟氧化應(yīng)激酶類的活性

與Sham組比較，IRI組CAT、GPx和SOD活性明顯降低（P＜0．01）；與IRI組比較，Rutin組CAT、GPx和SOD的活性明顯增高（P＜0．05）。這提示蘆丁可增加抗氧化應(yīng)激酶的活性。（表4）

表4 蘆丁對(duì)氧化應(yīng)激酶CAT、GPx和SOD活性的影響（U／mg，±s）

表4 蘆丁對(duì)氧化應(yīng)激酶CAT、GPx和SOD活性的影響（U／mg，±s）

注：與Sham組比較，aP＜0．01；與IRI組比較，bP＜0．05

28 IRI組 10 29．35±2．36a32．12±3．41a26．36±2．18aRutin組（16 mg／kg） 10 41．81±4．47b49．73±4．91b45．72±4．58 SOD CAT GPx Sham組 10 80．18±8．15 79．66±6．78 66．53±6．組別 n b

五、蘆丁可降低腎臟促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)

與Sham組比較，IRI組腎臟TNF－α、IFN－γ和IL－8mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0．01）；與IRI組比較，Rutin組腎臟TNF－α、IFN－γ和IL－8 mRNA表達(dá)明顯減少（P＜0．05）。這提示蘆丁可抑制腎臟促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。（表5）

表5 蘆丁對(duì)腎臟促炎癥細(xì)胞因子TNF－α、IFN－γ和IL－8mRNA表達(dá)水平的影響（±s）

表5 蘆丁對(duì)腎臟促炎癥細(xì)胞因子TNF－α、IFN－γ和IL－8mRNA表達(dá)水平的影響（±s）

注：與Sham組比較，aP＜0．01；與IRI組比較，bP＜0．05

15 IRI組 10 12．00±4．15a9．50±3．12a10．50±1．75aRutin組（16 mg／kg） 10 5．50±2．11b5．12±1．12b6．50±0．75 mRNA Sham組 10 1．00±0．12 1．00±0．10 0．95±0．組別 n TNF－αmRNA IFN－γmRNA IL－8 b

六、蘆丁可減少血清中促炎癥細(xì)胞因子的分泌

與Sham組相比，IRI組血清中TNF－α、IFN－γ和IL－8表達(dá)水平明顯增高（P＜0．01）；與IRI組比較，Rutin組血清TNF－α、IFN－γ和IL－8表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）。這提示蘆丁可減少促炎癥細(xì)胞因子的分泌。（表6）

表6 蘆丁對(duì)血清中促炎癥細(xì)胞因子TNF－α、IFN－γ和IL－8表達(dá)水平的影響（ng／L，±s）

表6 蘆丁對(duì)血清中促炎癥細(xì)胞因子TNF－α、IFN－γ和IL－8表達(dá)水平的影響（ng／L，±s）

注：與Sham組比較，aP＜0．01；與IRI組比較，bP＜0．05

組別 n TNF－α IFN－γ IL－8 10 105±15 110±10 100±15 IRI組 10 1200±200a 850±75a 950±110aRutin組（16 mg／kg）10 650±100b 550±45b 500±80 Sham組b

討 論

腎臟IRI好發(fā)于休克、心臟體外大循環(huán)和腎移植等手術(shù)，是由于腎臟血供中斷，導(dǎo)致腎臟缺血，重新開(kāi)放腎臟血供，導(dǎo)致腎臟損傷進(jìn)一步加重的臨床危象［14］。既往研究顯示氧化、炎癥、鈣超載、中性粒細(xì)胞聚集、凋亡是其重要的發(fā)病機(jī)制［14］，其中尤其值得注意的是氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

