王志強，張洪波，張 君*，徐尚榮，彭 巍，楊啟林

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016，2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧 810016)

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初情期母牦牛下丘腦kiss-1/GPR54系統(tǒng)基因克隆

王志強1，張洪波2，張 君2*，徐尚榮2，彭 巍2，楊啟林2

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016，2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧 810016)

應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)和基因克隆技術(shù)，對10頭初情期母牦牛下丘腦kiss-1/GPR54系統(tǒng)基因進行擴增和基因克隆。結(jié)果表明，kiss-1基因拼接后序列全長為291 bp，其中CDS序列長為282 bp，序列中堿基組分為腺嘌呤20.62%，鳥嘌呤27.14%，胸腺嘧啶23.37%，胞嘧啶28.87%。共編碼95個氨基酸，其中丙氨酸占總氨基酸殘基的11.58%，亮氨酸占10.52%，絲氨酸、甘氨酸、脯氨酸各占9.47%。GPR54基因拼接后序列全長為202 bp，其中CDS序列長為196 bp，序列中堿基組分為腺嘌呤16.34%，鳥嘌呤30.69%，胸腺嘧啶17.82%，胞嘧啶35.15%。GPR54基因共編碼66個氨基酸，其中脯氨酸占總氨基酸殘基的13.63%，甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸各占10.60%，半胱氨酸占9.09%。

初情期母牦牛；kiss-1/GPR54系統(tǒng)；基因克隆

親吻素(kisspeptins)是由kiss-1基因編碼的一組多肽激素，與其受體GPR54一起組成kiss-1/GPR54系統(tǒng)[1]，參與下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG)的功能調(diào)控，并在動物初情期啟動和促性腺激素釋放過程中發(fā)揮作用。已有研究表明，下丘腦的kisspeptin與受體GPR54結(jié)合后，激活促性腺激素釋放素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)神經(jīng)元，刺激GnRH釋放，進而促進促卵泡素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)和促黃體素(luteotropic hormone，LH)的釋放，調(diào)節(jié)生殖活動[2-3]。對大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，kiss-1基因表達量隨發(fā)情周期的不同階段發(fā)生變化，其在排卵前顯著升高，注射GnRH拮抗劑可抑制卵巢Kiss-1基因表達，而注射孕馬血清(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)則可恢復(fù)Kiss-1 基因表達；此外，未成年大鼠卵巢上Kiss-1基因表達量極低，而給其注射PMSG和人體絨膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)后在誘導(dǎo)排卵的同時，顯著提高了卵巢上Kiss-1基因的表達量[4]，該結(jié)果說明kiss-1/GPR54系統(tǒng)對在動物發(fā)情周期中起到了調(diào)控作用。而作為哺乳動物初情期啟動的誘導(dǎo)因子，許多動物kiss-1基因和GPR54基因的cDNA序列均被報道，但同源性相差較大，其中，人、魚及牛蛙之間kiss-1基因同源性大于45%，人和刺猬的同源性大于20%。靈長類動物GPR54基因比嚙齒類動物同源性大于80%[5]。說明了kiss-1/GPR54系統(tǒng)在進化過程中序列具有高度的保守性。牦牛屬于季節(jié)性發(fā)情動物，由于受環(huán)境、管理等因素的影響，牦牛群體中普遍存在交配時間短、青年牦牛初情期延遲以及繁殖年齡推遲等現(xiàn)象。之前的研究中大部分針對牦牛的飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)狀況來研究影響牦牛發(fā)情的主要因素，而很少有從基因角度對牦牛繁殖進行探究，本試驗基于kiss-1/GPR54系統(tǒng)在動物生殖過程中的啟動作用，利用PCR、基因克隆技術(shù)，從基因同源性、氨基酸含量的角度分析牦牛kiss-1/GPR54系統(tǒng)基因差異，為解決牦牛繁殖率低的問題積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物和材料 通過直腸檢查和稱量體重，于2015年9月在海晏縣家庭牧場中采集初情期母牦牛10頭。母牦牛宰殺后，立即采集下丘腦組織，經(jīng)生理鹽水、750 mL/L酒精、DEPC水沖洗后，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器 微波爐,廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司產(chǎn)品，型號：G70F20N3P-N3P(WO)；高壓蒸汽滅菌器，松下健康醫(yī)療器械株式會社產(chǎn)品，型號：MLS-3751L-PC；PS300B電泳儀，Hoefer公司產(chǎn)品，型號：DYY-8D；普通PCR儀，Biosystem產(chǎn)品；超純水儀，德國默克集團 Milli-Q產(chǎn)品；凝膠成像儀，天美(中國)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品，型號P/N97-0490-02；核酸蛋白儀，Thermo公司產(chǎn)品，型號Nanodrop 2000c；電冰箱，海爾公司產(chǎn)品，型號BCD-192KAZMD；振蕩器，SciLOGEX產(chǎn)品，型號MX-F；電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品，型號：LE204E102；離心機，Eppendorf產(chǎn)品,型號5424R。

