張 杰,丁 琳,白 鴿,鄭德娟,曹雁平,2,*(.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京工商大學(xué),北京 00048; 2.食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心,北京 00048)

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超聲對木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量分布的影響

張 杰1,丁 琳1,白 鴿1,鄭德娟1,曹雁平1,2,*
(1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京工商大學(xué),北京 100048; 2.食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心,北京 100048)

本文探討了超聲對木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量大小及分布的影響。以牛血清白蛋白為底物,采用高效液相色譜法測定游離酶和固定化酶在超聲和非超聲作用下的酶解產(chǎn)物肽分子量大小及分布情況。結(jié)果表明,游離酶和固定化酶在超聲和非超聲條件下,酶解產(chǎn)物肽分子量大小及分布有一定的差異。非超聲條件下,游離木瓜蛋白酶酶解效果明顯比固定化酶酶解效果要好。比較超聲條件下游離木瓜蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量大小及分布情況發(fā)現(xiàn):游離木瓜蛋白酶超聲條件下酶解肽主要分布在180～1000 Da、1000～5000 Da這兩個(gè)范圍內(nèi),而固定化木瓜蛋白酶超聲條件下酶解肽在<180 Da所占比例比較大。

游離酶,固定化酶,超聲,高效液相色譜法,肽分子量分布

生物活性肽是具有抗氧化、降血壓、抗血栓、減脂、呈味、免疫活性等的特定肽類的總稱,這些肽有2～20個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量小于6000 Da[1]。多數(shù)生物活性肽是以非活性狀態(tài)存在于蛋白質(zhì)的長鏈中,當(dāng)用適當(dāng)?shù)牡鞍酌杆鈺r(shí),其分子片段與活性被釋放出來[2]。酶法生產(chǎn)小分子肽已在世界范圍內(nèi)引起關(guān)注,成為當(dāng)今世界相關(guān)領(lǐng)域研究的主要方向[3]。小分子肽是經(jīng)大分子蛋白進(jìn)一步酶解精制而成的,其生理活性取決于酶解后的肽分子量大小及氨基酸序列,所以測定肽的相對分子量大小顯得尤為重要。近年來,高效液相色譜法因其準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好,能準(zhǔn)確地表示出肽類的分子量大小及分布而得到廣泛應(yīng)用[4-5]。

自上世紀(jì)70年代開始,固定化酶因其穩(wěn)定性高、可重復(fù)利用、易與產(chǎn)物分離、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化生產(chǎn)而逐漸成為酶工程領(lǐng)域中最為活躍的研究方向之一[6]。但由于包埋法制備固定化酶的載體材料會(huì)對分子的擴(kuò)散傳質(zhì)產(chǎn)生抑制作用,酶活力往往會(huì)有不同程度的損失[7]。為提高固定化酶活力,使固定化酶更符合工業(yè)化生產(chǎn),國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究。肖瓊等[8]發(fā)現(xiàn)超聲處理玉米秸稈的纖維素酶時(shí)酶解得率比未加超聲波時(shí)酶解得率提高了48.3%。黃卓烈等[9]利用超聲處理酵母過氧化氫酶(CAT)發(fā)現(xiàn)酵母多酚氧化酶活性的提高是由超聲處理對酶分子構(gòu)象的進(jìn)行改變而引起的。Basto等[10]研究了20、150、500 kHz的超聲波處理對酶活性的影響,研究證明150 kHz條件下的酶解效果最好。目前關(guān)于超聲波處理對蛋白酶酶解的影響已經(jīng)有不少文獻(xiàn)報(bào)道,但是對超聲處理固定化酶來控制酶解產(chǎn)物肽分子量大小的研究還比較少。

本文以游離酶木瓜蛋白酶與包埋法制備出的海藻酸鈉-殼聚糖固定化木瓜蛋白酶為研究對象,采用高效液相色譜法對不同超聲功率和聲強(qiáng)作用下游離酶和固定化酶酶解產(chǎn)物分子量大小及分布進(jìn)行測定,明確超聲條件對酶解產(chǎn)物分子量分布的影響,為生物活性肽的開發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海藻酸鈉、殼聚糖、無水碳酸鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、無水氯化鈣 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;福林酚試劑、牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶(測定活力4.96×105U/g) Sigma公司;L-谷胱甘肽 拜爾迪生物技術(shù)有限公司;乙醇、乙腈、三氟乙酸 北京邁瑞達(dá)科技有限公司;肽標(biāo)準(zhǔn)品:細(xì)胞色素C(Mw12355)、抑肽酶(Mw6511.44)、桿菌肽(Mw1422.69)、甘氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸(Mw451.2)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(Mw189.1) 北京半夏科技發(fā)展有限公司。

