趙大群 丁 祥 劉 露 錢 葉 許 婷 茍凡鋮 宋 波 侯萬儒 侯怡鈴

(1. 西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637009；2. 西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川 南充 637009)

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香乳菇多糖對Hela細胞凋亡及對RAW264.7細胞免疫活性的影響

趙大群 丁 祥 劉 露 錢 葉 許 婷 茍凡鋮 宋 波 侯萬儒 侯怡鈴

(1. 西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637009；2. 西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川 南充 637009)

為研究香乳菇多糖(LC-1)的抗腫瘤和免疫調(diào)控活性，將人的宮頸癌Hela細胞和小鼠巨噬細胞RAW264.7體外培養(yǎng)，分別通過CCK-8法、流式細胞術(shù)和ELISA技術(shù)檢測不同濃度LC-1對Hela細胞增殖和凋亡周期的影響，對RAW264.7細胞增殖、吞噬的影響,及對RAW264.7細胞分泌NO、IL-6和TNF-α的影響。結(jié)果表明：香乳菇多糖對體外培養(yǎng)的Hela細胞有明顯的抑制作用，且影響Hela細胞的形態(tài)及凋亡周期，當LC-1濃度為10 μg/mL時，Sub峰含量可達19.4%；同時，LC-1能調(diào)控巨噬細胞的免疫活性，當LC-1濃度為10 μg/mL時，巨噬細胞增值率和吞噬活性分別為67.48%和87.09%，亦能促進巨噬細胞從G0/G1期向G2期和S期轉(zhuǎn)化，同時刺激巨噬細胞產(chǎn)生IL-6和TNF-α，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，但對NO生成沒有明顯的促進作用。綜上，在體外試驗中，香乳菇多糖LC-1能抑制宮頸癌Hela細胞生長，促進RAW264.7細胞增殖和吞噬活性，刺激巨噬細胞產(chǎn)生免疫因子。

香乳菇多糖；Hela細胞；凋亡；巨噬細胞RAW264.7；增殖作用；吞噬作用

近年來，掀起了開發(fā)新型有效、低毒性的抗腫瘤藥物的熱潮。其中，真菌多糖引起越來越多科學(xué)家的關(guān)注[1-2]。由于多糖分離純化困難及其本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，能夠純化得到多糖純品并闡明其結(jié)構(gòu)的并不多，且大部分真菌多糖免疫調(diào)節(jié)活性的研究都集中在多糖粗提物的生物學(xué)活性方面[3-4]，而其混合物或復(fù)合物中具體是哪些成分起作用或者是起主要作用，尚不明確，導(dǎo)致其活性及相關(guān)分子生物學(xué)機制不清晰。

香乳菇[Lactariuscamphoratum(Bull.) Fr.] 屬傘菌目紅菇科乳菇屬的珍稀型食用真菌。因氣香味美，常將干品研磨成粉作為調(diào)味品?？拱┰囼瀃5-6]顯示，其提取物對肉瘤S-180 和艾氏腹水癌抑制率可達70%以上。

在筆者[7]前期的研究中，從香乳菇子實體中純化得到了水溶性的香乳菇多糖(LC-1)。該多糖是由兩種單糖組成的雜多糖，是一種結(jié)構(gòu)新穎的真菌多糖，具有顯著的抗氧化作用。本試驗擬探討香乳菇多糖(LC-1)對宮頸癌Hela細胞凋亡及對巨噬細胞RAW264.7免疫活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

香乳菇：采自四川省小金縣的野生真菌，由四川省重點實驗室西華師范大學(xué)丁祥教授鑒定；

小鼠巨噬細胞系RAW264.7、人類宮頸癌Hela細胞株：北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、5%胰酶和雙抗：美國Gibco公司；

