白飛妮 穆富香 楊代宇

摘要[目的]確定亞心形扁藻中葉綠素的優(yōu)化提取條件。[方法]在比較乙醇和丙酮提取亞心形扁藻細胞中葉綠素效果的基礎上，通過正交設計試驗確定提取亞心形扁藻中葉綠素的優(yōu)化條件。[結果]乙醇比丙酮提取效果明顯，乙醇提取亞心形扁藻中葉綠素的優(yōu)化條件是乙醇濃度85%、提取時間9 min、提取溫度35 ℃，在此優(yōu)化提取條件下，總葉綠素的最高提取量為9.07 mg/g。[結論]利用乙醇作提取劑可以從亞心形扁藻中提取更多的葉綠素，該結果可為從其他海洋微藻中提取葉綠素提供依據(jù)。

關鍵詞 亞心形扁藻；葉綠素；乙醇；提取工藝；優(yōu)化

中圖分類號 S963.21+3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）03-0108-03

Abstract[Objective] To determine optimal conditions for extracting chlorophyll from Platymonas subcordiformis. [Method] According to the results of extracting chlorophyll from P. subcordiformis by ethanol and acetone， the optimal condition were obtained by means of orthogonal design. [Result] The extraction effect of ethanol was higher than that of acetone， under the optimized conditions of 85% ethanol， 9 min extraction time and 35℃ extraction temperature， the maximum extraction rate was 9.07 mg/g. [Conclusion] More chlorophyll could be extracted from P. subcordiform by ethanol， the result will provide a basis for manufacturing chlorophyll from other marine microalgae.

Key words Platymonas subcordiformis；Chlorophyll；Ethanol；Extraction process；Optimization

亞心形扁藻（Platymonas subcordiformis）作為一種單細胞浮游植物，光合作用強，生長速率快，細胞內(nèi)營養(yǎng)組成全面，在我國沿海各省都有大量的培養(yǎng)，用作魚、蝦、貝類幼體生長必需的活體餌料，投喂幼體后，能夠提高其免疫和抗病能力[1]，亞心形扁藻也是產(chǎn)氫微藻之一，是未來研究清潔能源的一大藻種，具有很好的開發(fā)前景[2]。因此，對亞心形扁藻所含活性物質(zhì)的研究不僅有望產(chǎn)生具有市場應用潛力的新產(chǎn)品，也有利于促進微藻資源的充分研究、開發(fā)和利用[3]。亞心形扁藻細胞外具有一層比較薄的纖維質(zhì)細胞壁，細胞內(nèi)有一大型杯狀的色素體，其中含有較多的葉綠素。

葉綠素（Chlorophyll）是浮游植物的主要光合色素，作為表征浮游植物生物量的重要指標，在水域環(huán)境生物學研究及漁業(yè)初級生產(chǎn)力調(diào)查中被廣泛應用[4]，同時葉綠素在食品、醫(yī)藥和日化工業(yè)中也有重要應用[5]，因此從浮游植物中最大限度地提取葉綠素對表征浮游植物增殖能力和提高葉綠素產(chǎn)量具有重要意義。我國普遍采用的葉綠素提取和測定方法是丙酮研磨提取法[6]，該提取方法耗時較長、步驟繁瑣、提取不完全，且提取過程中使用丙酮不利于操作員的身體健康。因此，一些研究人員從細胞破碎方法、提取時間、提取液和提取溫度等方面入手對其加以改進，陳宇煒等[7]用乙醇萃取某水域浮游植物中的葉綠素a，其含量為181.44 μg/L，而用丙酮萃取同一水域浮游植物葉綠素a時，其含量為149.62 μg/L，說明乙醇提取效果明顯高于丙酮。李其雨等[8]比較丙酮、甲醇和乙醇提取真眼點藻類色素的效果發(fā)現(xiàn)，甲醇和乙醇提取時間短，乙醇的提取效果明顯優(yōu)于甲醇和丙酮。楊代宇等[9]比較丙酮和乙醇提取鹽藻中葉綠素的效果發(fā)現(xiàn)，乙醇比丙酮的提取率高出15.5%，并確定了乙醇提取鹽藻中葉綠素的優(yōu)化條件。