JXD-02型多頻槽式處理系統(tǒng) 北京金星超聲波技術(shù)設(shè)備有限公司;DC-2006型低溫恒溫水浴 浙江寧波新芝生物科技股份有限公司;UVmini-1240型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司;CP214電子分析天平 上海市奧豪斯儀器有限公司;FE20型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省鞏義市予華有限責(zé)任公司;Waters2695高效液相色譜儀 Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固定化木瓜蛋白酶的制備 稱取0.57 g海藻酸鈉和0.03 g殼聚糖溶于20 mL pH7.0的Tris-鹽酸緩沖液中,于60 ℃磁力攪拌加熱至溶解并攪拌均勻,冷卻至室溫,加入1 mL 0.005 g/mL木瓜蛋白酶液,攪拌均勻。將此混合液緩慢滴入0.6 mol/L氯化鈣溶液中形成小球,置于4 ℃冰箱下30 min。用去離子水清洗,濾紙擦干,備用[11]。

1.2.2 肽分子量大小及分布的測定

1.2.2.1 測定條件 色譜柱為TSKgelG2000 SWXL(300 mm×7.8 mm)凝膠柱;流動(dòng)相為乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1(體積比);紫外檢測器的波長設(shè)為220 nm;泵流速設(shè)為0.5 mL/min;柱溫設(shè)為30 ℃;進(jìn)樣體積為10 μL。

1.2.2.2 分子量校正曲線 分別用流動(dòng)相制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 mol/mL的上述不同分子量肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用孔徑0.45 μm聚四氟乙烯膜過濾后進(jìn)樣,得到一系列標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。以各標(biāo)準(zhǔn)品相對分子量的對數(shù)(lgMw)對保留時(shí)間作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程。

1.2.2.3 樣品分子量的確定 不同超聲條件下酶解樣品處理后進(jìn)入HPLC檢測,把色譜圖中各個(gè)峰的保留時(shí)間代入1.2.2.2所得線性回歸方程中,計(jì)算酶解產(chǎn)物肽分子量的大小,根據(jù)色譜峰各個(gè)峰峰面積計(jì)算不同肽分子量所占的比例。

1.2.3 木瓜蛋白酶的酶解條件 準(zhǔn)確量取20 μL游離木瓜蛋白酶或者稱取1 g固定化木瓜蛋白酶,以保證游離酶和固定化酶酶活力均維持在6 U/g,加入3 mL谷胱甘肽和10 mL牛血清白蛋白,在酶解pH7、酶解溫度為40 ℃的條件下反應(yīng)30 min,于90 ℃高溫加熱滅酶10 min。靜置分層,取上清液在10000 r/min、4 ℃的條件下離心20 min,取上清液,用孔徑0.45 μm聚四氟乙烯膜過濾,備用。

1.2.4 游離木瓜蛋白酶酶解牛血清白蛋白

1.2.4.1 非超聲條件下游離木瓜蛋白酶酶解牛血清白蛋白 準(zhǔn)確量取20 μL游離木瓜蛋白酶,按上述1.2.3酶解條件酶解牛血清白蛋白,用1.2.2測定。

1.2.4.2 超聲條件下游離木瓜蛋白酶酶解牛血清白蛋白 準(zhǔn)確量取20 μL游離木瓜蛋白酶,在超聲頻率分別為28、40、50、135 kHz,超聲聲強(qiáng)分別為0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 W/cm2,超聲溫度為40 ℃的條件下,按上述1.2.3酶解條件酶解牛血清白蛋白,用1.2.2測定。