LPS(脂多糖)：美國Sigma公司；

Griess檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；

CCK-8試劑盒：日本同仁化學(xué)研究所；

細胞周期與凋亡試劑盒、細胞凋亡與壞死檢測試劑盒：碧云天公司；

TNF-α ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒：武漢博士德公司；

其它化學(xué)藥品和試劑均為分析級。

1.1.2 主要儀器

細胞培養(yǎng)箱：311(氣套式)型，美國Thermo公司；

酶標儀：Multiskan GO型，美國Thermo公司；

流式細胞：BD Accuri C6型，美國BD公司；

倒置熒光顯微鏡：DM3000型，德國萊卡公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 多糖提取 按王芳等[7]提供的方法，將香乳菇子實體烘干，粉碎，獲得的子實體粉末于95 ℃水浴5 h，上清液濃縮，95%乙醇與濃縮液以體積比3∶1醇沉，收集沉淀烘干，獲得粗多糖。粗多糖溶液經(jīng)葡聚糖凝膠柱G-200純化后，收集過柱液濃縮烘干，-4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 LC-1對HeLa細胞生長的影響 將Hela細胞加入96孔板中培養(yǎng)24 h，分別用100 μL不同濃度LC-1的細胞培養(yǎng)液(2，4，6，8，10 μg/mL，試驗組)和LPS(2 μg/mL，陽性對照組)刺激細胞，培養(yǎng)24 h。加CCK-8試劑5 μL，酶標儀檢查450 nm波長時的吸光度值。倒置熒光顯微鏡400×鏡下拍照保存[6]。按式(1)計算細胞抑制率。

(1)

式中：

I——抑制率，%；

A1——測試樣品孔細胞的吸光度值；

A0——空白對照孔細胞的吸光度值[8]。

1.2.3 LC-1對Hela細胞凋亡的影響 用1 mL含不同濃度LC-1(2，4，6，8，10 μg/mL)和RPMI1640完全培養(yǎng)液(空白對照組)處理細胞，用細胞凋亡與壞死檢測試劑盒中1 mL細胞染色緩沖液重懸細胞，加入Hoechst染色液5 μL與PI染色液5 μL，混勻后，冰浴雙染30 min，用流式細胞儀檢測凋亡率[9]。

1.2.4 LC-1對巨噬細胞RAW264.7增殖的影響

(1) LC-1濃度對巨噬細胞RAW264.7增殖的影響：用100 μL 不同濃度(2，4，6，8，10 μg/mL)的LC-1、LPS(2 μg/mL，陽性對照組)和空白培養(yǎng)液(陰性對照組)刺激細胞，培養(yǎng)24 h。加入5 μL CCK-8試劑，用酶標儀測定在450 nm 波長下的吸光度值[10]。按式(2)計算細胞增殖活性。

(2)

式中：

P——細胞增殖率，%；

A0——細胞培養(yǎng)基的平均吸光度值；

A1——陰性對照組孔的平均吸光度值；

A2——測試樣品孔細胞的平均吸光度值[11]。

(2) 刺激時間對巨噬細胞RAW264.7增殖的影響：將巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng)在10 μg/mL的LC-1中，分別在0，6，12，24，48，72 h用CCK-8試劑盒檢測巨噬細胞RAW264.7增殖活性。

1.2.5 LC-1對巨噬細胞RAW264.7周期的影響 用1 mL不同濃度的LC-1的完全培養(yǎng)液(1，5，10 μg/mL)處理細胞，以不含LC-1的完全培養(yǎng)液作為空白對照，培養(yǎng)24 h，收集細胞。按細胞周期與凋亡試劑盒操作說明進行固定與染色。用流式細胞儀檢測細胞的DNA含量，并使用的modifit LT軟件計算各時期細胞DNA含量。每個試驗重復(fù)3次[12]。

1.2.6 LC-1對巨噬細胞RAW 264.7吞噬功能的影響 用不同濃度的LC-1溶液(2，4，6，8，10 μg/mL，試驗組)、LPS (2 μg/mL，陽性對照組)和空白培養(yǎng)液(陰性對照組)刺激細胞，培養(yǎng)24 h后，取出上清液，加入0.075%中性紅溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，吸出上清液，PBS洗3次，加0.1 mol/L的細胞裂解緩沖液(乙醇與乙酸體積比為1∶1)100 μL，放置于4 ℃冰箱中，2 h后用酶標儀測定540 nm處的吸光度[13]。

1.2.7 LC-1對RAW 264.7細胞IL-6和TNF-α含量的影響 分別用100 μL含有不同濃度LC-1的細胞培養(yǎng)液(2，4，6，8，10，50，100，200 μg/mL，試驗組)、LPS細胞培養(yǎng)液(2 μg/mL，陽性對照組)和空白培養(yǎng)液(陰性對照組)刺激細胞，培養(yǎng)24 h后，用ELISA試劑盒檢測上清液中的IL-6和TNF-α含量[13]。所有試驗重復(fù)3次。

1.2.8 LC-1對RAW 264.7細胞NO產(chǎn)生量的影響 分別用100 μL含有不同濃度LC-1的細胞培養(yǎng)液(2，4，6，8，10，50，100，200 μg/mL，試驗組)、LPS細胞培養(yǎng)液(2 μg/mL，陽性對照組)和空白培養(yǎng)液(陰性對照組)刺激細胞，培養(yǎng)24 h后，在上清液中加入Griess試劑50 μL，于540 nm處測定吸光度值，用亞硝酸鈉溶液繪制標準曲線計算NO生成量[14]。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 以SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 LC-1對HeLa細胞生長抑制試驗結(jié)果分析

