王珍珍，陳仁金，楊章平，毛永江，冀德君

（1.徐州醫(yī)科大學，徐州 212004；2.揚州大學動科學院，揚州 225009）

奶牛乳腺細胞CXCR1基因在三種菌落刺激下的表達變化研究

王珍珍1，陳仁金1，楊章平2，毛永江2，冀德君2

（1.徐州醫(yī)科大學，徐州 212004；2.揚州大學動科學院，揚州 225009）

本研究旨在探索在不同菌落刺激下奶牛乳腺上皮細胞中CXCR1基因的表達變化。運用SYBR Green實時熒光定量PCR技術對CXCR1基因mRNA水平進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR1基因在細胞水平上對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌刺激較敏感，各個時段表達差異達顯示水平。本研究為今后進一步研究CXCR1基因的表達機理以及奶牛乳房炎的防治奠定了基礎。

CXCR1基因；實時定量PCR；奶牛乳腺上皮細胞

奶牛乳房炎是危害奶牛養(yǎng)殖的重要疾病。據(jù)報道美國每頭奶牛每年因乳房炎造成的花費大約是200美元，每年對奶牛業(yè)造成的損失達20億美元。我國每年因乳房炎造成的損失約150億～450億元。導致奶牛乳房炎的因素很多，但病原微生物是主要病因[1]，其中以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主的病原微生物是導致發(fā)病的主要因素，約占發(fā)病因素的90%[2]。很多研究通過對不同地區(qū)牛場的奶牛乳房炎進行細菌分離與藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，除以上三種主要病原菌是主要因素外，管理與環(huán)境因素也起到重要作用，并指出通過遺傳育種與生物技術手段來預防和控制乳房炎是重要手段之一。

趨化因子及趨化因子受體在炎癥發(fā)生時發(fā)揮重要作用。CXCR1作為趨化因子之一，在誘導中性粒細胞趨化物、白介素-8及生長相關基因等趨化物引起的炎癥反應中發(fā)揮重要作用。研究表明，牛CXCR1是影響奶牛乳腺炎的重要候選基因，并具有豐富的多態(tài)性[3,4]。Legva-Baca等對CXCR1.5’側(cè)翼區(qū)多態(tài)性進行了研究，共發(fā)現(xiàn)了3個突變位點，其中-1768（T/A）位點與體細胞評分達到極顯著水平[5]。Youngerman等研究了娟珊牛的5個單核苷酸位點，777（G/C）引起谷氨酸到組氨酸的變化，且GG基因型奶?；茧[性乳房炎的幾率顯著低于CC基因型奶牛[6,7]。

CXCR2主要分布于中性粒細胞和髓樣前體細胞系。CXCR1和CXCR2均具有介導活化中性粒細胞的作用，可促進中性粒細胞脫顆粒、釋放貯存酶，增強中性粒細胞的吞噬功能，啟動超氧離子釋放，導致機體局部炎癥反應，達到殺滅病原菌的目的[8,9]。本研究擬在細胞水平上對奶牛乳腺上皮細胞對三種菌落（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌）刺激的敏感性進行研究，以確定CXCR1的表達變化，為進一步研究CXCR1在奶牛乳房炎中的作用機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

奶牛乳腺上皮細胞系由哈佛大學孫有平教授惠贈。經(jīng)復蘇、傳代與凍存，保存于本課題組。

1.2 引物設計

根據(jù)用于熒光定量的目的基因CXCR1基因的mRNA序列（GenBank：.NM_001105038）設計引物，內(nèi)參基因β-actin引物亦根據(jù)mRNA序列（GenBank：AY141970）設計。引物由上海生工生物工程有限公司合成（具體見表1）。

表1 熒光定量PCR引物

1.3 奶牛乳腺細胞的感染

當細胞培養(yǎng)密度為60%左右時，分別加入滅活的三種菌落—大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌，在0h、1h、6h、12h、24h檢測CXCR1.mRNA水平。

1.4 RT-PCR

反轉(zhuǎn)錄體系為20μL（反應液在冰上配制）：在0.2mL的PCR管中加入1μg的總RNA，Oligo.dT.引物. 1μL，5×PrimeScriptTM.Buffer.4μL，隨機引物.1μL，PrimeScriptTM.RT.Enzyme.Mix.I.1μL，加Rnase.Free. dH2O至總體積為20μL。

