李建斌，劉文嬌，王秀革，侯磊，李榮嶺，張汝美，王玲玲，仲躋峰

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心，濟(jì)南 251000；2.山東奧克斯畜牧種業(yè)有限公司，濟(jì)南 251000；3.中國奶業(yè)協(xié)會(huì)，北京 100193；4.泰安市畜牧獸醫(yī)局，泰安 100193）

奶牛β-酪蛋白基因分型及A2型牛群培育技術(shù)研究進(jìn)展

李建斌1,2，劉文嬌3，王秀革2，侯磊4，李榮嶺1，張汝美1，王玲玲2，仲躋峰1

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心，濟(jì)南 251000；2.山東奧克斯畜牧種業(yè)有限公司，濟(jì)南 251000；3.中國奶業(yè)協(xié)會(huì)，北京 100193；4.泰安市畜牧獸醫(yī)局，泰安 100193）

牛乳是重要的營養(yǎng)物質(zhì)，酪蛋白是乳蛋白的主要存在形式。酪蛋白不僅是一種全價(jià)蛋白，而且在工業(yè)方面還有重要的應(yīng)用。A1和A2是奶牛β-酪蛋白的兩種存在形式，其中A2型是野生型。本文從β-酪蛋白的營養(yǎng)作用、分類及特性、β-酪蛋白基因分型方法及A2型牛群培育等方面進(jìn)行了綜述。

奶牛；A2-β-酪蛋白；牛群培育

牛奶不僅營養(yǎng)豐富，而且容易消化吸收、食用方便，人們常稱為“白色血液”，是最理想的天然食品。牛奶中的營養(yǎng)成分非常豐富，一般為每100g牛奶含水分87g，蛋白質(zhì)3.0g，脂肪3.6g，碳水化合物5g，鈣120mg，磷93mg，鐵0.2mg，維生素A.140IU，維生素B1.0.04mg，維生素B2.0.13mg，維生素B3.0.2mg，維生素C.1mg，可提供熱量69Kcal。牛奶中蛋白質(zhì)含有20多種氨基酸，消化率高達(dá)98%；脂肪含有大量的脂溶性維生素，品質(zhì)極優(yōu)，消化率在95%以上；乳糖包括半乳糖和乳糖，是最容易消化吸收的糖類。奶中的礦物質(zhì)和微量元素都是溶解狀態(tài)，而且各種礦物質(zhì)的含量比例，特別是鈣、磷的比例適合人們飲食需要，容易消化吸收。.

1 牛乳酪蛋白的營養(yǎng)價(jià)值及其用途

牛奶中的乳蛋白主要分為酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白和乳鐵蛋白等，含有20多種氨基酸。其中酪蛋白是乳蛋白的主要存在形式，占乳蛋白總量的80%，含有人體必需的8種氨基酸，可以說是一種全價(jià)蛋白質(zhì)。酪蛋白除了其營養(yǎng)功能外，其在消化道中經(jīng)蛋白酶分解后產(chǎn)生的肽段也具有潛在的生物學(xué)活性[1]。研究發(fā)現(xiàn)，酪蛋白酶解后，可分離得到許多生物活性肽，如降血壓肽、抗血栓肽、免疫促進(jìn)肽、促進(jìn)礦物離子吸收肽、抗菌肽等等。此外，酪蛋白具有持水性，在水中能夠形成膠體，利用這一特性，在冰淇淋生產(chǎn)中添加酪蛋白酸鈉，有利于提高脂肪乳化、保濕、改善黏度等。酪蛋白存在著明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，有較好的乳化性和發(fā)泡性，可以作為酒和啤酒的澄清劑及蘋果汁的脫色劑。利用酪蛋白制品的乳化性能，可以用來生產(chǎn)含較高脂類的食品，如生產(chǎn)含80%黃油的噴霧干燥黃油粉。其乳化性還可以應(yīng)用于牙膏、護(hù)手霜等產(chǎn)品中，作為維生素A、B、C的穩(wěn)定劑。

