張 哲，楊 峰，李新圃，羅金印，劉龍海，李宏勝*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

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無乳鏈球菌莢膜多糖的粗提及多糖含量測定條件優(yōu)化

張 哲1,2，楊 峰1，李新圃1，羅金印1，劉龍海1，李宏勝1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

為提取無乳鏈球菌莢膜多糖，并對苯酚-硫酸法測定多糖含量條件進行優(yōu)化。離心收集發(fā)酵上清液，超濾濃縮，經(jīng)800 mL/L乙醇沉淀提取無乳鏈球菌莢膜多糖；采用單因素試驗對苯酚硫酸法測定條件進行優(yōu)化，并對測定方法的可靠性進行驗證。結(jié)果表明，從1 L發(fā)酵液中提取到含量為38.51%的莢膜多糖0.36 g；測定的最佳條件為：2 mL樣品液中，加入1 mL 50 mL/L的苯酚，5 mL濃硫酸，混勻后80 ℃作用20 min，在1.5 h內(nèi)測定485 nm處的光密度。在該條件下，平均加樣回收率為99.96%，相對標準偏差為0.40%。說明從無乳鏈球菌發(fā)酵上清液中成功提取到莢膜多糖，建立了苯酚硫酸法測定莢膜多糖的最優(yōu)條件。

無乳鏈球菌；莢膜多糖；苯酚-硫酸法

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)為革蘭陽性球菌，于1887年在患乳腺炎的牛中被首次分離而得名,屬于Lancefield血清學(xué)分類中的B群，因此在人醫(yī)臨床上又被稱為B群/族鏈球菌(Group BStreptococcus,GBS)[1-2]。GBS可引起新生兒腦膜炎、肺炎及敗血癥等，對老人、孕婦等其他免疫功能低下的人群是一個潛在的威脅，還可感染豬、牛及魚等多種動物[3-4]。此外，部分血清型的牛源、魚源及人源GBS能夠交叉感染，對人類的健康構(gòu)成了巨大的威脅[5]。在GBS感染機體的過程中，莢膜多糖、β-溶血素及CAMP因子等毒力因子起著重要作用[6]。其中，莢膜多糖是一種存在于細菌細胞壁外，由cps A基因編碼的富含唾液酸的多糖，有助于細菌黏附于宿主細胞表面，保護細菌免受抑菌或殺菌物質(zhì)的侵害以及宿主吞噬細胞的吞噬，是GBS最重要的毒力因子[7]。同時，莢膜多糖還是細菌結(jié)構(gòu)變化最少的表面抗原之一，具有良好的免疫原性，是最適宜做疫苗的靶抗原之一[8-9]。為提高疫苗的免疫效果，一般要對提取的莢膜多糖進行純化，而多糖含量的測定，是檢測多糖純度的重要手段[10]。

本研究擬采用乙醇沉淀法從GBS發(fā)酵液中提取莢膜多糖，并對苯酚-硫酸法測定莢膜多糖含量的試驗條件(如測定波長、苯酚用量及顯色溫度等)進行優(yōu)化，旨在探究莢膜多糖含量測定的最佳條件，為莢膜多糖的提取、純化研究及莢膜多糖疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 無乳鏈球菌(M19)，為本實驗室前期從奶牛乳房炎奶樣中分離、鑒定并凍存的菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基 血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基(批號：3102396)、營養(yǎng)瓊脂(批號：3101694)、營養(yǎng)肉湯(批號：3102303)，為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；THB液體培養(yǎng)基為本實驗室配置，并添加有10 g/L的葡萄糖。

1.1.3 主要儀器 紫外可見分光光度計，水浴鍋，全溫振蕩培養(yǎng)箱，10kD超濾膜包(Sartorius)，離心機和凍干機等。

1.2 方法

1.2.1 GBS莢膜多糖的粗提和多糖樣品液的制備 將凍存的無乳鏈球菌M19菌種接種到瓊脂平板上，復(fù)蘇3代后接種到營養(yǎng)肉湯，37 ℃培養(yǎng)12 h，經(jīng)涂片鏡檢純粹后，以1%的接種量分別接種于THB液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)10 h(37 ℃、120 r/min)。期間每隔2 h，用滅菌NaOH溶液(2 mol/L)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的酸堿度，保持pH在7.2左右。

