魏靜元

(遼寧省分析科學(xué)研究院，遼寧 沈陽(yáng) 110015)

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羥基酪醇對(duì)LPS引起的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用

魏靜元

(遼寧省分析科學(xué)研究院，遼寧 沈陽(yáng) 110015)

探索了羥基酪醇通過調(diào)控自噬在小鼠ALI模型中發(fā)揮其抗炎作用的潛在分子機(jī)制。通過Western印跡和染色方法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠細(xì)胞因子活性、炎癥因子水平、sirtuin(SIRT1/3/6)表達(dá)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活和自噬標(biāo)志物表達(dá)，用Sybyl/Surflex模塊研究了HT與SIRT和MAPK之間的分子對(duì)接。結(jié)果顯示，LPS刺激的SIRT抑制、MAPK磷酸化和自噬抑制均被HT給藥顯著消除。伴隨著BAL液中肺W/D比值、蛋白質(zhì)濃度和炎癥細(xì)胞水平的降低，HT治療顯著減弱肺水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到肺組織中。包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和MCP-1等炎癥介質(zhì)的LPS驅(qū)動(dòng)釋放，被HT強(qiáng)烈調(diào)控。

羥基酪醇；脂多糖；自噬；急性肺損傷；sirtuin蛋白

羥基酪醇(hydroxytyrosol，HT)，又名 3，4-二羥基苯乙醇，是一種天然抗氧化劑，廣泛存在于橄欖科橄欖屬植物的枝葉及果實(shí)中，是橄欖油的有效成分，其對(duì)急性肺損傷(ALI)自噬作用引起越來越多的關(guān)注。自噬是細(xì)胞蛋白質(zhì)和細(xì)胞器自我降解的過程，已被發(fā)現(xiàn)參與不同的生理過程，包括炎癥反應(yīng)和組織損傷[1]。已經(jīng)證明，自噬缺陷的小鼠，腹膜腔內(nèi)注射脂多糖(LPS)導(dǎo)致相對(duì)于對(duì)照小鼠更高水平的促炎細(xì)胞因子和高死亡率[2]。此外，某些研究[3-4]涉及一些sirtuin家族成員在炎癥過程中發(fā)生的保護(hù)機(jī)制，最近已經(jīng)開發(fā)了藥理學(xué)方法通過靶向其活動(dòng)來調(diào)節(jié)炎癥。然而，確切的作用機(jī)制尚未得到充分闡述。

急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)與肺對(duì)感染性、炎性或化學(xué)損傷的一致反應(yīng)有關(guān)，因此通常與全身性疾病如敗血癥或重大創(chuàng)傷相關(guān)[5]。具體來說，肺是多發(fā)性傳染病的常見目標(biāo)，包括嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒或禽流感AH5N1病毒，兩者都會(huì)導(dǎo)致因ARDS并發(fā)癥而致無法接受的高死亡率[6]。因此，ALI/ARDS成了全球公共衛(wèi)生的主要負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致醫(yī)療支出巨大，死亡率高達(dá)30%～50%[7]。在過去幾十年中，盡管在支持性護(hù)理治療方面有所改善，但尚未開發(fā)出具體針對(duì)ALI/ARDS的藥物治療方案[5,8]。

含有大量橄欖油的地中海飲食與心血管疾病和某些癌癥的較低發(fā)病率相關(guān)[9]。在這些橄欖油酚中，具有生物活性的酚類化合物，如羥基酪醇(HT)被認(rèn)為是最豐富和最有代表性的多酚[10-11]。最近的幾項(xiàng)研究表明，HT具有抗氧化[12]、抗炎[13]和抗菌[14]活性。同時(shí)，研究表明，HT沒有毒性[15]，是商業(yè)上可用的食品和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑[10,15]。此外，HT的抗炎功效也已在體外和體內(nèi)廣泛研究和闡明[14]。然而，HT對(duì)感染性肺損傷和炎癥反應(yīng)(如ALI/ARDS中所見)的影響尚未完全了解。

本研究的目的是評(píng)估HT對(duì)減少炎癥、促進(jìn)自噬和激活SIRT的作用，并將這些作用與地塞米松(DXM)進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 試劑

HT：純度>98%，西安應(yīng)化生物科技公司；

脂多糖(LPS，大腸桿菌O111：B4)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

地塞米松(DXM)：純度>99.6%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

小鼠白介素(IL)-1β、IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒：美國(guó)Biolegend公司；