1.1.3 主要試劑 總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR欲混試劑、膠回收試劑盒、DNA Marker、DH5α感受態(tài)細胞，北京天根生物有限公司產(chǎn)品；QX Separation buffer、QX DNA Dilution buffer、QX Wash buffer、QX mineral Oil、QX Ailgnment Marker (15 bp/1 kb)、QX Intensity Calibration Marker、QX size Marker(50 bp～80 bp)，凱杰生物有限公司產(chǎn)品；pMDTM19-T Vector Cloning Kit，TaKaRa(日本)產(chǎn)品；TBE緩沖液，莊盟生物產(chǎn)品；瓊脂糖，Biowest Agarose公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第1鏈合成

1.2.1.1 總RNA提取 根據(jù)試劑盒說明書進行，將提取后的RNA取5 μL經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓：110V，時間：20 min。

1.2.1.2 cDNA第1鏈合成根據(jù)試劑盒說明書進行操作 其中cDNA第1鏈合成中g(shù)DNA去除反應(yīng)體系為：5×g DNA buffer:2 μL，Total RNA:2 μL，RNase-Free ddH2O:6 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：10×Fast RT buffer:2 μL，RT Enzyme Mix:1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix:2 μL，RNase-Free ddH2O:5 μL。將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的Mix，加到gDNA去除步驟的反應(yīng)液中，充分混勻后置于PCR儀中42℃，孵育15 min。95℃，孵育3 min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后續(xù)試驗，或低溫保存。

1.2.2 PCR擴增與膠回收

1.2.2.1 PCR擴增引物 根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)查詢綿羊kiss-1及普通牛GPR54基因的mRNA序列(EU272411.1、XM 867473.4)設(shè)計PCR擴增引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.2.2 PCR反應(yīng)體系 反應(yīng)體系為25 μL，其中：模板：3 μL，上、下游引物各1 μL，2×TapMix:13 μL，ddH2O:7 μL；PCR擴增反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 30 s，59.8℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 5 min，4℃保存，反應(yīng)為35個循環(huán)。

1.2.2.3 PCR產(chǎn)物檢測 取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/ L瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓：110 V，時間：20 min。

表1 PCR擴增引物序列

1.2.3 膠回收 根據(jù)試劑盒說明書進行操作，將膠回收產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 連接、轉(zhuǎn)化 (1)將Vector、InsertDNA、SolutionI冰上解凍。

(2)分別取Insert DNA 2 μL,Solution Ⅰ 2.5 μL,Vector 0.5 μL,加到微量離心管中。

(3)將微量離心管放在PCR儀中，16℃孵育1 h。

(4)將感受態(tài)細胞取出，冰上解凍至半溶化狀態(tài)，立即將感受態(tài)細胞滴加到離心管中，每管滴加60 μL后冰上放置30 min。

(5)立即取出放置42℃水浴鍋中放置90 s后取出冰上放置30 min。

(6)42℃水浴鍋中水浴90 s后冰上放置2.5 min。

(7)將微量離心管內(nèi)容物全部轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌離心管中的690 μL液體培養(yǎng)基中。

(8)將離心管固定在搖床上，37℃振蕩培養(yǎng)1 h。

(9)在含AMP的固體培養(yǎng)基上，分別涂布40 μL X-gal溶液和8 μL IPTG溶液，通風(fēng)干燥5 min后將離心管在冷凍離心機中4℃、12 000 r/min離心3 min。

