韋嬪 譚艾娟 呂世明 王學(xué)君

摘要：為了解黃連、金銀花、艾葉、魚腥草和五倍子5種中藥對(duì)豬源致病性大腸桿菌的抑菌效果以及對(duì)慶大霉素耐藥性的消除情況，采用試管二倍稀釋法測(cè)定5種中藥的最小抑菌濃度，通過影印培養(yǎng)法篩選出耐藥性消除菌落并計(jì)算其消除率。結(jié)果表明，除魚腥草外，黃連、金銀花、艾葉、五倍子表現(xiàn)出明顯的抑菌效果，亞抑菌濃度的黃連、金銀花、艾葉、五倍子作用24 h后對(duì)致病性大腸桿菌慶大霉素耐藥性的消除率分別為5.34%、2.67%、10.01%、12.53%；作用 48 h 后其消除率分別為7.27%、3.47%、10.93%、13.68%。黃連、金銀花、艾葉和五倍子能消除致病性大腸桿菌對(duì)慶大霉素的耐藥性。

關(guān)鍵詞：中藥；致病性大腸桿菌；耐藥性；消除

中圖分類號(hào)： S852.61+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）11-0127-02[HS）][HT9.SS]

致病性大腸桿菌是獸醫(yī)臨床感染中最常見的病原菌之一，每年因其引起的疾病給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為防治疾病，許多養(yǎng)殖場(chǎng)廣泛且不規(guī)范地使用抗菌藥物，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥問題越來越嚴(yán)重，最后不得不通過加大用藥劑量、增加藥物種類來治療大腸桿菌病，從而陷入“應(yīng)用抗菌藥物→耐藥→加大劑量和種類→高度耐藥和多重耐藥→治療無效和殘留增加”的惡性循環(huán)，最終危及養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和人類健康。因此，[JP+1]如何解決細(xì)菌耐藥性的問題成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，我國中藥資源豐富，已有研究證實(shí)許多中藥具有抗菌作用，且可以降低或消除細(xì)菌耐藥性[1-2]。因此，本試驗(yàn)研究黃連、金銀花等5種常見中藥的抑菌效果以及對(duì)致病性大腸桿菌耐藥性的消除，旨在篩選出對(duì)耐藥致病性大腸桿菌具有強(qiáng)抑菌作用的中藥，為中草藥在臨床上治療由耐藥性致病菌引起的傳染性疾病和進(jìn)一步進(jìn)行中藥逆轉(zhuǎn)[JP]細(xì)菌耐藥性研究提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)藥物及試劑

黃連、金銀花、魚腥草、艾葉、五倍子，購于西安海佳生物科技有限公司?？敲顾兀↘AN）、慶大霉素（GEN）、氧氟沙星（OFL）、環(huán)丙沙星（CIP）、頭孢唑林（CEF）、四環(huán)素（TET）、地美環(huán)素（DMCT）、磺胺嘧啶（SD），購于大連美侖生物技術(shù)有限公司。MH瓊脂、伊紅美蘭瓊脂和LB培養(yǎng)基，均購于上海博微生物科技有限公司；氯化鈉（NaCl），分析純，購于南匯彭德公社營(yíng)房化工廠；十二烷基硫酸鈉（SDS），分析純，購于廣東順德化學(xué)生物研究所。

1.2試驗(yàn)菌株

采樣于貴州省規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)共5株，且經(jīng)鑒定的致病性大腸桿菌EC1、EC2、EC3、EC4、EC5，由貴州大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供。它們對(duì)卡那霉素、慶大霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢唑林、四環(huán)素、地美環(huán)素、磺胺嘧啶8種抗菌藥物的MIC值見表1。大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922，購于中國獸藥監(jiān)察所。

1.3中藥藥液的制備

將黃連、金銀花、魚腥草、艾葉、五倍子5種中藥按劉玉慶等的方法[3]煎煮提取后濃縮藥液，使各藥液中生藥含量均為 1 g/mL，110 ℃滅菌20 min，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4中藥提取液對(duì)致病性大腸桿菌MIC值的測(cè)定