2 牛乳β-酪蛋白的分類及特性

牛乳酪蛋白αs、β、k、γ等四種型，分子量及特性見表1。β-酪蛋白約占乳蛋白總量的24%～28%，已鑒定出β酪蛋白的12種亞型[2]?？筛鶕?jù)相應(yīng)位置氨基酸的變異來確定每一種亞型。按67位氨基酸的突變可分為A1（組氨酸）或A2（脯氨酸）型，其中A2型為野生型，A1型為突變型。有研究表明，A1型奶牛生產(chǎn)的牛奶在消化過程中可以產(chǎn)生β-酪啡肽（BCM-7），BCM-7能夠被人體直接吸收，有報(bào)道稱其可能與孤獨(dú)癥、精神分裂癥、選擇言語困難、多動(dòng)癥、自殘、I型糖尿病、冠心病等非傳染性疾病的發(fā)生有關(guān)[3]。因此，近年對(duì)A2型牛奶及牛群的研究日漸增多。

表1 牛乳酪蛋白分類及特性

3 β-酪蛋白基因及分型方法

β-酪蛋白基因定位于奶牛的第6號(hào)染色體上，DNA序列長度10.388bp，包括9個(gè)外顯子，8個(gè)內(nèi)含子[4]。CAT編碼組氨酸，CCT編碼脯氨酸，由于A-T的突變使得第67位的組氨酸變?yōu)楦彼?。分子生物學(xué)方法可以檢測這一SNP突變，進(jìn)而確定個(gè)體是否攜帶A1或A2等位基因。A1是基因突變的結(jié)果，可能發(fā)生在五千年以前。進(jìn)一步的研究表明，β-酪蛋白基因?yàn)楣诧@性的，也就是說A1A2基因型具有同等的機(jī)會(huì)表達(dá)A1或A2蛋白。

3.1 AS-PCR方法

等位基因特異PCR（Allele.Special.PCR，AS-PCR）方法的基本原理是，PCR過程中引物的延伸是從3'端開始的，所以3'末端的堿基對(duì)引物的延伸來說至關(guān)重要。如果這個(gè)堿基與模板互補(bǔ)，則引物能不間斷延伸，PCR可以正常進(jìn)行，可獲得特定長度擴(kuò)增的條帶。反之亦然。所以只要在3'端設(shè)計(jì)匹配或錯(cuò)配堿基，就可以擴(kuò)增出相應(yīng)的基因片段。Keating.等(2008)基于該方法，設(shè)計(jì)引物對(duì)5'-GCCCAGATGAGAGAAGTGAGG-3'和5'-GATGTTTTGTGG.GAGGCTTTAT/G-3'，PCR擴(kuò)增片段長度為854bp，當(dāng)加入不同特異反向引物（A1或A2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)條帶的有無可以區(qū)分出A1或A2等位基因，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)牛群中A2等位基因的檢測[5]。

3.2 ACRS-PCR方法

創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR（Amplification.created. restriction.site.PCR,.ACRS-PCR）方法的基本原理為：根據(jù)突變位點(diǎn)的堿基變化情況設(shè)計(jì)PCR引物，其中一條引物根據(jù)突變位點(diǎn)鄰近序列設(shè)計(jì)，人為引入錯(cuò)配堿基，使得引物3'端和單堿基突變的一種突變型在PCR.擴(kuò)增后形成一個(gè)酶切位點(diǎn)，其PCR.產(chǎn)物可用類似PCRRFLP方法進(jìn)行分析[6]。該方法是人為引入錯(cuò)配堿基，具有很大的靈活性。.Raies等（2012）成功設(shè)計(jì)了一對(duì)引物5'CCTTCTTTCCAGGATGAACTCCAGG-3'.和5'GA GTAAGAGGAGGGATGTTTTGTGGGAGGCTCT-3'，.進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得121bp片段，由于反向引物3'創(chuàng)造了一個(gè)DdeI酶切位點(diǎn)，A2型個(gè)體PCR產(chǎn)物可被DdeI酶切為86bp和35bp兩個(gè)片段[7]。