腎臟缺血－再灌注時(shí)，機(jī)體內(nèi)自由基和炎癥因子清除系統(tǒng)嚴(yán)重功能受損，導(dǎo)致活性氧自由基和炎癥因子大量產(chǎn)生，廣泛攻擊腎臟易損區(qū)，誘發(fā)過(guò)氧化和炎癥反應(yīng)的“瀑布狀”級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)大量MDA以及TNF－α、IFN－γ和IL－8產(chǎn)生，導(dǎo)致腎小管壞死、管腔充血和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，誘導(dǎo)腎臟病理結(jié)構(gòu)改變和腎功能損傷標(biāo)志物SCr和BUN的增加［89］。此外機(jī)體重要的活性氧自由基清除酶CAT、GPx和SOD，在自由基大量增加時(shí)，被嚴(yán)重消耗，可致使CAT、GPx和SOD活性明顯下降［89］。

蘆丁又名紫槲皮苷、蕓香苷，是一種來(lái)源廣泛的黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)其具有多種藥理學(xué)活性［56］，如抗炎，抗凋亡，抗氧化，抗腫瘤，清除體內(nèi)各種活性氧自由基，保護(hù)如GPx、CAT、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶等，并對(duì)器官IRI具有保護(hù)作用［1011］。

本結(jié)果顯示，蘆丁可顯著增加CAT、GPx和SOD活性，減少SCr、BUN、MDA、IFN－γ和IL－8的表達(dá)以及腎臟病理形態(tài)的改變，這提示蘆丁可通過(guò)抑制炎癥和氧化應(yīng)激而減輕IRI。

綜上所述，我們推測(cè)蘆丁可通過(guò)抑制炎癥和氧化應(yīng)激而減輕IRI。但除抑制炎癥和氧化應(yīng)激外，是否還有其他信號(hào)途徑涉及蘆丁減輕腎臟IRI，以及蘆丁如何調(diào)節(jié)炎癥和氧化應(yīng)激，尚需進(jìn)一步研究。

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The protective effect of rutin on renal ischemia－reperfusion injury

YUAN Zu－jun，ZUO Song，WANG Jia，ZHANG Jiong，F(xiàn)ENG Sheng－gang．Department of Nephrology，Nanchong Central Hospital，Nanchong637000，China

FENG Sheng－gang，E－mail：ncfsg＠sina．com

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of rutin on renal ischemia－reperfusion injury（IRI）．MethodsThirty SD rats were randomly divided into sham operation group（Sham group），renal IRI group（IRI group）and rutin pretreatment group（Rutin group）（n＝10 each）．The rat IRI model was constructed by clamping the left renal pedicle and removing the right kidney．The ELISA was used to detect the blood urea nitrogen（BUN），serum creatinine（SCr），tumor necrosis factor alpha（TNF－alpha）and interferon gamma（IFN－gamma）and interleukin－8（IL－8）．The levels of malondialdehyde（MDA），catalase（CAT），glutathione peroxidase（GPx）and superoxide dismutase（SOD）were determined．The reverse transcriptase polymerase chain reaction was used to detect the expression of TNF－alpha，IFN－gamma and IL－8 mRNA in renal tissues．The pathologic changes of renal tissues were observed by hematoxylin－eosin staining method．ResultsAs compared with the IRI group，the levels of BUN，SCr，TNF－alpha，IFN－gamma，IL－8 and MDA in rutin group were significantly reduced（P＜0．01），and the activities of CAT，GPx and SOD increased significantly（P＜0．05）．In addition，rutin pretreatment significantly alleviated the pathological changes in renal tissue（P＜0．05）．ConclusionsRutin can attenuate the renal IRI by inhibiting inflammation and oxidative stress．

Rutin；Renal ischemia－reperfusion injury；Inflammtion；Oxidative stress

2016－11－26

2017－06－05）

10．3969／j．issn．1671－2390．2017．06．011

國(guó)家自然科學(xué)基金（No．81500575）

637000 四川南充，南充市中心醫(yī)院腎內(nèi)科（袁祖君，左松，馮勝剛）；610000 成都，四川省人民醫(yī)院腎內(nèi)科（王佳，張炯）

馮勝剛，E－mail：ncfsg＠sina．com