將培養(yǎng)好的發(fā)酵液離心收集上清(4℃，4 000 r/min，20 min)，并用0.22 μm濾膜過濾除菌，濾過液經(jīng)10 kD的超流濾設(shè)備濃縮10倍，向濃縮液中加入無菌蒸餾水至原體積，再次超濾濃縮，如此重復(fù)3次；在濃縮液中加入至終體積比為250 mL/L的無水乙醇，4 ℃作用12 h后離心去除沉淀，收集上清液；往上清液中加入無水乙醇至終體積變?yōu)?00 mL/L，混勻后4 ℃靜置24 h，4 ℃離心1 h，收集多糖沉淀；用無水乙醇及丙酮各洗滌兩次，真空冷凍干燥，即得粗提莢膜多糖制品。

精密量取凍干多糖樣品100 mg，蒸餾水定容至100 mL；取上述溶液20 mL，再次用蒸餾水定容至100 mL，即為0.2 mg/mL樣品液。

1.2.2 顯色條件優(yōu)化

1.2.2.1 最佳測定波長的確定 分別吸取1 mL葡萄糖標準液(0.1 mg/mL)和多糖樣品液(0.2 mg/mL)，蒸餾水補足至2 mL，并以2 mL蒸餾水做空白對照，再分別加入5%的苯酚0.5 mL和濃硫酸5 mL，混合均勻后，沸水浴顯色10 min，在400 nm～600 nm波長范圍掃描，確定最佳測定波長。

1.2.2.2 單因素試驗 影響苯酚-硫酸法測定結(jié)果的主要因素有顯色溫度、顯色時間、苯酚用量及硫酸用量。因此，本試驗在不同的顯色溫度(4、30、60、80、100 ℃)、顯色時間(0、10、20、30、60 min)、苯酚用量(0.5、1、1.5、2 mL)及硫酸用量(3、4、5、6、7 mL)的條件下，分別進行單因素試驗，測定光密度。

1.2.3 標準曲線的繪制 取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL葡萄糖標準液，以蒸餾水補足至2 mL，按1.2.2.1中優(yōu)化后條件測定光密度。即依次加入1 mL 50 mL/L的苯酚，5 mL濃硫酸，混勻，80 ℃作用20 min后測定485 nm處的光密度。以葡萄糖濃度(C)為橫坐標,光密度值(OD)為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 方法學(xué)考察 為檢測該試驗建立莢膜多糖測定方法的準確性及可靠性，參照文獻[11]，對該方法的精密度、穩(wěn)定性及加樣回收率分別進行了測定，并計算相對標準偏差(RSD)。1.2.5 多糖含量的測定 取制備好的多糖樣品液1 mL，加水補至2 ml，以2 ml蒸餾水做空白對照，按1.2.2.2中所述方法測定樣品液的光密度(做3個重復(fù)，取平均值)，代入標準曲線方程計算多糖濃度，并按照下述公式[12]計算樣品中的莢膜多糖的含量。

多糖含量(%)=0.9×C×D/m，其中C為樣品液中單糖濃度，D為樣品液的稀釋倍數(shù)，m為樣品液中多糖質(zhì)量，0.9為葡萄糖換算成多糖的校正系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 GBS莢膜多糖的粗提

1 LGBS發(fā)酵液經(jīng)處理后，真空凍干得到0.36 g粗提莢膜多糖。

2.2 最佳測定波長的選擇

以蒸餾水為空白對照，葡萄糖標準液及多糖樣品液經(jīng)顯色處理后，在400 nm～600 nm波長范圍掃描結(jié)果如圖1所示。對圖譜進行綜合分析，選定最佳測定波長為485 nm。

圖1 最佳測定波長的選擇

2.3 單因素試驗

2.3.1 顯色溫度 吸取1 mL多糖樣品液，加蒸餾

水補足至2 mL，并以2 mL蒸餾水做空白對照，再分別加入50 g/L的苯酚0.5 mL和濃硫酸5 mL，混合均勻后分別于4、30、60、80、100 ℃顯色10 min，測定OD值。結(jié)果如圖2A所示，80 ℃為最佳顯色溫度。

2.3.2 顯色時間 吸取1 mL多糖樣品液，加蒸餾水補足至2 mL，并以2 mL蒸餾水做空白對照，再分別加入50 g/L的苯酚0.5 mL和濃硫酸5 mL，混合均勻后于80 ℃情況下顯色0、10、20、30 min后，測定OD值。結(jié)果如圖2B所示，20 min為最佳顯色時間。