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族抗體(包括ERK、JNK和p38)、小鼠β-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠和兔IgG(磷酸化和非磷酸化)(H+L)二抗：美國(guó)ABclonal Biotech 有限公司；

LC3、Beclin-1和SIRT3一抗：美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；

SIRT1一抗、SIRT6一抗：英國(guó)Abcam公司；

單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)一抗：美國(guó)NOVUS Biologicals 公司；

其他化學(xué)試劑：分析純，碧云天生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

BALB/c小鼠：雄性，6周齡，體重約20 g，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)室溫度(24±1) ℃，相對(duì)濕度60%。將小鼠飼養(yǎng)在具有過濾空氣、高壓滅菌木床、食物和水的滅菌微型隔離器籠中。所有的試驗(yàn)程序按照實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物福利指南操作。在試驗(yàn)期間沒有小鼠死亡，沒有明顯的疲憊跡象。

1.2.1 LPS 刺激方案 小鼠隨機(jī)分為4組。在LPS攻擊前1 h給予相應(yīng)的藥物或生理鹽水處理。 在LPS滴注后24 h處死小鼠。

(1) 對(duì)照組：生理鹽水，每只小鼠0.2 mL，灌胃。

(2) LPS組：每只小鼠10 μg，鼻內(nèi)[16]。

(3) HT + LPS組：HT，100 mg/kg，灌胃；LPS，每只小鼠10 μg，鼻內(nèi)[17]。

(4) DXM + LPS組：DXM，5 mg/kg，灌胃；LPS，每只小鼠10 μg，鼻內(nèi)[17]。

1.2.2 藥品管理 每次在相應(yīng)的LPS攻擊前1 h，灌胃小鼠生理鹽水(每只小鼠0.2 mL)或HT(100 mg/kg，溶于生理鹽水)。DXM是一種合成的腎上腺皮質(zhì)激素，用于治療各種炎性疾病。 因此，在本研究中，DXM(5 mg/kg，溶于生理鹽水，灌胃)作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 方法

1.3.1 支氣管肺泡灌洗(BAL)液收集和肺組織分離 最后一次攻擊24 h后，將小鼠麻醉并進(jìn)行氣管切開術(shù)。通過具有0.5 mL高壓滅菌的PBS(pH=7.2)的氣管插管進(jìn)行BAL液的3次收集，總體積約1.3 mL，流體的回收率約為87%。將收集的BAL液體樣品在4 ℃下以700×g離心10 min，并將上清液在-80 ℃下冷凍以進(jìn)一步做 ELISA，然后將細(xì)胞沉淀物處理并用作炎性細(xì)胞分析的樣品。 從未進(jìn)行BAL液收集的小鼠中同時(shí)收獲肺組織，然后用優(yōu)化切割溫度(O.C.T.)化合物或-80 ℃保存做進(jìn)一步試驗(yàn)，包括western印跡分析、形態(tài)學(xué)研究和免疫組織化學(xué)染色。

1.3.2 支氣管肺泡灌洗(BAL)液分析

(1) BAL液的細(xì)胞分類計(jì)數(shù)：將細(xì)胞沉淀再次懸浮于1 mL紅細(xì)胞裂解緩沖液中，以除去紅細(xì)胞。 隨后，4 ℃，700×g離心10 min將白細(xì)胞分離。 然后，將這些白細(xì)胞沉淀再次懸浮于1.0 mL PBS(pH=7.2)中，并使用KWIK-DIFFTM染色試劑盒(Thermo Fisher Scientific Inc)進(jìn)行染色。每個(gè)樣品總共200個(gè)細(xì)胞用于細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，包括用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器手工計(jì)算的淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。

(2) 細(xì)胞因子和趨化因子的測(cè)量：每個(gè)樣品的濃度一式兩份測(cè)定。 根據(jù)制造商的說明書，使用ELISA試劑盒測(cè)量BAL液樣品中細(xì)胞因子的含量，包括IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α。

1.3.3 肺免疫組織化學(xué)和組織學(xué)染色 對(duì)于組織病理學(xué)評(píng)估，分離未經(jīng)BAL的小鼠的肺組織，4 ℃下固定于4%多聚甲醛中24 h，PBS中洗滌后，4 ℃下在30%蔗糖中溫育過夜，然后嵌入O.C.T. 化合物并在-20 ℃冷凍。