1.2.5 固定化木瓜蛋白酶酶解牛血清白蛋白

1.2.5.1 非超聲條件下固定化木瓜蛋白酶酶解牛血清白蛋白 稱取1 g固定化木瓜蛋白酶,按上述1.2.3酶解條件酶解牛血清白蛋白,用1.2.2測定。

1.2.5.2 超聲條件下固定化木瓜蛋白酶酶解牛血清白蛋白 稱取1 g固定化木瓜蛋白酶,在超聲頻率分別為28、40、50、135 kHz,超聲聲強(qiáng)分別為0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 W/cm2,超聲溫度為40 ℃的條件下,按上述1.2.3酶解條件酶解牛血清白蛋白,用1.2.2測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)各值均為三個(gè)平行數(shù)據(jù)的均值。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果與分析應(yīng)用Microsoft Excel 2007和Origin 9.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

高效液相色譜法所用色譜柱為TSK凝膠柱,其原理是按分子量大小對物質(zhì)進(jìn)行洗脫分離。樣品在洗脫過程中大分子無法進(jìn)入凝膠顆粒的孔徑中,只能從流動(dòng)相中以較快的速度流出層析柱,而小分子則能自由出入凝膠顆粒中,因此就要花費(fèi)較長的時(shí)間流經(jīng)柱床,從而使不同大小的分子得以分離[12]。

表1是各標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間,以各標(biāo)準(zhǔn)品相對分子量的對數(shù)(lgMW)對保留時(shí)間作圖,得到分子校正曲線方程為y=-0.251x+7.053,R2=0.971。

表1 各標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間Table 1 Peak time of each standard

圖1 各標(biāo)準(zhǔn)品的相對分子量的對數(shù)與保留時(shí)間的關(guān)系曲線Fig.1 Curve of logarithm of relative molecular weight and retention time of each standard

2.2 游離木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量分布

2.2.1 28 kHz下不同超聲聲強(qiáng)對游離木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量的影響 酶解產(chǎn)物分子量大小及分布結(jié)果如圖2所示。

圖2 28 kHz頻率下游離木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量分布Fig.2 Molecular weight distribution of papain hydrolyzate under 28 kHz frequency

由圖2可知,游離木瓜蛋白酶在非超聲、超聲頻率28 kHz時(shí),肽分子量在<180 Da和>10000 Da范圍內(nèi)所占比例比較小,多集中在180～10000 Da之內(nèi)。隨著超聲聲強(qiáng)的增大,肽分子量在180～1000 Da范圍內(nèi)所占比例有所增加,變化比較明顯。可能是由于木瓜蛋白酶作用位點(diǎn)廣泛，并具有低強(qiáng)度的酶切特異性,所以各個(gè)肽分子量分布范圍均比較多。

2.2.2 40 kHz下不同超聲聲強(qiáng)對游離木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量的影響 酶解產(chǎn)物分子量大小及分布結(jié)果如圖3所示。

圖3 40 kHz頻率下游離木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量分布Fig.3 Molecular weight distribution of papain hydrolyzate under 40 kHz frequency

由圖3可知,游離木瓜蛋白酶在非超聲、超聲頻率40 kHz時(shí)酶解產(chǎn)物肽分子量分布差異不大,多集中于180～10000 Da之間。其中,隨著超聲聲強(qiáng)的增加肽分子量在180～1000 Da范圍內(nèi)有所增加,1000～5000 Da范圍變化比較小,5000～10000 Da范圍內(nèi)先增加后有所減少。張艷艷[13]發(fā)現(xiàn)超聲波破壞了谷朊蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),適當(dāng)?shù)某暡A(yù)處理使得蛋白分子分布更加均勻,而過大的超聲波預(yù)處理功率又使得蛋白分子重新聚集折疊，不利于蛋白分子酶解,這與本研究的結(jié)論一致。

2.2.3 50 kHz下不同超聲聲強(qiáng)對游離木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量的影響 酶解產(chǎn)物分子量大小及分布結(jié)果如圖4所示。

圖4 50 kHz頻率下游離木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量分布Fig.4 Molecular weight distribution of papain hydrolyzate under 50 kHz frequency

由圖4可知,游離木瓜蛋白酶在超聲頻率50 kHz時(shí),隨著超聲聲強(qiáng)的增加,酶酶解產(chǎn)物肽分子量分布有明顯變化。在0.05 W/cm2時(shí)肽分子量分布比較集中,隨著超聲聲強(qiáng)增加,分子量在180～5000 Da的肽顯著增加，而>10000 Da的肽顯著減少(p<0.05)。Giizey等[14]研究發(fā)現(xiàn)用高強(qiáng)度超聲處理牛血清蛋白會(huì)引起蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)的含量增加,與本研究的趨勢一樣。

