趙 丹，張 雪，管 靜，周 英，俸婷婷*

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2. 貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省藥食同源植物資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；4. 貴州省藥食兩用資源應(yīng)用開發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；5.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

?

幾種中藥材對(duì)兔原代腎小管上皮細(xì)胞增殖作用影響的研究

趙 丹1，2，3，4，張 雪5，管 靜1，2，3，4，周 英1，2，3，4，俸婷婷1，2，3，4*

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2. 貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省藥食同源植物資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；4. 貴州省藥食兩用資源應(yīng)用開發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；5.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

通過體外培養(yǎng)兔原代腎小管上皮細(xì)胞，來研究大血藤、吳茱萸、豨薟草及川牛膝4種中藥材提取物對(duì)腎小管上皮細(xì)胞增殖作用的影響。利用MTT法測(cè)定大血藤、吳茱萸、豨薟草及川牛膝4種中藥材的水提與醇提的3 mg/L，30 mg/L和300 mg/L三個(gè)濃度組對(duì)兔原代腎小管上皮細(xì)胞增殖作用的影響。結(jié)果表明，吳茱萸和豨薟草的醇提300 mg/L濃度組及大血藤的水提300 mg/L濃度組對(duì)兔原代腎小管上皮細(xì)胞的增殖作用抑制很強(qiáng)，其存活率分別僅有24.12%，16.03%和30.84%，而大血藤的醇提3 mg/L濃度組和豨薟草的醇提30 mg/L及3 mg/L濃度組對(duì)兔原代腎小管上皮細(xì)胞的增殖作用具有促進(jìn)作用，其存活率達(dá)到了107.91%，114.95%和111.45%。大血藤、吳茱萸、豨薟草及川牛膝4種中藥材對(duì)兔原代腎小管上皮細(xì)胞增殖作用均有不同程度的影響。

大血藤；吳茱萸；豨薟草；川牛膝；增殖作用

大血藤(Sargentodoxacuneata)，木通科大血藤屬植物，具有抗炎，活血，祛風(fēng)止痛等藥理作用。吳茱萸(Tetradiumruticarpum)，蕓香科吳茱萸屬植物，具有止瀉、散寒止痛等藥理作用。豨簽草(SiegesbeckiaorientalisL.)為菊科草本植物，具有祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)，抗炎等藥理作用。川牛膝(CyathulaofficinalisKuan)，莧科杯莧屬植物，具有逐瘀通經(jīng)，通利關(guān)節(jié)，降血壓作用等藥理作用[1]。這4種中藥材均具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)、利水滲濕、益氣活血等功效，根據(jù)中醫(yī)藥理論中的性味歸經(jīng)之說，均可歸屬為腎經(jīng)。根據(jù)歸經(jīng)理論，能夠?qū)⑺幬锏淖饔门c人體的臟腑經(jīng)脈之間的關(guān)系相結(jié)合，說明藥物能治療或作用的臟腑經(jīng)脈的病變，從而就能具體的認(rèn)識(shí)到藥物的主要作用器官和藥物的特殊功效[2]。本文旨在利用原代分離的兔腎小管上皮細(xì)胞對(duì)大血藤、吳茱萸、豨薟草及川牛膝4種中藥材提取物對(duì)腎小管上皮細(xì)胞增殖作用的影響進(jìn)行研究，為這4種中藥材的應(yīng)用及腎毒性作用的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

20天齡雄兔購(gòu)自貴州省畜牧研究所實(shí)驗(yàn)基地，清潔級(jí)，合格證CSXK(黔)2012-001。

中藥材：大血藤、吳茱萸(四平市百草堂中藥飲片有限公司)；豨薟草(四川省川南藥業(yè)有限公司)；川牛膝(成都市益誠(chéng)藥業(yè)有限公司)。

試劑：DMEM/F12(1∶1)(Hyclone)，胎牛血清(四季青)，胰蛋白酶(Amresco)，堿性磷酸酶染液—鈣鈷法(南京建成)，SP染液、CK18(北京博奧森)，DAB顯色劑(北京中杉金橋)，噻唑藍(lán)(MTT)，二甲亞砜(DMSO)。

儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器)，冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技)，CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(Thermo)，倒置熒光顯微鏡(寧波舜宇)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)。