7 μm厚的連續(xù)冰凍切片和一抗MCP-1(PBS 1∶2 000稀釋)進(jìn)行免疫組化孵育。二抗是用于MCP-1染色的抗鼠IgG。此外，組織切片用蘇木精和伊紅(H&E)染色用于炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。顯微照片被裁剪并校正了亮度和對(duì)比度，但沒有進(jìn)行其他操作。進(jìn)行肺切片炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和黏液產(chǎn)生的半定量分析時(shí)[18]，為了確定炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的嚴(yán)重程度，以盲法評(píng)估支氣管細(xì)胞計(jì)數(shù)，并在5分評(píng)分系統(tǒng)上評(píng)分：0，無細(xì)胞；1，幾個(gè)細(xì)胞；2，細(xì)胞環(huán)1個(gè)細(xì)胞層深；3，細(xì)胞環(huán)2～4個(gè)細(xì)胞深；4，細(xì)胞環(huán)超過4個(gè)細(xì)胞深。為了確定黏液生成的大小，使用5點(diǎn)分級(jí)系統(tǒng)以盲法定量氣道上皮中的杯狀細(xì)胞增生：0，無杯狀細(xì)胞；1，25%；2，25%～50%；3，50%～75%；4，75%。每個(gè)肺段至少在3個(gè)不同的區(qū)域進(jìn)行炎癥細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的評(píng)分。

1.3.4 分子對(duì)接 進(jìn)行對(duì)接研究以探索HT與SIRT和MAPK的潛在結(jié)合模式。 它們使用Sybyl程序包(X版)構(gòu)建，使用鮑威爾方法(Powell’s method)優(yōu)化，具有幾個(gè)收斂標(biāo)準(zhǔn)(kJ/mol/nm)的三重力場(chǎng)，并使用Gasteiger-Hückel方法[16]。 對(duì)接研究使用Sybyl / Surflex模塊進(jìn)行；SIRT1周圍不同半徑內(nèi)殘留物(PDB ID：4I5I在0.250 nm處分解)、SIRT3(用PDB ID：3GLS在0.270 nm處分解)、ERK(用PDB ID：4QYY解析為0.165 nm)、JNK(0.179 nm與PDB ID：5AWM)和p38(在0.230 nm，PDB ID：2YIX解析)定義為活性位點(diǎn)。Surflex-Dock程序用于具有默認(rèn)參數(shù)的對(duì)接計(jì)算，產(chǎn)生的莫爾卡德表面(Molcad surfaces)以觀察對(duì)接的蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的結(jié)合模式。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting) 將肺組織加入到Western和IP的細(xì)胞裂解緩沖液中，分別按照制造商的說明書在蛋白酶和磷酸酶抑制劑的冰上均質(zhì)化。 將勻漿在4 ℃下以14 000×g離心10 min，除去小部分的蛋白質(zhì)定量外，上清液分裝儲(chǔ)存在-80 ℃。 根據(jù)制造商的方案，使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。 在免疫印跡的每個(gè)泳道中加載等量的80 μg蛋白質(zhì)，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。

當(dāng)前社會(huì)發(fā)展得非?？?，數(shù)字媒體技術(shù)專業(yè)核心能力構(gòu)建和發(fā)展工作應(yīng)該根據(jù)的社會(huì)的發(fā)展而與時(shí)俱進(jìn)，要靈活運(yùn)用互聯(lián)網(wǎng)工具來強(qiáng)化數(shù)字媒體技術(shù)專業(yè)核心能力構(gòu)建和發(fā)展工作的開展。數(shù)字媒體技術(shù)專業(yè)核心能力構(gòu)建和發(fā)展應(yīng)該隨著社會(huì)的變革而變革，在當(dāng)今社會(huì)教師活動(dòng)可以通過新媒體或者互聯(lián)網(wǎng)來做到宣傳推廣，還可以通過校園內(nèi)部的廣播、校報(bào)等方式進(jìn)行宣傳。利用微信、微博等交流工具，將開展數(shù)字媒體技術(shù)專業(yè)核心能力構(gòu)建和發(fā)展的方式運(yùn)用到互聯(lián)網(wǎng)上，加快各個(gè)之間的交流，分享自身進(jìn)行，討論工作上的不足之處，對(duì)的數(shù)字媒體技術(shù)專業(yè)核心能力構(gòu)建和發(fā)展工作有著非常好的作用。

用含0.1% Tween-20(TBST)的Tris緩沖鹽水洗滌后，用一抗檢測(cè)免疫印跡。 通過使用過氧化物酶綴合的二級(jí)抗小鼠或抗兔抗體再次洗滌3次后，使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒開發(fā)結(jié)合的抗體。 使用預(yù)定分子量標(biāo)準(zhǔn)作為標(biāo)記。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS軟件(版本13.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并以平均值±SEM表示。組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。 生存日期由Kaplan-Meier文本呈現(xiàn)，并通過對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。#P<0.05或##P<0.01，相對(duì)于對(duì)照組；*P<0.05 或 **P<0.01，相對(duì)于LPS組；方差分析，使用Tukey-Kramer HSD比較所有組對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥基酪醇對(duì)促炎細(xì)胞因子和趨化因子水平的影響

