劉慧娟，張 敏，王慧娟，周 英*，趙 致

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省藥食兩用資源應(yīng)用開(kāi)發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

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川芎浸膏萃取溶劑研究及其有機(jī)溶劑殘留量的測(cè)定

劉慧娟1，2，張 敏1，2，3，王慧娟1，2，3，周 英1，2，3*，趙 致4

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省藥食兩用資源應(yīng)用開(kāi)發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

本論文基于某已上市復(fù)方川芎制劑制備工藝，通過(guò)對(duì)其制備過(guò)程中的萃取溶劑替代研究以及有機(jī)溶劑殘留測(cè)定方法研究，建立了以乙酸乙酯替代原生產(chǎn)工藝中三氯甲烷的川芎浸膏制備方法，同時(shí)建立了氣相色譜法測(cè)定浸膏中有機(jī)溶劑的殘留。結(jié)果表明，以乙酸乙酯作為川芎浸膏的萃取溶劑，與原浸膏HPLC法檢測(cè)結(jié)果一致，并更安全綠色環(huán)保。應(yīng)用所建立的GC法測(cè)定浸膏中乙酸乙酯殘留，加樣回收率98.44 %，該方法穩(wěn)定可靠，可用于測(cè)定浸膏中的乙酸乙酯殘留。

川芎；溶劑替代；GC；乙酸乙酯；殘留

川芎為傘形科植物川芎(Ligusticumstriatum)的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。其性溫，味辛、微苦，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效[1]。主要含有揮發(fā)油、生物堿類(lèi)、苯酞類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)化學(xué)成分[2]。臨床主要用于治療心腦血管、呼吸、泌尿系統(tǒng)及婦科方面的疾病。

研究所用復(fù)方川芎制劑為已上市銷(xiāo)售的治療心血管疾病藥物。其中川芎藥材在制備過(guò)程中使用了易制毒三氯甲烷。本研究保持原有生產(chǎn)工藝不變，對(duì)川芎浸膏中所用三氯甲烷進(jìn)行替代研究，篩選乙酸乙酯替代三氯甲烷。并參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]，建立了乙酸乙酯氣相色譜檢測(cè)方法，測(cè)定川芎浸膏中乙酸乙酯的殘留。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

川芎乙醇浸膏(貴州省民族藥業(yè)股份有限公司藥廠(chǎng)提供)；乙酸乙酯(AR，上海申博化工有限公司)；甲醇(AR，上海振興化工一廠(chǎng))。氣相色譜儀(日本島津，GC-2010，SHIMADZU)；頂空進(jìn)樣器(日本島津，DANI，HSS 86.50)；5%苯基-95%甲基聚硅氧烷為固定相(30 m×0.63 mm×1.0 μm)毛細(xì)管色譜柱(M2824，大連中匯科學(xué)儀器有限公司)；電子分析天平(AUW220D，日本島津)。

1.2 川芎生物堿浸膏的制備

1.2.1 原川芎浸膏的制備工藝 (藥廠(chǎng)生產(chǎn)工藝) 川芎破碎，加乙醇回流提取二次，第一次加6倍量，浸漬2 h，提取3 h，第二次加4倍量，提取2 h。濾過(guò)，合并濾液，減壓回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度1.05～1.55(55～60℃)，靜置讓其分為三層，取中層液減壓濃縮至相對(duì)密度1.10～1.05(55～60℃)，用濃氨水調(diào)節(jié)PH至9～10，用三氯甲烷提取三次，第一次3倍量，第二次2倍量，第三次1倍量，合并三次三氯甲烷提取液，加壓回收三氯甲烷并濃縮?；厥諠饪s15 min后，加入492 mL乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.01～1.05(55～60℃)，得川芎浸膏。

1.2.2 指紋圖譜HPLC方法(藥廠(chǎng)質(zhì)控方法)

1.2.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱為ZORBAX SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1 ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25℃。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取川芎浸膏約0.5 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱(chēng)定重量，超聲提取20 min，取出放至室溫，用甲醇補(bǔ)充減失重量，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液10 μL，用于川芎浸膏HPLC進(jìn)樣分析。