采用改良的肉湯二倍稀釋法[4-5]測(cè)定各中藥藥液對(duì)受試菌的最小抑菌濃度（MIC）。取11個(gè)滅菌離心管并編號(hào)，每管先加入無菌LB肉湯培養(yǎng)基2.0 mL，然后于第1個(gè)離心管加中藥提取液2.0 mL，混勻后取出2.0 mL放入第2個(gè)離心管中，依次類推作倍比稀釋，直至第9個(gè)離心管取出2.0 mL棄去，第10個(gè)離心管不加中藥作為無藥物空白對(duì)照，第11管不加藥物和菌液做空白對(duì)照。取100 μL受試菌稀釋液（菌液濃度為1×106 CFU/mL）分別加至1～10號(hào)離心管內(nèi)，置于 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后用無菌棉拭子分別蘸取各管內(nèi)少量肉湯，涂布在LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃再培養(yǎng)18～24 h。以平板上無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該種中藥對(duì)該菌株的最小抑菌濃度（MIC）。

1.5耐藥性的消除試驗(yàn)

分別制備含中藥的濃度為1/2 MIC的LB肉湯，再分別加入稀釋好的菌液，37 ℃恒溫培養(yǎng)24、48 h，同設(shè)不加藥物的空白組和SDS對(duì)照組；然后再轉(zhuǎn)種分離于LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)待長(zhǎng)出單個(gè)菌落后，隨機(jī)挑取300個(gè)菌落，按照影印培養(yǎng)法[6-7]用無菌牙簽分別對(duì)應(yīng)點(diǎn)種含慶大霉素的MH瓊脂平板及不含藥物的MH瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

[HTK]1.6耐藥性消除子的篩選與鑒定[HT]

挑取在含慶大霉素平板上不生長(zhǎng)且在不含藥物的平板上生長(zhǎng)的菌落，在LB固體培養(yǎng)基上傳代后，再接種于含慶大霉素平板上進(jìn)行檢測(cè)證實(shí)，即為消除子。根據(jù)耐藥性消除菌落數(shù)與檢測(cè)菌落總數(shù)之比，計(jì)算大腸桿菌耐藥性消除率[8]。

2結(jié)果與分析

2.1耐藥性的測(cè)定結(jié)果

在質(zhì)控菌株ATCC25922對(duì)臨床常用的8種抗菌藥物均敏感的情況下，5株致病性大腸桿菌不僅對(duì)GEN耐藥，還對(duì)KAN、TET、CEF、CIP、OFL、DMCT、SD都呈不同程度的耐藥，致病性大腸桿菌的耐藥情況比較嚴(yán)重。

2.3耐藥性消除結(jié)果

由表3可知，5種中藥中五倍子對(duì)菌株耐藥性的平均消除率最高，作用24 h后，平均消除率為12.53%，其最高消除率可達(dá)22.33%；其他中藥的消除率依次是艾葉10.01%、黃連5.34%、金銀花2.67%；五倍子作用48 h后其平均消除率為13.68%，最高消除率可達(dá)24.41%，其他中藥的消除率依次是艾葉10.93%、黃連7.27%、金銀花3.47%，4種中藥對(duì)致病性大腸桿菌慶大霉素耐藥性的消除率均高于SDS對(duì)照組；未經(jīng)藥物處理的空白對(duì)照耐藥菌株的耐藥性自發(fā)消除率為0.00，說明細(xì)菌耐藥性在短時(shí)間內(nèi)自然丟失的概率極低。

3討論

細(xì)菌的耐藥性問題越來越受關(guān)注，本試驗(yàn)選取的5株致病性大腸桿菌對(duì)臨床常用的8種抗菌藥物全部耐藥，這與獸醫(yī)[CM（25]臨床大量不合理使用藥物密切相關(guān)。我國中藥資源豐富血類中藥，五倍子是斂肺澀腸類中藥。本試驗(yàn)中，除魚腥草外，其余4種中藥均有較好的抑菌作用。對(duì)致病性大腸桿菌中藥最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果表明，黃連、金銀花、艾葉和五倍子抑菌效果明顯，但是不同中藥對(duì)同1株細(xì)菌的最小抑菌濃度不同，抑菌效果也不同，這可能與中藥含有的有效成分不同有關(guān)。五倍子、艾葉和黃連對(duì)臨床大腸桿菌抑菌效果較強(qiáng)，這與黃玲等所報(bào)道的結(jié)果[9]一致；金銀花在體外對(duì)致病性大腸桿菌有抑菌作用與陳希文等的報(bào)道[10]一致，卻與劉榮欣等的報(bào)道結(jié)果[11]不同；魚腥草在所配制的500 mg/mL濃度下無抑菌作用，這與杜銀忠所報(bào)道的結(jié)果[12]一致。目前關(guān)于中藥體外抑菌作用的研究報(bào)道較多，但報(bào)道結(jié)果之間有差異，產(chǎn)生這種差異可能與中藥的產(chǎn)地、采收季節(jié)、提取方法和試驗(yàn)用的菌株等不同有關(guān)。