2.2.4 135 kHz下不同超聲聲強(qiáng)對游離木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量的影響 酶解產(chǎn)物分子量大小及分布結(jié)果如圖5所示。

圖5 135 kHz頻率下游離木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量分布Fig.5 Molecular weight distribution of papain hydrolyzate under 135 kHz frequency

由圖5發(fā)現(xiàn),游離木瓜蛋白酶在135 kHz頻率下酶解產(chǎn)物肽分子量主要集中在180～10000 Da范圍內(nèi)。隨著超聲聲強(qiáng)增加,分子量在180～5000 Da的肽顯著增加,分子量在5000～10000 Da的肽所占比例有所減少,在0.45 W/cm2時(shí)變化最為明顯。

朱國輝等[15]發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲不同功率處理菠蘿果蛋白酶的酶活較非超聲均有所增加,且最適功率為100 W,超聲功率再增加,酶活反而會(huì)有所降低,這與本研究的趨勢一致。

超聲對游離酶酶促反應(yīng)的影響主要集中于對酶和底物結(jié)構(gòu)的改變。Ma等[16]研究了高強(qiáng)度超聲場對堿性蛋白酶的作用機(jī)理發(fā)現(xiàn)超聲場對堿性蛋白酶的酶活力和分子結(jié)構(gòu)均有影響。任曉峰[17]利用原子力顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),超聲波使得玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)被破壞,導(dǎo)致蛋白顆粒疏松,蛋白酶更容易進(jìn)入玉米醇溶蛋白顆粒內(nèi)部,有利于疏水性氨基酸的釋放。

2.3 固定化木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量分布

2.3.1 28 kHz下不同超聲聲強(qiáng)對固定化木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量的影響 酶解產(chǎn)物分子量大小及分布結(jié)果如圖6所示。

圖6 28 kHz頻率下固定化木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量分布Fig.6 Molecular weight distribution of immobilized papain hydrolyzate under 28 kHz frequency

由圖6可知,固定化木瓜蛋白酶非超聲條件下酶解效果比較差,分子量分布范圍在>10000 Da最多,高達(dá)93.81%,其他分子量范圍所占總比例不足10%,與游離酶酶解產(chǎn)物分子量分布相比有明顯差異。可能是由于酶固定化過程中載體與酶之間的相互作用,酶活力往往會(huì)有不同程度的損失,所以固定化酶酶解效果往往不好。在超聲頻率為28 kHz,隨著超聲聲強(qiáng)的增加，肽分子量分布變化比較明顯,其中<180 Da肽分子量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在0.35 W/cm2時(shí)所占比例最大。

2.3.2 40 kHz下不同超聲聲強(qiáng)對固定化木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量的影響 酶解產(chǎn)物分子量大小及分布結(jié)果分別如圖7所示。

圖7 40 kHz頻率下固定化木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量分布Fig.7 Molecular weight distribution of immobilized papain hyrolyzate under 40 kHz frequency

由圖7可知,固定化木瓜蛋白酶在超聲頻率為40 kHz時(shí),隨著超聲聲強(qiáng)的增大,肽段分子量<180 Da所占比例變化明顯,呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在0.25 W/cm2達(dá)到最大值。由此認(rèn)為一定的超聲條件下可以提高固定化木瓜蛋白酶的酶解活性,故超聲對提高固定化酶酶解效果有一定影響。Govind等[18]發(fā)現(xiàn)超聲可以促進(jìn)固定化酶的酶活,并且隨著超聲功率的增加,酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,并在100 W時(shí)超聲作用最明顯,這與本研究的趨勢一致。

2.3.3 50 kHz下不同超聲聲強(qiáng)對固定化木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量的影響 酶解產(chǎn)物分子量大小及分布結(jié)果分別如圖8所示。

圖8 50 kHz頻率下固定化木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量分布Fig.8 Molecular weight distribution of immobilized papain hydrolyzate under 50 kHz frequency