表1 梯度洗脫程序

1.2.3 萃取溶劑的替換 保持原川芎浸膏制備工藝不變， 對(duì)其中萃取溶劑三氯甲烷進(jìn)行替換。選取工業(yè)中“易得、價(jià)廉、低毒”有機(jī)溶劑二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚進(jìn)行替代研究。經(jīng)過(guò)溶劑萃取制備得到的川芎浸膏，通過(guò)國(guó)家藥典委員會(huì)的軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》進(jìn)行分析，以“平均數(shù)法”得到了溶劑替代后幾種川芎浸膏的模擬對(duì)照指紋圖譜(圖1A)，與三氯甲烷萃取的川芎浸膏進(jìn)行對(duì)比，圖譜以原浸膏(圖1B)為參照物。

1.3 GC法測(cè)定乙酸乙酯殘留量

1.3.1 色譜條件[3]色譜柱：Agilent HP-5(5%二苯基-95%二甲基硅烷共聚物為固定相)(30 m×0.32 mm×1.5 μm)毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度：180℃；檢測(cè)器：氫焰離子化檢測(cè)儀(FID)溫度：250℃；載氣：氮?dú)猓? ml/min；分流比：2∶1；升溫程序：起始溫度40℃，恒溫5 min后，以3℃/min升至60℃，再以20℃/min升至200℃，維持10 min。頂空瓶溫度：90℃加熱40 min，LOOP管溫度：100℃，TR.LINE溫度：115℃。

1.3.2 分流比 根據(jù)參考文獻(xiàn)中乙酸乙酯殘留氣相色譜法[3]，通過(guò)改變分流比，建立了川芎浸膏中乙酸乙酯殘留檢測(cè)法。

1.3.3 GC測(cè)定方法 色譜柱：5 %苯基-95 %甲基聚硅氧烷為固定相(30 m×0.63 mm×1.0 μm)毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度：180℃；檢測(cè)器：氫焰離子化檢測(cè)儀(FID)溫度：250℃；載氣：氮?dú)猓? ml/min；分流比：20∶1；升溫程序：起始溫度40℃，恒溫5 min后，以3℃/min升至60℃，再以20℃/min升至200℃，維持10 min。頂空瓶溫度：90℃加熱40 min，LOOP管溫度：100℃，TR.LINE溫度：115℃。

1.3.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密量取乙酸乙酯適量，加入甲醇，制成每毫升約含乙酸乙酯3 mg溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液10 ml用甲醇稀釋至100 ml容量瓶，搖勻。精密量取本溶液10 ml，置20 ml頂空瓶，壓蓋密封，置20 ml頂空瓶，壓蓋密封，作為對(duì)照品溶液。

1.3.3.2 供試品溶液的制備

取川芎浸膏約1 g，精密稱(chēng)定，置100 ml量瓶，加甲醇80 ml，超聲溶解，再加甲醇定容至刻度，搖勻，精密量取本溶液10 ml，置20 ml頂空瓶，壓蓋密封，作為供試品溶液。

1.3.3.3 空白對(duì)照溶劑的制備

精密量取甲醇10 ml，置20 ml頂空瓶，壓蓋密封，即空白對(duì)照溶劑。

1.3.3.4 系統(tǒng)適應(yīng)性檢驗(yàn)

分別取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白對(duì)照溶劑，照上述色譜條件，參照《中國(guó)藥典》2015版四部0521氣相色譜法，頂空進(jìn)樣，測(cè)得GC圖譜。

1.3.3.5 外標(biāo)一點(diǎn)法

測(cè)定乙酸乙酯殘留量計(jì)算公式

W樣=A樣W對(duì)/A對(duì)

式中W樣與A樣分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含樣品組分的重量及相應(yīng)的峰面積。W對(duì)及A對(duì)分別代表在對(duì)照品溶液進(jìn)樣體積中含純品組分的重量及相應(yīng)峰面積。

1.3.3.6 精密度試驗(yàn)

精密量取乙酸乙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液10 ml，置100 ml量瓶，用甲醇定容，搖勻，分別精密量取10 ml，置6個(gè)20 ml頂空瓶，壓蓋密封，照上述色譜條件，頂空進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