耐藥性消除試驗(yàn)結(jié)果顯示，五倍子、艾葉、黃連對(duì)臨床致病性大腸桿菌耐藥性具有較高的消除率，金銀花的消除率相對(duì)較低，但均高于SDS對(duì)照組。不同的中藥對(duì)致病性大腸桿菌耐藥性的消除率有很大的差異，五倍子作用48 h后的平均消除率為13.68%，而金銀花為3.47%，這可能是因?yàn)椴煌闹兴幒胁煌挠行б志煞?、各個(gè)中藥成分具有不同的藥理作用的原因。同種中藥對(duì)不同菌株耐藥性消除率也不同，具有較大的波動(dòng)范圍，黃連作用48 h后對(duì)EC1耐藥性的消除率為3.33%，對(duì)EC2卻為11.67%，這可能是由于不同的耐藥菌株其對(duì)抗菌藥物的耐藥機(jī)制不同而引起的差異。對(duì)比中藥作用24、48 h致病性大腸桿菌耐藥性消除率的差異可以看出，作用時(shí)間直接影響著中藥消除耐藥性的效果，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其消除率均有所提高，這是由于中藥作用機(jī)理比較復(fù)雜，中藥所含有的各種成分比較多，作用比較緩慢。陰性對(duì)照組的大腸桿菌耐藥性消除率為0.00%，表明耐藥致病性大腸桿菌其耐藥性短時(shí)間內(nèi)自然丟失的概率極低。許多中草藥具有抑菌或抗菌作用，而且不易產(chǎn)生耐藥性，毒副作用小。因此，篩選開發(fā)出抑菌效果好、耐藥性消除率高的中草藥，對(duì)于控制細(xì)菌耐藥性的傳播與中藥的開發(fā)利用都具有十分重要的意義。但中藥消除細(xì)菌耐藥性的機(jī)制比較復(fù)雜，據(jù)目前報(bào)道主要是通過消除耐藥質(zhì)粒、影響外排泵、影響細(xì)胞膜和細(xì)胞壁

[HT][FL）]

[KH*4D]

等，具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]王思蘆，楊柳，曾中良，等. 中藥消除致病性大腸桿菌耐藥性研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2008，35（10）：79-81.

[2]孟甄，金建玲，劉玉慶，等. 細(xì)菌耐藥性的誘導(dǎo)與消除[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào)，2003，19（9）：1047-1051.

[3]劉玉慶，李曄，車程川，等. 大腸桿菌對(duì)中草藥敏感性試驗(yàn)及其方法研究[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2003，22（1）：3-5.

[4]何湘蓉，王一然，李偉奇，等. 黃芩提取物對(duì)耐藥性金黃色葡萄球菌的體外抑菌和耐藥抑制作用研究[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2012，31（3）：12-14.

[5]楊建江，韓文瑜，杜銳，等. 30種中草藥對(duì)耐藥性豬鏈球菌的抑菌試驗(yàn)[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2004，23（2）：14-16.

[6]徐民俊，田小群，周世寧. 一種改進(jìn)的平板影印工具及其應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2008，48（5）：657-660.

[7]王曉波. 中藥黃連對(duì)耐藥金葡菌抑制作用的研究[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2007（10）：9-10.

[8]肖瀟，李英倫，楊銳. 復(fù)方蒲公英對(duì)金黃色葡萄球菌耐藥質(zhì)粒的體外消除試驗(yàn)[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2010，40（3）：307-311.

[9]黃玲，林居純，馬馳，等. 12種中藥的體外抑菌試驗(yàn)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（6）：50-52.[ZK）]

[10]陳希文，王雄清，郭曉萍，等. 豬致病性大腸桿菌的分離鑒定及對(duì)24種中藥的敏感性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（4）：176-180.

[11]劉榮欣，魯改儒，郭吉勇. 中藥及其組方對(duì)大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（4）：2265-2267.

[12]杜銀忠. 3種中藥對(duì)產(chǎn)酶菌R質(zhì)粒消除作用的研究[J]. 青海大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，27（1）：82-85.