3.3 SSCP-PCR方法

單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR（Single.Strand. Conformation.Polymorphism.PCR）是基于DNA構(gòu)象差別來檢測點(diǎn)突變的一種方法。相同長度的單鏈DNA，如果堿基序列不同，形成的構(gòu)象就不同，這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對(duì)等分子內(nèi)相互作用力來維持的。當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或少影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受到的阻力大小不同。因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開。Barroso等（1999）利用該方法實(shí)現(xiàn)了A1或A2等位基因的鑒定[8]。

3.4 Taq Man方法

該方法的基本原理是PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，熒光探針的5'端連接報(bào)告熒光基團(tuán)，3'端連接淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'-3'外切酶活性可將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，進(jìn)而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)突變的檢測。而新型Taq.Man-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP）。這一方法可以高度靈敏地區(qū)分A1或A2型個(gè)體。

3.5 基于檢測BCM-7的方法

從牛奶中分離β-酪蛋白，進(jìn)行胃腸道酶體外消化，進(jìn)而通過液相色譜法分離產(chǎn)生的多態(tài)，通過測序多態(tài)物質(zhì)鑒定BCM-7，進(jìn)而鑒別個(gè)體牛只是否為A1、A2型牛。此外，放射免疫分析(RIA)和酶聯(lián)免疫分析（ELISA)可用于血液或尿液中BCM-7的檢測，如ELISA方法可以檢測尿液中pg水平的BCM-7。目前也有商業(yè)試劑盒如S-1334（由Bachem.公司生產(chǎn)），可以檢測ng水平級(jí)的β-酪蛋白消化物。

4 不同品種牛的酪蛋白基因型頻率

許多研究者鑒定了牛群中A2型β-酪蛋白基因頻率及基因型頻率，不同品種牛的A2基因頻率存在顯著差異。如水牛A2等位基因的頻率100%，瘤牛為98.7%，更賽牛為96%～98%，瑞士褐牛為66%～70%，娟姍牛為50%～63%，荷斯坦牛為44%～53%，愛爾夏牛為40%～49%，丹麥紅牛為23%[2]。

5 A2型牛群選育技術(shù)

基于上述方法，可以很方便地選育牛群。目前國外已有一些公司開始生產(chǎn)和銷售A2品牌的乳制品，其奶源為β-酪蛋白A2型牛群。在我國，山東奧克斯畜牧種業(yè)有限公司利用上述技術(shù)成功地對(duì)23頭種公牛進(jìn)行了鑒定，其中3頭A1A1型，6頭A1A2雜合型，13頭A2A2型（表2）。在所檢測種公牛群體中（23頭），A1等位基因頻率為27.3%，A2型等位基因頻率為72.7%。

鑒別A2型-β-酪蛋白基因技術(shù)是可行的，但國外還未見有生產(chǎn)培育A2型牛群的報(bào)道。這主要是因?yàn)锳1型β-酪蛋白對(duì)人體是否有害還未確定，可能沒必要進(jìn)行牛群的選擇。其實(shí)一些其他食品中的蛋白質(zhì)被人體消化后也會(huì)產(chǎn)生BCM-7，只是產(chǎn)生的量不同，因此，人們可以放心飲用牛奶。

表2 奧克斯鑒定為A2基因純合型個(gè)體的種公牛

[1] 李曉暉.牛乳中酪蛋白的結(jié)構(gòu)特性及其應(yīng)用[J].食品工業(yè),2002,1:29-31.

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S823.3

A

1004-4264（2017）06-0031-03

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.06.007

2017-04-01

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（CXGC2016A04）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程（2016LZGC027）；山東省自然基金面上項(xiàng)目（ZR2016CM37）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（SDAIT-12-011-02）；國家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（CARS-37）。

李建斌（1974-），男，博士，副研究員，主要從事奶牛育種技術(shù)研發(fā)與推廣工作。劉文嬌（1983-），女，博士。兩人為共同第一作者。

仲躋峰，博士，研究員。