1.3.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取浸膏樣品，按上述供試品溶液制備方法制備供試品溶液，取6份，放置24h，分別于第0，2，4，6，9，12，24 h 進(jìn)樣一次，共進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積，計(jì)算RSD。

1.3.3.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取浸膏樣品，按上述供試品溶液制備方法制備供試品溶液，同法制備 6 份，照上述色譜條件，分別頂空進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，求出RSD。

1.3.3.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已測(cè)知含量的本品約0.5 g，精密稱(chēng)定，置100 ml量瓶，加對(duì)照儲(chǔ)備液4.5 ml，再加甲醇80 ml使超聲溶解，加甲醇定容至刻度，搖勻，精密量取本溶液10 ml，置20 ml頂空瓶，壓蓋密封，作為供試品溶液。同法制備5份，按上述色譜條件，分別測(cè)定。

1.4 GC法測(cè)定樣品中乙酸乙酯殘留

取本品三個(gè)批次，按照乙酸乙酯殘留量檢測(cè)方法供試品溶液制備方法制備供試品溶液，照上述色譜條件分別測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算乙酸乙酯的量，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑替代試驗(yàn)2.1.1 溶劑替代試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)原川芎浸膏制備工藝，選取上述列舉溶劑進(jìn)行萃取，分別制備出三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯萃取的川芎浸膏，根據(jù)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》分析，模擬對(duì)照指紋圖譜如圖1A，原浸膏指紋圖譜如圖1B，幾種萃取溶劑川芎浸膏指紋圖譜相似度結(jié)果如圖1C。2.1.2 溶劑替代試驗(yàn)結(jié)果分析 二氯甲烷未萃取出任何物質(zhì)，結(jié)果得到石油醚、乙酸乙酯、原浸膏3種浸膏的HPLC相似度，結(jié)果如表2。其中，乙酸乙酯與原浸膏相似度最高。因此，選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑。

2.2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果 系統(tǒng)適應(yīng)性檢驗(yàn)測(cè)得GC圖譜，見(jiàn)圖3。圖譜表明空白溶劑對(duì)乙酸乙酯測(cè)定無(wú)干擾。理論板數(shù)按乙酸乙酯峰計(jì)算，不得低于8000。

表2 幾種萃取溶劑川芎浸膏的相似度分析

注：S1、S2、S3分別代表石油醚、乙酸乙酯、原浸膏。

2.2 乙酸乙酯殘留量的氣相色譜檢測(cè)方法

2.2.1 分流比結(jié)果 結(jié)果顯示當(dāng)分流比為20∶1時(shí)，能檢測(cè)出乙酸乙酯。如圖2C所示。

2.2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果 乙酸乙酯峰面積的RSD為0.66%，說(shuō)明精密度良好。2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 乙酸乙酯峰面積RSD為0.42 %，結(jié)果表明供試品中乙醇的量在24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 本品中乙酸乙酯平均含量為0.027 %，RSD 為2.4 %。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明該方法回收率良好，見(jiàn)表3。乙酸乙酯平均回收率98.44 %，RSD=3%。

圖1 指紋圖譜相似度分析

Fig.1 Fingerprint similarity analysis

注：圖1-A為模擬對(duì)照指紋圖譜；圖1-B為原浸膏指紋圖譜；圖1-C為幾種萃取溶劑川芎浸膏指紋圖譜相似度圖譜。

圖2 分流比結(jié)果

圖3 系統(tǒng)適應(yīng)性檢驗(yàn)

溶劑取樣量(g)樣品中含量(mg)加入量(mg)測(cè)得量(mg)回收率(%)0．521-1．351．25993．260．513-1．351．350100．00乙酸乙酯0．516-1．351．360100．700．510-1．351．34999．930．500-1．351．32798．30

注：“-”表示未檢出。

2.3 GC法測(cè)定樣品中乙酸乙酯殘留

取本品三個(gè)批次，按照乙酸乙酯殘留量檢測(cè)方法供試品溶液制備方法制備供試品溶液，照上述色譜條件分別測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算乙酸乙酯的量，即得。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品中乙酸乙酯殘留量(n=3)

