薛梅 周衛(wèi)平

摘要[目的]探討龍牙百合鱗莖總黃酮的最佳提取工藝，并研究其抗氧化活性。[方法]以龍牙百合鱗莖為研究對(duì)象，采用優(yōu)化超聲波法提取總黃酮。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法研究了乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響，并確定其最佳工藝條件，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。[結(jié)果]龍牙百合鱗莖總黃酮的最佳工藝條件如下：提取溫度為30 ℃，乙醇濃度為80%，料液比（g ∶mL）為1∶10，提取時(shí)間為20 min。在此條件下，百合鱗莖總黃酮提取量為（32.236±0.513）mg/g?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，龍牙百合鱗莖總黃酮提取液對(duì)DPPH· 的清除效果優(yōu)于相同濃度的維生素C溶液，且存在顯著差異（P<0.05）。[結(jié)論]該研究可為龍牙百合的綜合開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 龍牙百合鱗莖；總黃酮；超聲波法；抗氧化活性

中圖分類號(hào) S644.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）03-0010-03

Abstract[Objective] To explore the optimum extraction technology of total flavonoids from Longya lilium bulb and study their antioxidant activity.[Method] Taking L.lilium bulb as research object，total flavonoids were extracted from L.lilium bulb by using optimized ultrasonic method.Based on single factor experiment，the effects of ethanol concentration，materialliquid ratio，extraction time and extraction temperature on the extraction quantity of total flavonoids from L.lilium bulb were studied and the optimum extraction technology was confirmed by using orthogonal experiment.And their antioxidant activities of total flavonoids in vitro were studied.[Result] The optimum extraction conditions of total flavonoids from L.lilium bulb were as follows：80% ethanol，solidliquid ratio of 1∶10 （g ∶mL），extraction temperature of 30 ℃，extraction time of 20 min.Under the optimum conditions，the extraction quantity of total flavonoids was （32.236±0.513） mg/g.The results of in vitro antioxidant test showed that the scavenging effects of total flavonoids extract from L.lilium bulb to DPPH· was better than that of vitamin C solution at the same concentration，and there was significant difference（P<0.05）.[Conclusion] The research can provide theoretical basis for the comprehensive exploration and utilization of L.lilium.

Key words Longya lilium bulb；Total flavonoids；Ultrasonic method；Antioxidant activity

龍牙百合（Lilium brownii var.viridulum）為多年生草本植物，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)型食用百合品種之一，主產(chǎn)于四川、湖南、重慶等地[1]。龍牙百合食用部分為鱗莖，且具有多種藥效，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，是衛(wèi)生部首批公布的藥食同源食品[2]。

黃酮類化合物又名生物類黃酮（Bioflavonoids），包括黃酮、異黃酮、黃烷酮、雙黃酮及其甙類，具有廣泛的生理活性，廣泛存在于果蔬和中草藥中。黃酮具有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、提升體內(nèi)抗氧化水平的作用，此外還具有作為防治心腦血管疾病的天然藥物和膳食補(bǔ)充劑開發(fā)的潛力[3]。

目前，關(guān)于植物黃酮提取工藝的研究已經(jīng)涉及多種植物[4-7]，但關(guān)于龍牙百合鱗莖的研究還較少。筆者以龍牙百合鱗莖為研究對(duì)象，通過前期預(yù)試驗(yàn)對(duì)水浴、超聲波、索式3種提取方法和乙醇、甲醇、乙酸乙酯等提取試劑進(jìn)行篩選，確定以超聲輔助為提取方法、乙醇為提取劑，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)篩選出龍牙百合鱗莖總黃酮的最佳提取工藝，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行了研究，旨在為龍牙百合的綜合開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將龍牙百合鱗莖（購(gòu)于重慶江津邱仁平百合種植基地）于60 ℃恒溫烘干后粉碎過60目篩，密封冷藏待用。試驗(yàn)所用藥品均為分析純；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC≥98%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱取5.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于25 mL容量瓶，加70%乙醇至刻度，搖勻，得到0.2 mg/mL蘆丁溶液；精密量取0、1、2、3、4、5、6 mL 0.2 mg/mL蘆丁溶液分別置于25 mL容量瓶中，各加水6 mL，再加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10 mL，加水至刻度，搖勻放置15 min，以不加標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照管為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=10.206x+0.007 5（R2=0.998 9）。

1.2.2 樣品總黃酮的測(cè)定。稱取百合鱗莖粉末2.5 g，經(jīng)抽濾得到提取物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后溶解定容。根據(jù)蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出總黃酮含量。

1.2.3 總黃酮提取條件篩選的單因素試驗(yàn)。

1.2.3.1 超聲溫度的篩選。在料液比（百合鱗莖/乙醇溶液）為1∶40 （g ∶mL，下同）、乙醇濃度為70%、提取時(shí)間為30 min的條件下，比較不同提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）對(duì)龍牙百合鱗莖總黃酮提取量的影響。