(10)棄上清液，將菌液均勻涂布到對應(yīng)的平板上，通風(fēng)干燥5 min。

(11)封口膜封口平板，37℃溫箱中過夜。

(12)準備幾管LB液體培養(yǎng)基，每管各1 mL(每mL液體培養(yǎng)基中加入2 μL 50 mg/mL的AMP)。

(13)用無菌槍頭挑取單個陽性菌落(白斑)，加入液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)12 h，然后室溫保存。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 Primer5.0用于PCR擴增引物設(shè)計，DNA Man用于同源性對比以及氨基酸序列翻譯。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)情期母牦牛下丘腦總RNA提取

結(jié)果顯示，在28 s和18 s處有兩條明顯的條帶，并且利用核酸蛋白儀檢測OD 260 nm/OD 280 nm，結(jié)果在1.7～2.0之間，在正常范圍內(nèi)，結(jié)果可用(圖1)。

M.DNA標準DL 2 000;1～3.總RNA提取

M.DNA Marker DL 2 000;1-3.The repeat for total RNA extracts

圖1 總RNA提取結(jié)果

Fig.1 The results for total RNA extraction

2.2 PCR擴增結(jié)果

結(jié)果顯示，kiss-1基因目的條帶大小在301 bp，與引物設(shè)計結(jié)果相似。結(jié)果顯示，GPR基因目的條帶大小在230 bp，與引物設(shè)計結(jié)果一致(圖2和圖3)。

2.3 連接、轉(zhuǎn)化結(jié)果

結(jié)果顯示kiss-1基因片段大小約為300 bp左右，GPR54基因片段約為225 bp左右，該結(jié)果與PCR擴增結(jié)果基本一致(圖4)。

2.4 kiss-1基因CDS序列及其編碼的氨基酸序列

拼接kiss-1基因5′端及3′端測序結(jié)果，拼接后序列全長為291 bp，其中CDS序列長為282 bp，CDS序列中堿基組分為：腺嘌呤20.62%,鳥嘌呤27.14%,胸腺嘧啶23.37%,胞嘧啶28.87%。Kiss-1基因共編碼95個氨基酸，其中丙氨酸占總氨基酸殘基的11.58%,亮氨酸占10.52%,絲氨酸、甘氨酸、脯氨酸各占9.47%(圖5)。

M.DNA標準DL 1 000;1～10.10頭牦牛kiss-1基因M.DNA Marker DL 1 000;1-10.Ten female yak kiss-1 gene

M.DNA標準DL 1 000;1～10.10頭牦牛GPR54基因M.DNA Marker DL 1 000;1-10.Ten female yak GPR54 gene

M.DNA標準DL 500;1～3.牦牛kiss-1基因; 4～6.牦牛GPR54基因

M.DNA Marker DL 500;1-3. Yak kiss-1 gene; 4-6.Yak kiss-1 gene

圖4 初情期母牦牛kiss-1和GPR54基因克隆電泳圖

Fig.4 The gene clone electrophoresis result of estrus female yak kiss-1 and GPR54 genes

2.5 GPR54基因CDS序列及其編碼的氨基酸序列

拼接GPR54基因5′端及3′端測序結(jié)果，拼接后序列全長為202 bp，其中CDS序列長為196 bp，CDS序列中堿基組分為：腺嘌呤16.34%,鳥嘌呤30.69%,胸腺嘧啶17.82%,胞嘧啶35.15%。GPR54基因共編碼66個氨基酸，其中脯氨酸占總氨基酸殘基的13.63%,甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸各占10.60%,半胱氨酸占9.09%(圖6)。