將加好試劑的PCR管瞬時離心后放在PCR儀上進行反應。反轉(zhuǎn)錄條件如下：37℃、15min（反轉(zhuǎn)錄反應）；85℃、5s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應）；所得產(chǎn)物即為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實時熒光定量PCR

表2 CXCR1基因在三種菌種刺激下的相對定量值

采用SYBR.GreenⅠ染料法進行熒光定量，熒光定量PCR體系為20μL：SYBR.Premix.Ex.TaqTM（2×）10μL，上下游引物（10μM）各0.4μL，ROX.Reference. Dye.Ⅱ（50×）0.4μL，cDNA2μL，dH2O.6.8μL，以上步驟均為冰上操作，每個樣本設三個重復。

熒光定量PCR擴增程序：95℃預變性1min；95℃變性30s，60℃退火15s，72℃延伸34s，40個循環(huán)；為分析擴增產(chǎn)物的特異性，PCR擴增結(jié)束后采集多個信息點進行溶解曲線分析，程序為：95℃.15s，60℃. 1min；95℃.15s，60℃.15s。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel、Primer.Premier.5.0、SPSS11.0，軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way.ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著差（LSD）法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義；熒光定量計算采用2-△△CT方法[10].。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取

RNA提取結(jié)果見圖1。由圖1可見，總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢出3條亮帶，從上到下分別為28s、18s和5s，說明提取的RNA完整性良好，無明顯降解，其OD260/OD280在1.8左右，純度較高，可用于后續(xù)試驗。

圖1 細胞中RNA的提取結(jié)果

2.2 CXCR1基因在三種菌落刺激下mRNA的表達變化

圖2 在3種菌落的刺激下CXCR1基因的表達量

奶牛乳腺細胞的CXCR1基因mRNA表達在大腸桿菌刺激下6h、12h達到最高；在金黃色葡萄球菌刺激下12h后達到最高值，在鏈球菌刺激下12h后達到最高，然后迅速下降（表2，圖2）。

3 討論

病原微生物感染是奶牛乳房炎發(fā)病的主要原因，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌與鏈球菌為主要致病菌。由于地域及氣候的原因，各個地區(qū)奶牛乳房炎的發(fā)病率不同。然而從分子水平上發(fā)現(xiàn)，很多與奶牛乳房炎相關的基因與奶牛乳房炎的發(fā)生率密切相關，并發(fā)揮作用。

研究發(fā)現(xiàn)CXCR1信號通路在某種程度上可能促進炎性細胞及腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[11～13]。CXCR1是通過與其配體結(jié)合，激活下游信號通路來調(diào)控炎性及腫瘤細胞的生物學行為。IL-8是CXCR1/2的一個重要配體，研究顯示MKN45細胞能自分泌IL-8。據(jù)報道，在一些腫瘤中IL-8的表達量能影響炎性及腫瘤的生長和侵襲[14,15]。研究顯示在胃炎環(huán)境下，CXCR1及其配體在大多數(shù)的白細胞及胃黏膜細胞上均有表達，幽門螺桿菌（HP）感染會調(diào)節(jié)CXCR1與CXCR2的表達[16]。在急性炎癥反應過程中，趨化因子在氨基葡聚糖作用下聚集至內(nèi)皮細胞表面，通過與表達相應趨化因子受體的白細胞相結(jié)合改變白細胞表面的β2整合蛋白，與ICAM-1、ICAM-2等親和，促進內(nèi)皮細胞釋放大量促炎細胞因子。以往的研究發(fā)現(xiàn)，CXCR1表達于中性粒細胞、單核細胞、肥大細胞、Th1細胞等，然而在奶牛乳腺上皮細胞上的表達尚未發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，奶牛乳腺細胞在三種菌落感染下，CXCR1.mRNA水平在6h后顯著增加。趨化因子受體CXCR1作為奶牛乳房炎進程中的重要參與因素，日益引起重視，然而CXCR1在三種菌落刺激下奶牛乳腺細胞中的表達調(diào)控機理尚不清楚，有待進一步研究。

[1] 曹訪, 唐修君, 陳麗, 等. 奶牛乳房炎研究進展[J].黑龍江動物繁殖, 2006,14(4):13-15.

[2] Gilbert FB, Fromageau A, Lamoureux J, et al. Evaluation of tandem repeats for MLVA typing of Streptococcus uberis isolated from bovine mastitis[J]. BMC Veterinary Research, 2006, 2:33.