LC-1對宮頸癌HeLa細胞抑制作用異常迅速，結(jié)果顯示(圖1)，在試驗組中，經(jīng)不同濃度LC-1處理后HeLa細胞活細胞數(shù)量明顯不同。當LC-1濃度為2 μg/mL 時較空白組抑制作用顯著(P<0.05)；而LC-1濃度達4～10 μg/mL時，均呈現(xiàn)極顯著的抑制作用(P<0.01)。當LC-1濃度為10 μg/mL時，在試驗濃度范圍內(nèi)對HeLa細胞的抑制率達最大，超過陽性對照組。經(jīng)不同濃度LC-1刺激后的宮頸癌細胞生長形態(tài)見圖2，隨香乳菇多糖LC-1濃度的增加，細胞的數(shù)量明顯減少，細胞開始變圓，細胞間隙增大，與鄰近細胞脫離，細胞核體積增大，出現(xiàn)懸浮細胞。結(jié)果表明，香乳菇多糖LC-1能夠抑制HeLa細胞的生長。

2.2 LC-1對Hela細胞周期的影響

不同濃度LC-1對Hela 細胞凋亡的影響見圖3。Sub峰表示凋亡細胞數(shù)量占所測細胞總數(shù)的百分比。結(jié)果顯示，在空白對照組中，Hela 細胞凋亡率為12.1%，經(jīng)2～10 μg/mL LC-1處理后的Hela 細胞的凋亡率分別達14.0%，15.1%，15.9%，18.9%，19.4%，較空白照對組均有所升高，并且隨著多糖濃度的升高，凋亡率升高越明顯。

*表示與空白對照組相比具有顯著性差異，P<0.05；**表示與空白對照組相比具有極顯著性差異，P<0.01

圖1 LC-1對Hela細胞體外抑制作用

Figure 1 Inhibitory effect of LC-1 on Hela cells in vitro

1. 未加多糖LC-1的空白組 2～6. 分別為2，4，6，8，10 μg/mL的LC-1的試驗組 7. 2 μg/mL的LPS陽性對照組

圖2 LC-1對Hela細胞形態(tài)的影響(400×)

Figure 2 Effect of LC-1 on the morphology of Hela cells (400×)

圖3 LC-1對Hela細胞周期的影響

多糖制劑作為抗腫瘤藥物，一般不會直接殺傷腫瘤細胞，而是通過刺激機體的特異性免疫功能達到抗腫瘤效果[15]，但LC-1可以在體外直接抑制Hela細胞的生長。當LC-1濃度為10 μg/mL 時，LC-1對HeLa細胞的直接抑制率可達為40.87%，超過陽性對照組，且影響Hela細胞的凋亡周期與細胞形態(tài)。

2.3 LC-1對RAW264.7細胞體外增殖活性的影響

由圖4可知，隨著LC-1濃度的增加，細胞增殖活性呈劑量依賴性增加。當LC-1濃度為6 μg/mL時，RAW264.7細胞增殖率達25.99%(與空白對照組相比，P<0.05)；當LC-1濃度為8，10 μg/mL時，增值率分別為47.55%，67.48%(與空白對照組相比，P<0.01)；當LC-1濃度為10 μg/mL時，RAW264.7細胞增殖活性接近陽性對照組。

由圖5可知，經(jīng)10 μg/mL LC-1處理了6 h的細胞與0 h比較，其增殖活性達15.98%；當處理時間達12 h，增殖活性達34.79%(與空白對照組相比，P<0.05)；當多糖刺激達到24 h，增殖活性為65.48%(與空白對照組相比，P<0.01)；值得注意的是，當刺激時間達48，72 h時，增殖活性雖然依舊在增加，但是增加速率較前12 h有所減慢。

*表示與空白對照組相比具有顯著性差異，P<0.05；**表示與空白對照組相比具有極顯著性差異，P<0.01

圖4 不同濃度LC-1對巨噬細胞RAW264.7增殖作用的影響

Figure 4 Effect of different concentrations of LC-1 on the proliferation of macrophage RAW264.7

*表示與空白對照組相比具有顯著性差異，P<0.05；**表示與空白對照組相比具有極顯著性差異，P<0.01

圖5 10 μg/mL LC-1刺激不同時間對巨噬細胞RAW264.7增殖作用的影響

Figure 5 Stimulation effect of 10 μg/mL LC-1 on proliferation of RAW264.7 in different time