1.2.3.2 乙醇濃度的篩選。在料液比為1∶40、提取時(shí)間為30 min、提取溫度為40 ℃的條件下，比較不同乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）對(duì)龍牙百合鱗莖總黃酮提取量的影響。

1.2.3.3 料液比的篩選。在提取溫度為40 ℃、乙醇濃度為80%、提取時(shí)間為30 min的條件下，比較不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）對(duì)龍牙百合鱗莖總黃酮提取量的影響。

1.2.3.4 提取時(shí)間的篩選。在提取溫度為40 ℃、乙醇濃度為80%、料液比為1∶20的條件下，比較不同提取時(shí)間（10、20、30、40、50 min）對(duì)龍牙百合鱗莖總黃酮提取量的影響。

1.2.4 優(yōu)化總黃酮提取條件的正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度（A）、乙醇濃度（B）、料液比（C）、提取時(shí)間（D）為考察因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，具體因素與水平設(shè)計(jì)見表1。通過測(cè)定總黃酮提取量，優(yōu)選最佳提取工藝條件。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果確定最佳提取方法和條件后，同時(shí)做5個(gè)平行樣品，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.6 抗氧化性研究。根據(jù)正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)提取條件提取龍牙百合鱗莖總黃酮，按比例稀釋成不同濃度的百合鱗莖總黃酮溶液，進(jìn)行DPPH·清除能力試驗(yàn)。取稀釋后不同濃度（5.0、6.2、8.4、12.5、25.0 μg/mL）的百合鱗莖提取液2 mL和0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL，加入同一具塞試管中，搖勻后在室溫下密閉靜置30 min，以純?nèi)軇閰⒈?，?17 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算龍牙百合鱗莖黃酮提取液對(duì)DPPH·的清除率。采用同樣的方法，測(cè)定與百合鱗莖總黃酮溶液相同濃度梯度的維生素C溶液對(duì)DPPH·的清除率，作為對(duì)照。按照以下公式計(jì)算DPPH·清除率：DPPH·清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%。式中，A1為加提取液后DPPH·溶液的吸光度，A2為提取液的吸光度，A0為未加提取液時(shí)DPPH溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2003軟件和SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度對(duì)龍牙百合鱗莖總黃酮提取量的影響

從圖1可以看出，在料液比為1∶40、乙醇濃度為70%、提取時(shí)間為30 min的條件下，當(dāng)提取溫度為40 ℃時(shí)，龍牙百合鱗莖的總黃酮提取量最高，與其他提取溫度差異顯著，當(dāng)提取溫度為50～80 ℃時(shí)不存在顯著差異。因此，確定最佳提取溫度為40 ℃。

2.2 乙醇濃度對(duì)龍牙百合鱗莖總黃酮提取量的影響

從圖2可以看出，在料液比為1∶40、提取時(shí)間為30 min、提取溫度為40 ℃的條件下，當(dāng)乙醇濃度為60%～90%時(shí)總黃酮提取量差異不顯著，但均顯著優(yōu)于乙醇濃度為50%時(shí)。當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，龍牙百合鱗莖的總黃酮提取量的標(biāo)準(zhǔn)誤差最小，因此確定最佳乙醇濃度為80%。

2.3 料液比對(duì)龍牙百合鱗莖總黃酮提取量的影響

從圖3可以看出，在提取溫度為40 ℃、乙醇濃度為80%、提取時(shí)間為30 min的條件下，不同料液比對(duì)龍牙百合鱗莖總黃酮提取量無明顯影響。

當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，龍牙百合磷莖總黃酮提取量的標(biāo)準(zhǔn)誤差最小，因此確定最佳料液比為1∶20。

2.4 提取時(shí)間對(duì)龍牙百合鱗莖總黃酮提取量的影響

從圖4可以看出，在提取溫度為40 ℃、乙醇濃度為80%、料液比為1∶20的條件下，當(dāng)提取時(shí)間為20和30 min時(shí)總黃酮提取量較高，說明不同提取時(shí)間對(duì)龍牙百合鱗莖總黃酮提取量有顯著影響（P<0.05）。綜合考慮節(jié)約時(shí)間成本和提取時(shí)間為20 min時(shí)總黃酮提取量標(biāo)準(zhǔn)誤差較小的因素，確定龍牙百合鱗莖總黃酮的最佳提取時(shí)間為20 min。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，提取溫度和乙醇濃度對(duì)龍牙百合鱗莖總黃酮提取量有顯著影響（P<0.05），而其他因素對(duì)總黃酮提取量的影響不顯著。R值越大，說明該因素的水平變動(dòng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越大，4個(gè)因素對(duì)龍牙百合總黃酮提取量的影響從大到小依次為乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間，最優(yōu)水平為A1B2C1D2，即提取溫度為30 ℃，乙醇濃度為80%，料液比為1∶10，提取時(shí)間為20 min，在此條件下龍牙百合鱗莖總黃酮的提取效果最好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