[3] 徐敏, 平富強, 陳仕毅, 等. CXCR2基因多態(tài)性與奶牛乳房炎和乳品質(zhì)的關聯(lián)[J]. 遺傳, 2008, 30:463-468.

[4] 官久強,王洪梅,王長法,等. 中國荷斯坦牛白介素8受體基因編碼區(qū)多態(tài)性與乳腺炎的關聯(lián)分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2010, 43(5):1057-1065.

[5] Leyva-Baca I, Schenkel F, Martin J, et al. Polymorphisms in the 5' upstream region of the CXCR1 chemokine receptor gene, and their association with somatic cell score in Holstein cattle in Canada[J]. Journal of Dairy Science, 2008, 91(1):407-417.

[6] Youngerman SM, Saxton AM, Oliver SP, et al. Association of CXCR2 polymorphisms with subclinical and clinical mastitis in dairy cattle[J]. Journal of Dairy Science, 2004, 87(8):2442-2448.

[7] Youngerman SM, Saxton AM, Pighetti GM. Novel single nucleotide polymorphisms and haplotypes within the bovine CXCR2 gene[J]. Immunogenetics, 2004, 56(5):355-359.

[8] Wolf M, Delgado MB, Jones SA, et al. Granulocyte chemotactic protein 2 acts via both IL-8 receptors, CXCR1 and CXCR2[J]. Eur J Immunol, 1998, 28(1):164-170.

[9] Paape M, Mehrzad J, Zhao X, et al. Defense of the bovine mammary gland by polymorpho-nuclear neutrophil leukocytes [J]. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2002, 7(2):109-121.

[10] Watanabe A, Yagi Y, Shiono H, et al. Effects of intramammary infusions of interleukin-8 on milk protein composition and induction of acute-phase protein in cows during mammary involution[J]. Canadian Journal of Veterinary Research, 2008, 72(3):291-296.

[11] Murphy PM. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors[J]. Annual Review of Immunology, 1994, 12: 593-633.

[12] Matsuo Y, Ochi N, Sawai H, et al. CXCL8/IL-8 and CXCL12/ SDF-1 alpha co-operatively promote invasiveness and angiogenesis in pancreatic cancer[J]. International Journal of Cancer, 2009, 124(4):853-861.

[13] Singh S, Sadanandam A, Vamey ML, et al. Small interfering RNA-mediated CXCRl or CXCR2 knock-down inhibits melanoma tumor growth and invasion[J]. Int J Cancer, 2010, 126(2):328-336.

[14] Waugh DJ,Wilson C. The interleukin-S pathway in cancer[J]. Clinical Cancer Research, 2008, 14(21):6735-6741.

[15] Backhed F,Torstensson E,Seguin D, et al. Helicobacter pylori infection induces interleukin-Sreceptor expression in the human gastric epitheliiim[J]. Infection and Immunity, 2003, 71(6):3357-3360.

[16] Schmausser B, Josenhans C, Endrich S, et al. Downregulation of CXCRl and CXCR2 expression on human neutrophils by Helicobacter pylori: a new pathomechanism in H. pylori mfection [J]. Infection and Immunity, 2004, 72(12):6773-6779.

Differentiation of mRNA Expression of CXCR1 Gene in Bovine Mammary Cells under Three Colonies Stimulation

WANG Zhen-zhen1, CHEN Ren-jin1, YANG Zhang-ping2, MAO Yong-jiang2, JI De-jun2
(1.Xuzhou Medical University, Xuzhou 212004; 2. Animal Science and Technology College, Yangzhou University, Yangzhou 225009)

This study was to explore expression changes of CXCR1 gene in bovine mammary gland cells under different colony stimulation. The mRNA level of CXCR1 gene was measured by SYBR Green Real-time PCR. The results showed that the mRNA expression of CXCR1 were sensitive to E.coli, S.aureus.and Streptoc. at the cellur level, and the expression levels were different in each time period. This study takes a foundation for further research on CXCR1 gene expression mechanism and prevention of mastitis in dairy cows.

CXCR1 gene; Real-time PCR; Bovine mammary epithelial cell

S823.3

A

1004-4264（2017）06-0027-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.06.006

2016-12-06

國家自然科學基金（31172171，31372286）；江蘇省自然科學基金（BK20151151）；江蘇省博士后基金；中國博士后基金（2016M590506）。

王珍珍（1982-），女，漢，碩士，助理實驗師，主要從事實驗動物學研究。

楊章平，漢，教授，主要從事動物遺傳資源評價、保護與利用。