由圖1可知，HT(100 mg/kg)和DXM(5 mg/kg)的治療有效地影響B(tài)AL液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的分泌(P<0.01)。 進(jìn)一步觀察HT對(duì)MCP-1在小鼠肺組織中的表達(dá)的影響見圖2。與模型小鼠相比，HT處理降低了MCP-1在肺組織中的表達(dá)。此外，HT在100 mg/kg的調(diào)節(jié)作用與5 mg/kg DXM的相當(dāng)。 說明HT對(duì)肺部炎癥的調(diào)節(jié)作用可能與Th1/Th2細(xì)胞因子平衡有關(guān)。

圖1 HT對(duì)BAL液評(píng)估的影響

2.2 羥基酪醇對(duì)BAL液中肺炎癥細(xì)胞積累的影響

越來越多的證據(jù)[2,19-20]表明，LPS刺激白細(xì)胞聚集到炎癥部位并導(dǎo)致隨后的全身炎癥。 由圖3可知，與生理鹽水處理組相比，暴露于LPS的BAL液中的白細(xì)胞水平顯著升高(P<0.01)。與LPS組相比，用HT預(yù)處理顯著抑制LPS誘導(dǎo)的總炎癥細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增加(P<0.05或P<0.01)。 此外，100 mg/kg的HT抑制與5 mg/kg的DXM(與DXM+LPS組相比，P>0.05)相當(dāng)。

(a) 對(duì)照組 (b) LPS組 (c) HT+LPS組 (d) DXM+LPS組

在LPS攻擊后24 h，取出肺組織并包埋在最佳切割溫度(O.C.T.)化合物中。對(duì)于MCP-1，一抗稀釋度為1/2 000，對(duì)7 μm厚度連續(xù)冷凍切片進(jìn)行免疫染色。重復(fù)試驗(yàn)3次，得到類似的結(jié)果

圖2 HT對(duì)肺內(nèi)MCP-1表達(dá)的影響

Figure 2 Effect of HT on MCP-1 expression in lungs

圖3 通過Kwik-Diff染色，HT對(duì)BAL液中炎癥細(xì)胞募集的影響

由圖4可知，蘇木精-伊紅染色顯示，在沒有HT預(yù)處理的情況下，LPS施用24 h后對(duì)肺部造成廣泛的形態(tài)學(xué)損傷，其表現(xiàn)為充血、水腫、白細(xì)胞聚集、增加肺泡間隔厚度，甚至肺泡塌陷。試驗(yàn)表明，在HT+LPS組中，LPS攻擊引起的病理癥狀得到改善。此外，在HT和DXM治療組之間沒有觀察到組織病理學(xué)染色的顯著差異。全肺炎癥被定義為支氣管炎炎癥評(píng)分的平均值見圖5(a)。這些染色特征表明HT對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺組織損傷具有保護(hù)作用。

(a) 對(duì)照組 (b) LPS組 (c) HT+LPS組 (d) DXM+LPS組

圖5 HT對(duì)肺組織生理學(xué)變化的影響

2.4 羥基酪醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺水腫和血管通透性變化的影響

BAL液中的總蛋白含量作為肺血管通透性的體內(nèi)測(cè)量。由圖5(b)可知，與生理鹽水組相比，LPS單獨(dú)處理顯著增加BAL液中總蛋白濃度(P<0.01)，而用HT治療可顯著抑制肺部蛋白滲漏(P<0.01)。此外，由圖5(c)可知，LPS刺激后肺濕/干比率與對(duì)照組相比大幅增加(P<0.01)。然而，在LPS攻擊前1 h施用HT(100 mg/kg)其增幅顯著降低(P<0.05)。

2.5 羥基酪醇對(duì)對(duì)接研究的影響

HT在SIRT1、SIRT3、ERK、JNK和p38的活性位點(diǎn)的對(duì)接顯示了HT與這些受體的氨基酸殘基之間的許多H鍵相互作用，見圖6。與HT復(fù)合物中的SIRT和MAPKs的虛擬對(duì)接還顯示HT與這些受體的活性位點(diǎn)緊密結(jié)合。結(jié)果表明，HT的活性成分可以通過SIRT和/或MAPK的信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮作用。