1.2 方法

1.2.1 中藥材提取物的制備 分別稱取大血藤、吳茱萸、豨薟草及川牛膝4種中藥材100.0 g，粉碎，分別用雙蒸水，75%乙醇為提取液，以料液比1∶10進(jìn)行回流提取，80℃，1 h，連續(xù)提取3次。合并提取液，抽濾濃縮，再低溫凍干，得到不同質(zhì)量的提取物，低溫密封保存，備用。

1.2.2 兔原代腎小管上皮細(xì)胞的分離與鑒定 以耳緣靜脈注入空氣處死，無(wú)菌切取雙腎，浸泡于冷PBS中，剝離腎締及腎包膜，保留腎皮質(zhì)，剪碎，過80目篩，取篩上部分研碎，再過150目篩，取篩上部分，以1500 r/min，離心7 min，去上清液，再用胰酶消化15 min，終止消化，離心去上清液，再用完全培養(yǎng)基定容至10 mL，均分至兩培養(yǎng)皿中，鏡檢。37℃，5%CO2培養(yǎng)，24 h后補(bǔ)加3 mL完全培養(yǎng)基，72 h后首次換液。

以濃度為1×105mol/mL的細(xì)胞接種于24孔板，爬片。37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。采用堿性磷酸酶染液(鈣鈷法)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行滴染。免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP法)，DAB試劑顯色。

1.2.3 中藥材提取物對(duì)腎小管上皮細(xì)胞增殖作用影響的測(cè)定 稱取中藥材水提物0.1 g，溶于1 mL完全培養(yǎng)基中，梯度稀釋至終濃度為3 mg/L，30 mg/L和300 mg/L。稱取中藥材醇提物0.1 g，溶于1 mLDMSO中，用完全培養(yǎng)基梯度稀釋至終濃度為3 mg/L，30 mg/L和300 mg/L。

以濃度為1×105mol/mL接種于96孔板，每孔200 μL，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。棄上清液，更換新培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組更換含不同濃度中藥材提取物的培養(yǎng)基，水提物空白對(duì)照組更換含完全培養(yǎng)基，醇提物空白對(duì)照組更換含2‰DMSO培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL MTT(終濃度0.5 g/L)，37℃，5%CO2條件下反應(yīng)4 h，棄上清液，每孔加入150 μLDMSO，振蕩10 min。490 nm處測(cè)OD值。以存活率為指標(biāo)，反映中藥材對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的影響，計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥材制備的結(jié)果

共制備4種中藥材的水煎物和醇提物，中藥材提取結(jié)果見表1。

表1 中藥材制備的結(jié)果

2.2 腎小管上皮細(xì)胞鑒定的結(jié)果

堿性磷酸酶化學(xué)染色呈陽(yáng)性結(jié)果，細(xì)胞質(zhì)中有灰黑色顆粒沉淀(圖1)。

免疫組化染色呈陽(yáng)性結(jié)果，圍繞細(xì)胞核周圍細(xì)胞質(zhì)及胞漿中呈棕黃色沉淀，蘇木素復(fù)染后顏色變深，呈棕褐色(圖2)。堿性磷酸酶是腎小管上皮細(xì)胞中的標(biāo)志性酶，細(xì)胞角蛋白CK18是腎小管上皮細(xì)胞特異性表達(dá)的角化蛋白。鑒定結(jié)果說明該細(xì)胞為所需的腎小管上皮細(xì)胞。

圖1 兔腎小管上皮細(xì)胞堿性磷酸酶染色×400

2.3 中藥材對(duì)腎小管上皮細(xì)胞增殖作用影響的結(jié)果

吳茱萸和豨薟草的醇提300 mg/L濃度組及大血藤的水提300 mg/L濃度組對(duì)兔原代腎小管上皮細(xì)胞的增殖作用抑制很強(qiáng)，其存活率分別僅有24.12%、16.03%和30.84%，而大血藤的醇提3 mg/L濃度組和豨薟草的醇提30 mg/L及3 mg/L濃度組對(duì)兔原代腎小管上皮細(xì)胞的增殖作用具有促進(jìn)作用，其存活率達(dá)到了107.91%、114.95%和111.45%。川牛膝的水提和醇提的3 mg/L，30 mg/L和300 mg/L三個(gè)濃度組對(duì)腎小管上皮細(xì)胞增殖作用的影響很小，其存活率均不低于90%，除水提300 mg/L濃度組的存活率為88.40%。具體數(shù)值見表2。