2.4 LC-1對RAW264.7細胞周期分布的影響

LC-1對RAW264.7細胞周期進程的影響見圖6，LC-1對RAW264.7細胞周期各個階段分布都有一定程度的影響。用LC-1刺激細胞24 h后，G0/G1期細胞數(shù)相比對照組有明顯降低的現(xiàn)象，且呈濃度依賴性關(guān)系。當LC-1濃度達1，5，10 μg/mL時，其G0/G1期細胞比例分別減少到58.3%，57.6%，55.1%。同時，發(fā)現(xiàn)改變LC-1濃度，G2/M期的細胞數(shù)也發(fā)生變化。分別由空白組的14.1%，增加到14.7%，15.1%，19.7%。在細胞周期中，G1期主要合成RNA和核糖體，S期主要是DNA復(fù)制、組蛋白和酶的合成；G2期為有絲分裂的準備期。G0期細胞大量存在，則不利于細胞進行有絲分裂。結(jié)果提示，LC-1 可以促進巨噬細胞在G1期向G2期和S期轉(zhuǎn)化，減少G0期細胞產(chǎn)生，導(dǎo)致巨噬細胞增殖。

圖6 LC-1對巨噬細胞RAW264.7細胞周期的影響

2.5 LC-1對巨噬細胞吞噬功能的影響

巨噬細胞活力增加的重要指標之一是吞噬能力增強。用0.075%中性紅檢測LC-1刺激后巨噬細胞的吞噬能力，結(jié)果見圖7，與空白對照組相比，不同濃度的LC-1培養(yǎng)液中孵育24 h后的RAW264.7細胞，其吞噬能力增強，在試驗劑量范圍內(nèi)，活性與劑量呈依賴性關(guān)系。當LC-1濃度在8，10 μg/mL時，RAW264.7細胞的吞噬能力分別為85.60%，87.09%(與空白對照組相比，P<0.05)，且LC-1濃度在10 μg/mL時LC-1刺激RAW264.7細胞的吞噬能力高于陽性對照。

*表示與空白對照組相比具有顯著性差異，P<0.05；**表示與空白對照組相比具有極顯著性差異，P<0.01

圖7 LC-1對巨噬細胞RAW264.7吞噬功能的影響

Figure 7 Effect of LC-1 on phagocytosis of macrophage RAW264.7

多糖的主鏈結(jié)構(gòu)、支鏈的組成和分子量決定多糖的高級結(jié)構(gòu)，也是其抗腫瘤活性的重要因素。一般來說，具有中等分枝程度和分子量的多糖活性較高。分子量太大或太小，都難以達到理想的活性，各個多糖都有自己的最適分子量[16]。同時，多糖發(fā)揮抗生物活性的前提是能溶于水。多糖的水溶性增加，其藥理活性也相應(yīng)提高[17]。LC-1分子量為9 279 Da，在最適相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)，且具有良好的水溶性[7]，可能是導(dǎo)致香乳菇多糖具有誘導(dǎo)宮頸癌Hela細胞凋亡及對巨噬細胞RAW264.7具有免疫調(diào)控活性的關(guān)鍵。

2.6 LC-1對細胞因子分泌的影響

細胞因子在免疫應(yīng)答機制中起著舉足輕重的作用。由圖8、9可知，加入LC-1刺激后的RAW264.7細胞中IL-6和TNF-α的含量較陰性對照組有增高趨勢，且在試驗范圍內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。當LC-1的劑量為8 μg/mL 時，IL-6和TNF-α的含量分別為153.02，483.74 pg/mL，與陰性對照組相比，均顯著上調(diào)，但LC-1的作用效果仍低于陽性對照組。

*表示與空白對照組相比具有顯著性差異，P<0.05；**表示與空白對照組相比具有極顯著性差異，P<0.01

圖8 LC-1對巨噬細胞分泌白介素6(IL-6)與腫瘤壞死因子α(TNF-α)的影響

Figure 8 Effect of LC-1 on IL-6 and TNF-α production in macrophage RAW264.7

圖9 低濃度LC-1對巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生NO的影響

巨噬細胞在機體的特異性免疫過程中最重要的是吞噬作用，在吞噬過程中同時會釋放出大量的細胞因子，調(diào)節(jié)其他免疫細胞進行免疫應(yīng)答[18-19]。10 μg/mL LC-1促使巨噬細胞增值率和吞噬活性分別可達67.48%，87.09%(與空白對照組相比，P<0.01)，亦能促進巨噬細胞從G1期向G2、S期轉(zhuǎn)化，減少G0期細胞產(chǎn)生，同時刺激巨噬細胞產(chǎn)生IL-6和TNF-α，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