由圖8可知,固定化木瓜蛋白酶在超聲頻率為50 kHz時(shí),隨著超聲聲強(qiáng)的增大，肽段分子量<180 Da所占比例變化明顯,呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在0.25 W/cm2達(dá)到最大值。說明固定化酶在小功率超聲作用條件下酶解效果不明顯。隨著超聲聲強(qiáng)增加小分子多肽所占比例顯著增加。朱少娟等[19]的研究結(jié)果表明,將胰蛋白酶、底物分別進(jìn)行超聲處理,經(jīng)紫外和熒光光譜分析發(fā)現(xiàn)一定的超聲波可能使酶及底物分子構(gòu)象發(fā)生變化,提高胰蛋白酶水解活性。由此證明超聲對提高固定化酶酶解效果有顯著影響。

2.3.4 135 kHz下不同超聲聲強(qiáng)對固定化木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量的影響 酶解產(chǎn)物分子量大小及分布結(jié)果分別如圖9所示。

圖9 135 kHz頻率下固定化木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量分布Fig.9 Molecular weight distribution of immobilized papain hydrolyzate under 135 kHz frequency

由圖9可知,固定化木瓜蛋白酶在超聲頻率為135 kHz時(shí),隨著超聲聲強(qiáng)的增大,肽段分子量<180 Da所占比例變化明顯。在超聲功率為0.25 W/cm2時(shí)，分子量大于10000 Da所占的比例最大,高達(dá)60.98%。超聲對固定化酶酶促反應(yīng)的影響與載體結(jié)構(gòu)、酶結(jié)構(gòu)、底物結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。Lin Chen等[20]研究發(fā)現(xiàn),酶解前適當(dāng)?shù)念A(yù)處理能夠使蛋白質(zhì)原本致密的結(jié)構(gòu)變的松散,暴露其內(nèi)部的作用位點(diǎn),使水解速度加快,提高蛋白質(zhì)的水解度,利于酶解。黃正華等[21]報(bào)道,超聲促進(jìn)了木瓜蛋白酶作用底物酪蛋白在海藻酸鈉及殼聚糖凝膠中的擴(kuò)散作用。朱少娟等[19]研究發(fā)現(xiàn)一定的超聲波可能使酶及底物分子構(gòu)象發(fā)生變化,提高胰蛋白酶水解活性。

3 結(jié)論

本文采用高效液相色譜法研究了超聲對木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量大小及分布的影響,結(jié)果表明,游離酶和固定化酶在非超聲及超聲條件下,酶解產(chǎn)物肽分子量大小及分布有一定的差異。非超聲條件下,游離木瓜蛋白酶酶解效果明顯比固定化酶酶解效果要好。比較超聲條件下游離木瓜蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量大小及分布情況發(fā)現(xiàn):游離木瓜蛋白酶超聲條件下酶解肽主要分布在180～1000、1000～5000 Da這兩個(gè)范圍內(nèi),而固定化木瓜蛋白酶超聲條件下酶解肽在<180 Da所占比例比較大。

酶法制備生物活性肽生產(chǎn)成本低,產(chǎn)品安全性高,生產(chǎn)條件溫和,水解進(jìn)程易于控制,可定位生產(chǎn)特定的肽,能較好地滿足生產(chǎn)需要,具有良好的應(yīng)用前景。本文只是針對超聲處理輔助酶解控制產(chǎn)物分子量方面進(jìn)行了一定程度的研究,但是還需要對蛋白質(zhì)預(yù)處理技術(shù)和可控酶解技術(shù)方面進(jìn)行深入探討。

[1]Moral,Reigm,Toldrf. Bioactive peptides generated from meat industry by-products[J]. Food Research International,2014(65):344-349.

[2]蘇秀蘭.生物活性肽的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,28(5):471.

[3]崔鳳霞.海參膠原蛋白生化性質(zhì)及膠原肽活性研究[D].

青島:中國海洋大學(xué),2007.

[4]陳星,李曉磊,吳瓊. 不同蛋白酶酶解產(chǎn)物活性大豆肽分子量分布狀態(tài)的研究[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010(7):1-7.

[5]陳季旺,姚惠源,陳尚衛(wèi).米糠可溶性蛋白酶解物的分子量分布的研究[J].中國油脂,2004(1):36-39.

[6]尹志娜.固定化酶及其在食品和生物領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)儀器,2009,7(10):11-15.