圖2 兔腎小管上皮細(xì)胞免疫組化結(jié)果

中藥材水提物OD值水提物抑制率(%)醇提物OD值醇提物抑制率(%)空 白0．5241±0．04—0．5417±0．04—大血藤300mg/L0．1588±0．0130．840．2045±0．0239．72大血藤30mg/L0．5155±0．06100．140．3603±0．0469．98大血藤3mg/L0．5028±0．07102．340．5555±0．04107．91吳茱萸300mg/L0．3408±0．0460．650．1355±0．0124．12吳茱萸30mg/L0．3563±0．0663．410．3673±0．0265．37吳茱萸3mg/L0．3973±0．0370．710．4138±0．0273．65豨簽草300mg/L0．4870±0．0994．600．0825±0．0016．03豨簽草30mg/L0．4887±0．0394．920．5918±0．05114．95豨簽草3mg/L0．4498±0．0287．360．5738±0．05111．45川牛膝300mg/L0．4753±0．0288．400．4910±0．0691．33川牛膝30mg/L0．5155±0．0395．890．5428±0．02100．96川牛膝3mg/L0．5138±0．0295．560．5395±0．02100．35

3 結(jié)論與討論

人體內(nèi)的代謝廢物大部分通過泌尿系統(tǒng)排出體外，腎小管是腎臟的重要組成部分，亦是泌尿系統(tǒng)的重要功能性結(jié)構(gòu)。代謝物在腎小球中進(jìn)行超濾，形成原尿進(jìn)入腎小管，在腎小管中進(jìn)行重吸收最終形成終尿排出體外。在此過程中各種藥物及其代謝物多數(shù)會(huì)直接與腎小管接觸后再排出體外，因此腎小管上皮細(xì)胞成為了外源物毒性作用的靶向結(jié)構(gòu)[3]。通過分離培養(yǎng)兔原代腎小管細(xì)胞，可以很快得到不同藥材對(duì)該細(xì)胞增殖作用影響的結(jié)果。這種通過體外建模來研究藥物的藥理活性方法已經(jīng)逐步普及，與體內(nèi)試驗(yàn)相比，該方法具有靶向準(zhǔn)確性高，出結(jié)果快，可信度高等優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)然也存在評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)不一等缺點(diǎn)，但是其數(shù)據(jù)也可作為藥理實(shí)驗(yàn)的考察依據(jù)之一。

中藥材大都來源于天然植物、動(dòng)物及礦物質(zhì)，且傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，相比于西藥，其毒性和副作用相對(duì)較小，應(yīng)用較為安全。隨著國(guó)內(nèi)中醫(yī)藥的快速發(fā)展，中藥越來越受消費(fèi)者的青睞，且中藥的研究也備受關(guān)注，從而中藥的使用范圍也在不斷擴(kuò)大，其不良反應(yīng)事件發(fā)生率也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。自20世紀(jì)60年代起，中藥所致的腎損害病例被陸續(xù)報(bào)道，引起了世界各國(guó)藥事管理部門和學(xué)界的廣泛關(guān)注[4]。腎臟作為人體代謝排毒的重要器官之一，多種藥物或其代謝產(chǎn)物大都必經(jīng)此處，在腎小管過濾、重吸收，再排出體外。此過程必然會(huì)與腎小管上皮細(xì)胞直接接觸，故采用體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞，測(cè)驗(yàn)中藥材對(duì)其的增殖毒性可從一方面反映中藥材對(duì)腎的影響，且具有快速高效的優(yōu)點(diǎn)。

大血藤、吳茱萸、豨簽草及川牛膝在抗炎鎮(zhèn)痛，祛風(fēng)濕方面均具有一定藥理作用[5-8]。并且在臨床上，也有一定的應(yīng)用，為了方便其在藥理研究方面更好的利用，利用分離培養(yǎng)兔原代腎小管細(xì)胞來試驗(yàn)其對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的增殖作用的影響是很有必要的。在本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)川牛膝的水提和醇提的不同濃度組對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的增殖毒性都很低，并且醇提的中濃度組及低濃度組對(duì)該細(xì)胞還具有促進(jìn)增殖作用，這樣可以增大其用量使其達(dá)到最佳的藥理療效。而吳茱萸的水提及醇提的高中低三個(gè)濃度組對(duì)該細(xì)胞均具有增殖毒性，故而在做其他藥理研究中，應(yīng)盡量選擇較低濃度，也可從吳茱萸較強(qiáng)的細(xì)胞毒性方面研究其一直細(xì)胞存活或生長(zhǎng)途徑。豨簽草及大血藤的水提中濃度及低濃度組對(duì)該細(xì)胞的增殖毒性也很低，并且豨簽草的醇提中低濃度組和大血藤的醇提低濃度組對(duì)該細(xì)胞還具有較好促進(jìn)增殖作用，從而在做其他藥理研究過程中適當(dāng)?shù)目刂破溆昧?。綜上所述，試驗(yàn)中藥材對(duì)兔原代腎小管上皮細(xì)胞增殖作用的影響可作為藥材在藥理研究過程中濃度篩選的依據(jù)之一。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(第一部)[M].中國(guó)醫(yī)藥科技出版社出版，2015.