在最優(yōu)提取條件下，同時(shí)進(jìn)行5個(gè)平行樣品驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明總黃酮提取量為（32.236±0.513）mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.25%，總黃酮提取量較高，重現(xiàn)性較好，表明此提取工藝穩(wěn)定合理。

2.7 不同濃度的龍牙百合鱗莖總黃酮提取液與維生素C的體外抗氧化能力比較

從圖5可以看出，不同濃度龍牙百合鱗莖的總黃酮提取液和維生素C溶液對(duì)DPPH·的清除率均隨著濃度的升高而升高。龍牙百合鱗莖總黃酮提取液對(duì)DPPH·的清除率始終優(yōu)于相同濃度的維生素C溶液，龍牙百合鱗莖總黃酮提取液與維生素C在相同濃度下對(duì)DPPH·的清除效果存在顯著差異（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

該研究結(jié)果表明：影響龍牙百合鱗莖總黃酮提取量的因素主次順序依次為乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間；最佳提取條件為提取溫度30 ℃，乙醇濃度80%，料液比1∶10，提取時(shí)間20 min。在優(yōu)化的工藝條件下，總黃酮的最大提取量達(dá)到（32.301±0.513） mg/g。靳磊等[8]研究表明野生百合渥丹、山丹的總黃酮含量分別為3 134.46和2 390.80 mg/kg，而蘭州百合的總黃酮含量為1 505.31 mg/kg。這說明龍牙百合鱗莖的總黃酮含量?jī)?yōu)于蘭州百合。

該研究中體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，在相同濃度下龍牙百合鱗莖的總黃酮提取液對(duì)DPPH·的清除能力顯著優(yōu)于維生素C溶液，說明龍牙百合鱗莖總黃酮表現(xiàn)出較好的清除DPPH·的能力。

龍牙百合作為一種傳統(tǒng)的保健食品，目前對(duì)其鱗莖的開發(fā)和利用模式比較單一，對(duì)其鱗莖的次生代謝相關(guān)產(chǎn)物的提取工藝和利用研究還較少。廣玉蘭在乙醇

濃度70%、料液比1∶40（g∶mL）、提取時(shí)間90 min、提取溫度70 ℃的條件下，總黃酮的提取率為4.896%[7]；紅橘果皮在乙醇濃度70%（g ∶mL）、料液比1∶20（g ∶mL）、提取溫度65 ℃和提取時(shí)間60 min的條件下，總黃酮的提取率為6.58%[4]；在工藝條件為微波時(shí)間 120 s、微波功率 400 W、液固比 33∶1的條件下，山楂葉總黃酮提取量為7.49 mg/g[5]；在浸提液為30%乙醇、料液比 1∶40、超聲波（80 Hz、200 W） 處理70 min、80 ℃水浴溫度下提取 2次，紫蘇葉粗提液總黃酮提取率為21.81 mg/g[6]，說明植物繁殖器官的總黃酮含量整體高于營(yíng)養(yǎng)器官。該研究結(jié)果表明龍牙百合鱗莖的總黃酮含量較其他植物的營(yíng)養(yǎng)器官高，且有較理想的抗自由基氧化效果，這為今后研究龍牙百合對(duì)人體抗自由基的保健功能提供了新的理論依據(jù)，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳立德，劉新桃，蔣盛巖，等.龍牙百合花氨基酸含量的柱前衍生OPA-HPLC法測(cè)定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（18）：10832-10833，10836.

[2] 羅麗萍，楊柏云，蔡奇英，等.龍牙百合熱處理及莖尖培養(yǎng)技術(shù)研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（1）：72-73，104.

[3] 烏蘭格日樂，白海泉，翁慧.黃酮的抗氧化活性研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，23（3）：277-280.

[4] 李彥杰，楊俊年，劉仁華，等.萬州紅橘果皮總黃酮提取工藝優(yōu)化和抗氧化活性分析[J].食品科技，2013，38（11）：221-225.

[5] 劉通，文連奎.微波輔助提取山楂葉黃酮的試驗(yàn)研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2014（5）：10-13，18.

[6] 劉毅君，曾廣燁，李愛貞.超聲波輔助法提取紫蘇葉總黃酮的研究[J].集美大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，19（1）：20-24.

[7] 郝玉民，李立祥，易昶寺，等.廣玉蘭花總黃酮提取及其抗氧化活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（5）：1365-1367，1485.

[8] 靳磊，張延龍，牛立新，等.3種百合鱗莖中多酚類物質(zhì)的抗氧化活性分析[J].西北植物學(xué)報(bào)，2014，34（5）：995-1001.