由上表4可知，頂空氣相法測(cè)定乙酸乙酯殘留，乙酸乙酯殘留量均小于0.5 %，即乙酸乙酯殘留量在國(guó)家藥典規(guī)定范圍內(nèi)(中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)乙酸乙酯殘留量小于0.5 %)。

3 結(jié)論與討論

該川芎復(fù)方制劑在川芎浸膏制 備過(guò)程中使用易制毒試劑三氯甲烷，為公安部管制類(lèi)試劑，污染環(huán)境，對(duì)人體有害。使用乙酸乙酯替代三氯甲烷，可使該制劑工藝更綠色環(huán)保，該產(chǎn)品更加安全健康。

川芎浸膏萃取溶劑經(jīng)過(guò)替換后，與原浸膏進(jìn)行指紋圖譜相似度分析，乙酸乙酯萃取所得浸膏與原浸膏相似度最高，且相似度達(dá)到0.9以上。同時(shí)用GC法檢測(cè)，乙酸乙酯殘留符合國(guó)家藥典限量標(biāo)準(zhǔn)。因此乙酸乙酯可以作為替換三氯甲烷的萃取溶劑。根據(jù)原制劑工藝制備出新川芎復(fù)方制劑，與原制劑相比，是否質(zhì)量合格，仍需做進(jìn)一步研究。對(duì)新制劑進(jìn)行質(zhì)量檢查及初步藥理活性試驗(yàn)，以確定溶劑替代后，該制劑是否具有與原制劑相同的療效，最終為該制劑工藝優(yōu)化提供更好的條件。

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[3] 竇 霞，靳子明，李應(yīng)東.頂空氣相色譜法測(cè)定歸黃膠囊中乙醇與乙酸乙酯殘留量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31(11)：1490-01.

Study on Extraction Solvent of Chuanxiong (Ligusticumstriatum) Extract and Determination of Residual Organic Solvent

LIUHui-juan1，2，3，ZHANGMin1，2，3，WANGHui-juan1，2，3，ZHOUYing1，2，3*，ZHAOZhi4

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China;2.GuizhouMedicineEdiblePlantResourcesResearchandDevelopmentCenter,Guiyang,Guizhou550025,China;3.GuizhouMedicineEdibleResourcesApplicationDevelopmentEngineeringLaboratory,Guiyang,Guizhou550025,China;4.CollegeofAgriculture,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

In this paper, based on the preparation process of a launched Chuanxiong (Ligusticum striatum) compound preparation technology, the preparation of Chuanxiong extract with ethyl acetate to replace trichloromethane in the original production process was established by studying the extraction solvent substitution and the determination of residual organic solvent in the preparation process. The determination method of residual organic solvent in the extract was established based on gas chromatography. The results showed that ethyl acetate was used as the extraction solvent of Chuanxiong extract, which was consistent with the results of the original extract but safer and greener. Sample recovery rate was 98.44% when determining ethyl acetate residues in the extract by the established GC method. The method was stable and reliable. It could be used to determine the ethyl acetate residue in the extract.

ligusticumstriatum; substitution of extraction solvent; gas chromatography; Ethyl acetate; Residue

2017-03-15；

2017-06-10

貴州省科技計(jì)劃(黔科合LH字[2014]7661)；貴州省藥食同源資源研究開(kāi)發(fā)科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)(黔科合人才團(tuán)隊(duì)[2015]4010號(hào));貴州省藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心(黔科合G字[2015]4001)；貴州省藥食兩用資源應(yīng)用開(kāi)發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室(黔發(fā)改投資[2015]542號(hào))；貴州省中藥民族藥制藥工程專(zhuān)業(yè)學(xué)位研究生工作站(黔教研合JYSZ字[2014]002)。

R917

A

1008-0457(2017)04-0068-04 國(guó)際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.04.012

*通訊作者：周英(1971-)，女，博士，教授，主要研究方向：藥學(xué)、中藥學(xué)；E-mail：yingzhou71@126.com。