3 討論

3.1 初情期母牦牛kiss-1/GPR54基因同源性比較

荀文娟等[6]在Kiss-1/GPR54系統(tǒng)在不同發(fā)育階段五指山豬下丘腦中的表達中發(fā)現(xiàn)五指山豬Kiss-1基因序列長度為179 bp、GPR54基因序列長度為115 bp。王雪松等[7]在Kiss-1/GPR54系統(tǒng)在雄性大鼠生殖軸系功能研究中發(fā)現(xiàn)Kiss-1基因長度為151 bp、GPR54為371 bp。研究結(jié)果與本研究獲得的PCR產(chǎn)物大小相似。而張強等[8]在研究黑線倉鼠Kiss-1/GPR54系統(tǒng)在季節(jié)性繁殖與光周期調(diào)控中的作用中測出優(yōu)化后的PCR策略拼接得到的Kiss-1序列為558 bp 。李卓昭[9]對梅山豬和LY母豬Kiss-1基因測序發(fā)現(xiàn)，Kiss-1基因序列總長為478 bp，GPR54基因為115 bp。而本試驗中kiss-1基因測序總長度為299 bp，GPR54基因序列總長度為225 bp，上述結(jié)果均與本試驗存在差異可能是不同動物種間存在差異所引起的。通過對同源性比較發(fā)現(xiàn)，本研究kiss-1序列與牛屬、羊?qū)賱游锏耐葱跃鶠?00%(XM-867473.4、CP01187.1)，而GPR54序列與牛屬動物的同源性為98%(GO289736.1)，與羊?qū)賱游锏耐葱詾?4%(GO142846.1)，該結(jié)果與劉興延等[10]對kisspeptin/GPR54系統(tǒng)與脊椎動物生殖的研究綜述對比發(fā)現(xiàn)，牦牛、牛、羊的GPR54基因同源性與嚙齒類、靈長類動物同源性較高，在80%左右，而與kiss-1基因同源性較低，該結(jié)果既表明GPR54基因在動物進化過程中高度的保守性，同時也推測影響青年牦牛初情期啟動主要是由GPR54基因介導(dǎo)完成的。

圖5 kiss-1基因核苷酸序列及其編碼的蛋白氨基酸序列

3.2 初情期母牦牛kiss-1基因編碼氨基酸序列比較

人類的kiss-1基因位于染色體lq32-41區(qū)域由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，前2個外顯子不翻譯，第3個外顯子是由38個非編碼堿基對構(gòu)成，后接轉(zhuǎn)錄起始位點和其余103個編碼堿基對，第4個外顯子中包含332 個編碼堿基對、終止子和多腺苷酸化信號[11]。李卓昭[9]研究發(fā)現(xiàn)豬kiss-1基因全序列長度為860 bp，編碼區(qū)長為417 bp(302-318)，CDS區(qū)長度為478 bp，而本試驗結(jié)果顯示牦牛kiss-1基因序列全長為291 bp，其中CDS序列長為282 bp，CDS序列中堿基組分為：腺嘌呤20.62%,鳥嘌呤27.14%,胸腺嘧啶23.37%，胞嘧啶28.87%。共編碼95個氨基酸，其中丙氨酸占總氨基酸殘基的11.58%，亮氨酸占10.52%，絲氨酸、甘氨酸、脯氨酸各占9.47%。產(chǎn)生差異的主要原因是由于物種之間的差異所引起。Kiss-1的主要作用為，根據(jù)其水解后氨基酸鏈長度的不同可以分為Kisspeptin-54、Kisspeptin-14、Kisspeptin-13、Kisspeptin-10，統(tǒng)稱為Kisspeptins，且這些片段的生物學(xué)功能和活性相似，結(jié)合受體后能發(fā)揮的主要生物學(xué)作用包括激活凝脂酶C，促進磷脂酰肌醇二磷酸水解，鈣離子的動員，釋放花生四烯酸，活化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2和p38激酶，形成張力絲，抑制細胞增殖等[12]。已有研究表明，給大鼠和人注射不同的 Kisspeptins 后均能提高LH和睪酮的分泌水平。因此推斷，kiss-1基因可以明顯促進動物生殖激素的分泌，從而調(diào)節(jié)后續(xù)的生殖過程。