右側(cè)為SIRT和MAPK中HT的最佳對(duì)接姿態(tài)；左側(cè)為帶狀結(jié)構(gòu)描繪的相互結(jié)合作用

圖6 各個(gè)活動(dòng)位點(diǎn)的HT的FlexX對(duì)接構(gòu)象

Figure 6 FlexX docked conformation of HT in the active sites

2.6 羥基酪醇對(duì)SIRT表達(dá)和MAPK激活的影響

為了確定HT對(duì)自噬的陽(yáng)性效應(yīng)是否與SIRT和/或MAPK信號(hào)通路相關(guān)，進(jìn)一步檢查了sirtuin家族成員的蛋白質(zhì)表達(dá)(見圖7)。結(jié)果表明，與LPS組相比，HT治療顯著上調(diào)了所有這些SIRT的蛋白水平。 另外，通過施用HT，LPS處理組中磷酸化MAPKs(ERK，JNK和p38)水平的升高被顯著破壞(見圖8)。5 mg/kg的DXM導(dǎo)致具有ALI的小鼠中SIRT和MAPK活性的可比變化。結(jié)果表明，HT對(duì)自噬的有益作用可能部分由SIRT和/或MAPK途徑介導(dǎo)。

圖7 HT對(duì)LPS誘導(dǎo)的SIRT表達(dá)的影響

圖8 HT對(duì)LPS誘導(dǎo)的MAPK激活的影響

圖9 HT對(duì)LPS誘導(dǎo)自噬的促進(jìn)作用

2.7 羥基酪醇對(duì)肺組織自噬的影響

為了確定在LPS暴露的小鼠中是否可以通過HT處理誘導(dǎo)自噬，研究了LC3-II與LC3-I的比例(被認(rèn)為是自噬的準(zhǔn)確指標(biāo))。由圖9可知，與LPS組相比，HT給藥增加了LC3-II與LC3-I的比例。 此外，LPS攻擊顯著抑制了ALI的肺中Beclin1蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)水平，而HT和DXM治療基本上逆轉(zhuǎn)了這種抑制。 表明HT促進(jìn)ALI小鼠肺部自噬。

3 結(jié)論

近年對(duì)HT潛在機(jī)制的研究側(cè)重于其抗炎活性[21-23]，本研究探索了其通過調(diào)控自噬在小鼠ALI模型中發(fā)揮抗炎作用的潛在分子機(jī)制。HT給藥后顯著消除了LPS刺激所致的SIRT抑制、MAPK磷酸化和自噬抑制，增加了肺組織的自噬水平，并且伴隨著MAPK的信號(hào)失活。而且，HT給藥后顯著減弱了肺水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到肺組織中，明顯表現(xiàn)即BAL液中肺W/D比值、蛋白質(zhì)濃度和炎癥細(xì)胞水平的降低。此外，HT治療強(qiáng)烈調(diào)控了包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和MCP-1等炎癥介質(zhì)的釋放，表明HT可能是治療ALI/ARDS的有希望的候選者。

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Protective effect of hydroxytyrosol on LPS-induced acute lung injury in mice

WEI Jing-yuan

(Liaoning Province Academy of Analytic Sciences, Shenyang, Liaoning 110015, China)

This paper explored the underlying molecular mechanisms by which hydroxytyrosol exerts its anti-inflammatory effects in a murine model of acute lung injury (ALI) by up-regulating autophagy. LPS-induced cytokine activity, inflammatory factor levels, sirtuin (SIRT1/3/6) expression, mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation, and autophagy marker expression in ALI-mice were examined by western blotting and staining methods. Molecular docking between HT and SIRT and MAPK was studied with a Sybyl/Surflex module. The results showed that LPS-stimulated SIRT inhibition, MAPK phosphorylation, and autophagy suppression were all notably abolished by HT administration. HT treatment significantly attenuated pulmonary edema and inflammatory cell infiltration into lung tissues, accompanied by decreased lung W/D ratios, protein concentrations, and inflammatory cell levels in BAL fluid. LPS driven release of inflammatory mediators, including TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, and MCP-1, was strongly regulated by HT.

Hydroxytyrosol; Lipopolysaccharide; Autophagy; acute lung injury; Sirtuin

遼寧省自然科學(xué)基金(編號(hào)：20170540480)

魏靜元(1971—)，男，遼寧省分析科學(xué)研究院副研究員，博士。E-mail：906017405@qq.com

2017—04—31

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.002