2.7 LC-1刺激巨噬細胞生成NO效應(yīng)的影響

用上清液中亞硝酸鹽量作為檢測巨噬細胞RAW264.7生成NO量標準，其測定結(jié)果見圖9、10。與隨性對照組和空白培養(yǎng)液比較，低濃度LC-1對小鼠巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生NO沒有明顯的促進作用。高濃度LC-1對NO的生成量有一定的促進作用，但促進效果亦不顯著。

巨噬細胞在干擾素IFN-γ或者腫瘤壞死因子(TNF)激活下，能產(chǎn)生一氧化氮合酶(iNOS)，誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，調(diào)控巨噬細胞參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。同時，IL-6作為一種抗炎細胞因子，在TNF-α，IL-1的協(xié)同作用下以及IL-10等的激活下發(fā)揮免疫作用[20]。本試驗結(jié)果表明，LC-1可以促進IL-6和TNF-α的生成，不促進NO的生成，提示可能的分子機制不涉及一氧化氮合酶(iNOS)的參與。

圖10 高濃度LC-1對巨噬細胞RAW264.7NO產(chǎn)生的影響

3 結(jié)論

多糖制劑作為抗腫瘤藥物，一般不會直接殺傷腫瘤細胞，而是通過刺激機體的特異性免疫功能達到抗腫瘤效果。LC-1的主鏈和側(cè)鏈具有中等分枝程度，分子量在最適相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)，且具有良好的水溶性，是導(dǎo)致香乳菇多糖具有誘導(dǎo)宮頸癌Hela細胞凋亡及對巨噬細胞RAW264.7具有免疫調(diào)控活性的關(guān)鍵。在體外試驗中，LC-1能抑制宮頸癌Hela細胞生長，促進巨噬細胞增殖和吞噬活性，影響宮頸癌Hela細胞和巨噬細胞的周期，刺激巨噬細胞產(chǎn)生免疫因子，但涉及的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與分子機制還有待驗證。

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Inhibitory effect on Hela cells and immune effects on RAW264.7 cells of a polysaccharide fromLactariuscamphoratum(Bull.) Fr

ZHAO Da-qun DING Xiang LIU Lu QIAN Ye XU TingGOUFan-chengSONGBoHOUWan-ruHOUYi-ling

(1.CollegeofLifeScience,ChinaWestNormalUniversity,Nanchong,Sichuan637009,China; 2.KeyLaboratoryofSouthwestChinaWildlifeResourcesConservation〔MinistryofEducation〕,Nanchong,Sichuan637009,China)

The antitumor and immunoregulatory activities of polysaccharide LC-1 fromLactariuscamphoratum(Bull.) Fr. were studied by using the human cervical cancer Hela cells and the mouse macrophage RAW264.7 cells. The two kinds of cells were cultured in vitro, and the effects of different concentrations of LC-1 on the proliferation and cell cycle of Hela cells and the proliferation and phagocytosis of RAW264.7 cells were investigated. Moreover, the secretion of NO, IL-6 and TNF- alpha of RAW264.7 cells were tested using CCK-8 method, flow cytometry and ELISA technique, respectively. The results showed that polysaccharide LC-1 fromL.camphoratum(Bull.) Fr. has obvious inhibitory effect on Hela cells in vitro, and could influence the apoptosis cell cycle of Hela cells. When the concentration of LC-1 was 10 μg/mL, the content of Sub peaks was 19.4%. It was further found that polysaccharide LC-1 could regulate the immune activity of macrophage. When the concentration of LC-1 was 10 μg/mL, the phagocytic activity and proliferation rate of macrophage were 67.48% and 87.09%, respectively. LC-1 could also promote the transformation of macrophages from G0/G1 phase to G2 phase and S phase and stimulate macrophages to produce IL-6 and TNF-α, showing a dose-dependent. However, no obvious effect on the production of NO was observed. In conclusion, in vitro, polysaccharide LC-1 fromL.camphoratum(Bull.) Fr. could inhibit the growth of cervical carcinoma Hela cells and promote the proliferation and phagocytosis of macrophage, as well as stimulate macrophages to produce immune factors.

Lactariuscamphoratum(Bull.) Fr. polysaccharide; Hela cells; apoptosis; macrophage RAW264.7; proliferation; phagocytosis

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31400016)；四川省生態(tài)安全與保護重點實驗室開放基金資助項目(編號：ESP1408)；四川省教育廳重大培育項目(編號：16CZ0018)；南充市科技局項目(編號：16YFZJ0043)

趙大群，女，西華師范大學(xué)在讀碩士研究生。

侯怡鈴(1983—)，女，西華師范大學(xué)教授，博士。 E-mail: starthlh@126.com

2017—03—06

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.001