[2] 馬 威，管競(jìng)環(huán).中醫(yī)內(nèi)科疾病用藥歸經(jīng)的分析與思考[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2008(03)：209-210.

[3] Blais A, Morvan-Baleynaud J, Friedlander G,etal.Primary culture of rabbit proximal tubules as a cellular model to study nephrotoxicity of xenobiotics[J].KidneyInternational,1993,44(1):13-8.

[4] 郭 曉，王 萌，朱 彥，等.中藥腎毒性機(jī)制研究現(xiàn)狀及評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展[J].中草藥，2015，45(23)：3981-3591.

[5] 陸連英.《本草綱目》中紅藤本草考證[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2000，11(2)：170．

[6] 龔慕辛，王智民，張啟偉，等.吳茱萸有效成分的藥理研究進(jìn)展[J].中藥藥理與臨床，2009，20(2)：183-187.

[7] 羅 瓊，汪建平，阮金蘭，等.豨薟草局部外用的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，10(3)：9-11.

[8] 葉品良，彭 娟，劉 娟.川牛膝研究概況[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2007，35(2)：51-53.

Effects of Several Traditional Chinese Medicinal Materials on the Proliferation of Primary Renal Tubular Epithelial Cells in Rabbit

ZHAODan1，2，3，4，ZHANGXue5，GUANJing1，2，3，4，ZHOUYing1，2，3，4，F(xiàn)ENGTing-ting1，2，3，4*

(1.SchoolofPharmaceuticalsciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025；2.GuizhouEngineeringCenterforTraditionalChineseMedicineandEthnicMedicine,Guiyang,Guizhou550025；3.ResearchandDevelopmentCenterforMedicineandEdiblePlantResourcesofGuizhou,Guiyang,Guizhou550025；4.MedicinalandEdiblePlantResourcesApplicationandDevelopmentEngineeringLaboratoryofGuizhou,Guiyang,Guizhou550025; 5.SchoolofPublicHealth,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550025)

The effects of extracts of four Chinese herbal medicines, namely Sargentodoxa cuneata、Tetradium ruticarpum、Siegesbeckia orientalisL and Cyathula officinalis Kuan, on the proliferation of renal tubular epithelial cells were studied by culturing rabbit primary renal tubular epithelial cells in vitro. The effects of 3 mg/L, 30 mg / L and 300 mg / L of water extraction and alcohol extraction of the four herbal medicines on tubule epithelial cell proliferation were studied by MTT method. The results showed that 300 mg / L of the alcohol extract of T. ruticarpum and S. orientalis and the water extract of 300 mg / L of S. cuneata significantly inhibited the proliferation of primary renal tubular epithelial cells by 24.04%, 16.03% and 30.84%, respectively. 3 mg / L of the alcohol extract of S. cuneata and 30 mg / L and 3 mg / L of alcohol extract of S. orientalis showed a proliferation effect on primary renal tubular epithelial cells, and the survival rate reached 107.91%, 114.95% and 111.45%. All of the four Chinese herbal medicines had some effects on the proliferation of primary renal tubular epithelial cells in rabbit.

sargentodoxacuneata；tetradiumruticarpum；siegesbeckiaorientalisL；cyathulaofficinaliskuan； proliferation effect

2017-02-25；

2017-04-16

貴州省藥食同源資源研究開發(fā)科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)(黔科合人才團(tuán)隊(duì)(2015)4010號(hào))；貴州省中藥民族藥制藥工程專業(yè)學(xué)位研究生工作站(黔教研合JYSZ字[2014]002)；貴州省科技重大專項(xiàng)子課題(黔科合J重大字[2015]2002-3-4)；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)(黔科合人才(2015)4032號(hào))。

R914

A

1008-0457(2017)04-0076-04 國(guó)際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.04.014

*通訊作者：：俸婷婷(1983-)，女，副教授，主要研究方向：中藥民族藥藥理毒理研究；E-mail： ftt0809@163.com。