2.3.3 苯酚用量 吸取1 mL多糖樣品液，加蒸餾水補足至2 mL，并以2 mL蒸餾水做空白對照，再分別加入50 g/L的苯酚0.5、1、1.5、2 mL和濃硫酸5 mL，混合均勻后于80℃情況下顯色20 min，測定OD值。結(jié)果如圖2C所示，1 mL為最佳苯酚用量。

2.3.4 硫酸用量 吸取1 mL多糖樣品液，加蒸餾水補足至2 mL 并以2 mL蒸餾水做空白對照，再分別加入50 g/L的苯酚1 mL和濃硫酸3、4、5、6、7 mL，混合均勻后于80 ℃情況下顯色20 min，測定OD值。結(jié)果如圖2D所示，5 mL為最佳硫酸用量。

A.溫度；B.時間；C.苯酚;D.硫酸A.Temperature;B.Time;C.Phenol;D.Sulfuric acid

2.4 標準曲線的繪制

以葡萄糖濃度為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線(圖3)，求得回歸方程為：OD=13.435*C-0.040 91(其中，OD為光密度值，C為多糖濃度)，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 58。表明葡萄糖濃度在0.01 mg/mL～0.08 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 取多糖樣品液1 mL，按1.2.2.2所述操作處理，連續(xù)測定6次，光密度分別為0.531、0.540、0.535、0.541、0.531、0.536，RSD=0.798%(n=6)。

圖3 葡萄糖標準曲線

2.5.2 重復(fù)性試驗 精密稱取6份凍干多糖樣品各20 mg，分別用蒸餾水定容至100 mL，得0.2 mg/mL樣品液。各取樣品液1 mL，按1.4所述操作處理，測得光密度值為0.491、0.529、0.503、0.526、0.541、0.495，RSD=3.994%(n=6)。

2.5.3 穩(wěn)定性 取多糖樣品液1 mL，按1.2.2.2所述操作處理，并于第0、10、20、30、60、90 min測定光密度，測得光密度值分別為0.529、0.530、0.528、0.531、0.531、0.529，RSD=0.229%(n=6)。

2.5.4 加樣回收率 取1 mL多糖樣品液6份，分別加入葡萄糖標準液各1 mL，按1./2.2.2所述操作進行處理并測定光密度，計算加樣回收率(表1)。由表1可知，平均相對標準偏差RSD=0.401% (n=6)，平均加樣回收率為99.96%。

表1 多糖加樣回收率

2.6 莢膜多糖含量測定

測得樣品液光密度為0.534，代入回歸方程，求得單糖含量為0.0428 mg/mL，帶入多糖含量計算公式，得出多糖含量為38.51%。

3 討論

莢膜多糖是GBS生長過程中合成的一種胞外多糖，常附著與菌體的細胞壁上，在振蕩培養(yǎng)或離心的條件下，往往從菌體脫離，釋放到發(fā)酵液中。因此，本試驗采用成本低，處理量大的有機溶劑(乙醇)沉淀法，從GBS發(fā)酵上清液中提取莢膜多糖。最終，從1 L發(fā)酵上清液中，提取到含量為38.51%的粗提莢膜多糖0.36 g。楊育芳[12]曾采用相同的方法，從人源GBS發(fā)酵液中提取莢膜多糖，并對多糖進行純化，最終得率為0.021 g/L～0.027 g/L。然而，文中未對粗糖得率進行說明，本試驗提取的粗糖精制后的得率能有多少，還需進一步的試驗驗證。

多糖物質(zhì)的含糖量測定，一直是多糖研究中的一個重要問題。目前，對于多糖的測定，主要有比色法(苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等)、滴定法(間接碘量法)、高效液相色譜法、薄層掃描法及高效毛細管電泳法等。在上述幾種方法中以比色法(苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法)最為常用[13]，該類方法是利用多糖在濃硫酸的作用下水解生成的單糖迅速脫水變?yōu)樘侨┭苌?，后者再與苯酚或蒽酮縮合成的有色化合物，在一定范圍內(nèi)，其光密度與糖濃度呈線性相關(guān)，來測定樣品中多糖的含量。因不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因單糖類種類的不同造成誤差。相比而言，苯酚-硫酸法具有試驗操作步驟少，穩(wěn)定性好及所用儀器簡單等優(yōu)勢被廣泛用于測定多糖含量[14]。