[7]Roberto F,Vero’nica R,Cesar M,et al. Stabilization of multiservice enzymes via immobilization and post-immobilization techniques[J]. Journal of Molecular Catalysis,1999(9):181-189.

[8]肖瓊,姚春才,勇強(qiáng),等.玉米秸稈超聲輔助酶水解[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,31(4):85-88.

[9]黃卓烈,林茹,何平,等. 超聲波對酵母過氧化氫酶及多酚氧化酶活性的影響[J].中國生物工程雜志,2003,23(4):89-93.

[10]Basto C,Silva C J,Gübitz G,et al. Stability and decolourization ability of Trametesvillosa laccase in liquid ultrasonic fields[J].Ultrasonics Sonochemistry,2007,14(3):355-362.

[11]黃正華,曹雁平,許朵霞,等. 成膠條件對殼聚糖-海藻酸凝膠硬度的影響[J]. 中國食品學(xué)報(bào),2015(2):163-167.

[12]張宜濤,于偉,江國永,等. 高效凝膠過濾色譜法測定肽的相對分子量分布[J]. 飼料畜牧,2012(8):42-44.

[13]張艷艷. 基于超聲預(yù)處理的谷朊蛋白ACE抑制肽制備及其過程原位監(jiān)測技術(shù)研究[D].鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué),2016.

[14]Gtizey D,Giilseren I,Bruce B,et al. Interfacial properties and structural conformation of thermosonicated bovine serum albumin[J]. Food Hydrocolloid,2006(20):669-677.

[15]朱國輝,黃卓烈,徐鳳彩,等. 超聲波對菠蘿果蛋白酶活性和光譜的影響[J]. 應(yīng)用聲學(xué),2003(6):10-14，38.

[16]Haile Ma,Liurong Huang,Junqiang Jia,et al. Effect of energy-gathered ultrasound on Alcalase[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2011,10(1):419-424.

[17]任曉峰. 掃頻超聲預(yù)處理對玉米醇溶蛋白特性及其酶法制備ACE抑制肽的影響[D].鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué),2014.

[18]Govind V,Mangesh D,Virendra K. Ultrasound assisted enzyme catalyzed synthesis of glycerol carbonate from glycerol and diethyl carbonate[J].Ultrasonics Sonochemistry,2015(22):311-316.

[19]朱少娟,施用暉,樂國偉.超聲波對胰蛋白酶水解酪蛋白的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2005,24(2):50-54.

[20]Lin Chen,Jianshe Chen,Jiaoyan Ren. Modications of soy protein isolates using combined extrusion pre-treatment and controlled enzymatic hydrolysis for improved emulsifying properties[J]. Food Hydrocolloids,2011(25):887-897.

[21]Z.H Huang,Y P Cao,D X Xu,et al. Effect of ultrasound on the diffusion properties of casein entrapped in alginate-chitosan gel[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2015(26):149-156.

Effect of ultrasonic on molecular weight distribution of papain hydrolyzate

ZHANG Jie1,DING Lin1,BAI Ge1,ZHENG De-juan1,CAO Yan-ping1,2,*

(1.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology & Business University(BTBU),Beijing 100048,China; 2.Beijing Engineering Research Center for Food Additives and Ingredients,Beijing 100048,China)

The influence of ultrasonic on the molecular weight and distribution of papain hydrolyzate was discussed in this paper. The enzymolysis products of free and immobilized enzymes were determined by high performance liquid chromatography(HPLC)with bovine serum albumin as substrate. The results showed that there were significant differences in the molecular weight and distribution of the hydrolyzate peptide between free and immobilized enzymes under ultrasound and non-ultrasound conditions. The molecular weight and distribution of free papain and immobilized papain hydrolyzate under ultrasonic conditions were found to be mainly distributed in the range of 180～1000 Da and 1000～5000 Da. The proportion of hydrolyzed peptides in immobilized papain under the condition of<180 Da was relatively large.

free enzyme;immobilized enzyme;ultrasonic;high performance liquid chromatography;peptide molecular weight distribution

2015-01-05

張杰(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：固定化酶，E-mail：zjzxw722@163.com。

*通訊作者:曹雁平(1961-)，男，博士，教授，研究方向：食品化學(xué)與安全，E-mail：caoyp@th.btbu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371722)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)14-0116-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.023