圖6 GPR54基因核苷酸序列及其編碼的蛋白氨基酸序列

3.3 初情期母牦牛GPR54基因編碼序列比較

GPR54(G protein-coupled receptor 54)是Kiss-1蛋白的受體,即GPR54的正常配體是由Kiss-1基因編碼的[13]。直到發(fā)現(xiàn)它與Kisspeptin具有非常高的親和力時才被重視和研究[1]。在2001年，人類GPR54基因被克隆，它包括1 197 bp的開放閱讀框，編碼含398個氨基酸殘基的蛋白，Ishwar S P[14]克隆出羅比魚的GPR54cDNA包含1個開放的閱讀框，包含1 131個堿基對，編碼377個氨基酸。本試驗結(jié)果為GPR54基因序列全長為202 bp，其中CDS序列長為196 bp，CDS序列中堿基組分為腺嘌呤16.34%，鳥嘌呤30.69%，胸腺嘧啶17.82%，胞嘧啶35.15%。共編碼66個氨基酸，其中脯氨酸占總氨基酸殘基的13.63%，甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸各占10.60%，半胱氨酸占9.09%。該結(jié)果與之前研究差異主要原因是由于物種之間的差異所引起的。GPR54作為kisspeptin的特異性受體，對kisspeptin功能的維持起著關(guān)鍵作用。研究表明，GPR54基因敲除會導(dǎo)致kisspeptin不能促進LH的分泌[15]，這說明kisspeptin必須與GPR54結(jié)合后才能發(fā)揮其生物學(xué)作用、并且直接與LH的分泌有關(guān)。GPR54基因突變也可造成人或小鼠的特發(fā)性性腺激素分泌不足引起的興縣機能減退癥(idiopathic hypogonadotropic hypogonadism，IHH)，Cerrato F等[16]在研究沙特阿拉伯的一個工HH患者的家庭時發(fā)現(xiàn)，GPR54基因純合子在第3外顯子由C突變?yōu)門，導(dǎo)致從絲氨酸到亮氨酸的替(L1485);在一個有非洲和美洲血統(tǒng)的工HH患者身上發(fā)現(xiàn)第331個氨基酸上由C突變?yōu)門，導(dǎo)致一個提前出現(xiàn)的終止密碼子(R331X，無義突變)，以及第1 195個核普酸上出現(xiàn)由T到A的突變，導(dǎo)致精氨酸取代了1個終止密碼(X399R，終止密碼突變)。說明，GPR54基因，對于動物發(fā)情調(diào)控起到?jīng)Q定性作用。

Kiss-1/GPR54系統(tǒng)作為哺乳動物初情期啟動的關(guān)鍵，它的分泌直接刺激下丘腦GnRH神經(jīng)元，引起GnRH的分泌及后續(xù)HPG軸的調(diào)控，因此研究Kiss-1/GPR54系統(tǒng)對解決牦牛繁殖率低有積極的作用。本次試驗發(fā)現(xiàn)初情期母牦牛下丘腦kiss-1序列與牛屬、羊?qū)賱游锏南嗨贫染鶠?00%(XM-867473.4、CP01187.1)。而GPR54序列與牛屬動物的同源性為98%(GO289736.1)與羊?qū)賱游锏耐葱詾?4%(GO142846.1)，由此結(jié)果可以推測，kiss-1/GPR54系統(tǒng)中影響青年動物初情期啟動的關(guān)鍵基因是GPR54基因，因為kiss-1基因在親緣性較近的動物中序列相同，而GPR54基因則有一些變化。氨基酸之間的差異目前研究較少，但主要還是與基因序列的差異有明顯的關(guān)系。關(guān)于氨基酸所占比例及基因表達量是否參與激素調(diào)控，有待進一步研究。

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Hypothalamus Kiss-1/GPR54 System Gene Clone For Purberal Female Yaks

WANG Zhi-qiang1,ZHANG Hong-bo2,ZHANG Jun2, XU Shang-rong2,PENG Wei2,YANG Qi-lin2

(1.AcademyofAgricultureandAnimalHuabandry,QinghaiUniversity,Xining,Qinghai,810016,China; 2.QinghaiAcademyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,QinghaiUniversity,Xining,Qinghai,810016,China)

The aim of the study was to detect hypothalamus kiss-1/GPR54 gene in ten purberal female yaks by using PCR and gene cloning techniques.The result indicated that,kiss-1 gene sequence was 291 bp,CDS was 282 bp,CDS base components were adenine 20.62%,guanine 27.14%,thymine 23.37%,cytosine 28.87%.95 amino acids were coded,alanine accounted 11.58% for total amino acids,leucine 10.52%,serine,glycine and proline 9.47%.GPR54 gene was 202 bp,CDS was 196 bp,CDS base components were adenine 16.34%,guanine30.69%,thymine 17.82%,cytosine 35.15%. 66 amino acids were coded,proline accounted 13.63% for total amino acids,glycine,serine and adenine 10.60%,serine,cysteine 9.09%.

purberal female yak; kiss-1/GPR54 system; gene clone

2016-11-14

青海省科技廳項目(2012-N-A5)

王志強(1991-)，男， 青海西寧人，碩士研究生，主要從事高原畜禽生理研究。*通訊作者

R363;S823.85

A

1007-5038(2017)07-0031-06