特別需要注意的是在苯酚-硫酸法測定多糖樣品時，應(yīng)對樣品進行預(yù)處理，以消除樣品中原有單糖的干擾。為此，本試驗采用10 kD超濾膜，經(jīng)3次超濾去除液體培養(yǎng)基中原有的單糖。此外，在測得單糖含量后，計算多糖含量時，需乘以多糖換算因子(f=W/m，其中W為稱取多糖的質(zhì)量，m為測得單糖的質(zhì)量)。多糖水解為單糖時吸收了部分水。因此，從理論上來說，換算因子f應(yīng)該小于1。然而，邸明磊等[15]測得苦豆子多糖的換算因子為1.22，南瓜籽多糖的換算因子更是達到了10.75[16]。這可能是因為待測多糖中含有較多的雜質(zhì)，使得檢測結(jié)果偏高。由于我們尚未對提取的粗糖進行純化，也未能購買到相應(yīng)的純品，本試驗沒有對多糖的轉(zhuǎn)換因子進行測定，而采用文獻[12]報道的0.9作為GBS莢膜多糖的轉(zhuǎn)換因子。

本試驗對無乳鏈球菌M19進行發(fā)酵培養(yǎng)，離心收集上清液，10 kD超濾膜超濾濃縮，用乙醇沉淀多糖，經(jīng)真空凍干，從1 L發(fā)酵液中提取到含量為38.51%的GBS莢膜多糖0.36 g。表明該方法可行，為莢膜多糖疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。已報到的大部分文獻在使用苯酚-硫酸法測定多糖含量時，多采用沸水浴加熱，并在490 nm處測定光密度，經(jīng)過我們的優(yōu)化，最終確定測定莢膜多糖的最佳操作條件為：在2 mL待測樣品液中，依次加入1 mL 5 g/L苯酚，5 mL濃硫酸，混勻后80 ℃作用20 min，在1.5 h內(nèi)測定485 nm處的光密度。通過測定該方法的精密度(RSD=0.798%)、重復(fù)性(RSD=3.994%)、穩(wěn)定性(RSD=0.229%)及加樣回收率(99.37%～100.56%，RSD=0.401%)，表明該方法操作簡單，快速、準確，條件易于掌握，所需儀器、藥品價格低廉，可以在常規(guī)試驗條件實施，適用于莢膜多糖含量的測定，具有一定的參考與推廣價值。

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Optimization for Extraction and Content Determination of Capsular Polysaccharide fromStreptococcusagalactiae

ZHANG Zhe1,2，YANG Feng1，LI Xin-pu1，LUO Jin-yin1，LIU long-hai1，LI Hong-sheng1

(1.KeyLaboratoryofNewAnimalDrugProjectofGansuProvince,KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceuticalDiscovery，MinistryofAgriculture,LanzhouInstituteofAnimalHusbandryandPharmaceuticalSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Lanzhou,Gansu,730050,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu,730070,China)

This study was aimed to isolate capsular polysaccharide fromStreptococcusagalactiae,and to establish optimal conditions for determination of capsular polysaccharide (CP).Bacterial cells were removed by centrifugation,and the culture fluid was concentrated over ultrafiltration system.Crude CP was precipitated by bringing the solution to a concentration of 800 gL/L ethanol.Single factor test was preformed to investigate optimal conditions of phenol-sulfuric acid method,and reliability of the method was also evaluated.The results showed that 0.36 g crude polysaccharide was isolated from one liter broth ofS.agalactiae,and the polysaccharide content was 38.51%.The optimal conditions for determination of CP was established:add 1 mL 50 mL/L phenol solution into 2 mL polysaccharide solution; then 5 mL sulfuric acid was added,and incubated for 20 min at 80 ℃; All tubes were allowed to cool down to room temperature before reading the absorbances at 485 nm.Under the optimal conditions,the average recoveries of the method was 99.96%,the relative standard deviation was 0.40%.S.agalactiaeCP was isolated from culture supernatant,and the optimal conditions for determination of CP was established.

Streptococcusagalactiae; capsular polysaccharide; phenol-sulfuric acid method

2016-11-01

“十三五”國家重點研發(fā)項目(2017YFD0502201)；甘肅省科技支撐計劃項目(144NKCA240)；甘肅省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目(GNCX-2013-59)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛疾病研究創(chuàng)新工程項目(CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-03)

張 哲(1990- )，男，河南商丘人，碩士研究生，主要從事奶牛乳房炎疫苗研究。*通訊作者

Q93;S852.611

A

1007-5038(2017)07-0041-05