雖然許多研究結果表明乙醇比丙酮的提取效果好，但因為微藻種類不同，細胞組成和結構有所不同，從微藻中提取葉綠素的具體優(yōu)化條件不同。筆者從亞心形扁藻的實際應用前景考慮，比較乙醇和丙酮提取亞心形扁藻細胞內(nèi)葉綠素的效果，并采用正交設計試驗確定提取亞心形扁藻中葉綠素的優(yōu)化條件，以最大限度地提取扁藻中的葉綠素，促進扁藻的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種來源。亞心形扁藻（Platymonas subcordiformis）藻種為大連大學環(huán)境與化學工程學院海洋微藻生物能源試驗組自行分離得出。

1.1.2 儀器。EL204電子天平、80-2離心沉淀機、LD5-24臺式離心機、UV-5200型紫外可見分光光度計、HH-S恒溫水浴鍋、錐形瓶（5 L）等。

1.1.3 試劑。無水丙酮和無水乙醇均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1

亞心形扁藻培養(yǎng)及藻泥樣品處理。在10個5 L錐形瓶中分別加入滅菌海水2 500 mL，再分別加入500 mL處在對數(shù)生長期的亞心形扁藻藻液，再按1‰的比例加入3 mL康威方營養(yǎng)液[10]，在溫度25 ℃、光照強度1 800 lx、光照周期為12 h∶12 h的環(huán)境條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期末期（7 d），離心亞心形扁藻培養(yǎng)液（3 000 r/min，3 min），棄上層清液，藻泥用去離子水清洗3次后，凍融3次，備用。培養(yǎng)過程中，每天搖瓶2次，以促進瓶內(nèi)培養(yǎng)液混合均勻和內(nèi)部物質(zhì)的交換。試驗重復3次。

1.2.2

丙酮和乙醇的提取效果比較。將離心凍融后的亞心形扁藻藻泥定量后分成4組，按0.15、0.20、0.26、0.38的料液比（g∶mL）分別加入不同體積的95%丙酮和95%乙醇溶液，充分混勻后置于冰箱冷藏12 h，取出后置于離心機中離心（3 200 r/min，3 min）得上清液。將用丙酮提取的樣品用分光光度計于波長663 、646 和470 nm 處測吸光值。將用乙醇提取的樣品用分光光度計于波長665、649 和470 nm 處測吸光值。參照王英典等[11]的方法計算葉綠素濃度，求其平均值，比較葉綠素的提取效果。每組試驗重復3次。其中丙酮提取葉綠素的計算公式為（1）～（3），乙醇提取葉綠素的計算公式為（4）～（6）。

1.2.3

提取條件的優(yōu)化設計。影響提取劑提取微藻中葉綠素的條件有提取溫度、提取時間和料液比[12]。按照“1.2.2”確定有效提取亞心形扁藻中葉綠素的提取劑后，參照楊代宇等[9]提取鹽藻中葉綠素的優(yōu)化試驗條件，進行3因素3水平的正交試驗方案設計（表1）。

試驗時先設定恒溫水浴鍋的溫度，并將提取劑放入其中恒溫。按照表1分別取0.150 0 g藻泥加入10 mL不同濃度的乙醇溶液，在對應的提取時間和提取溫度進行試驗。按照“1.2.2”的方法離心，測定上清液吸光度值，按照公式（4）～（7）計算葉綠素濃度和提取量。

2 結果與分析

2.1 丙酮和乙醇提取葉綠素效果的比較

由圖1可知，當藻泥質(zhì)量與提取劑的體積比相同時，乙醇提取量均大于丙酮提取量，而在同一提取劑中，提取量從大到小依次為葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c。隨著藻泥質(zhì)量與提取劑體積比的增大，葉綠素a的提取量明顯上升，當藻泥質(zhì)量與提取劑體積比≥0.26（g∶mL）時，葉綠素a和c的提取量基本不變，說明一定量的藻泥樣品與提取劑體積有最佳比例。王玉芳等[13]、楊彩根等[14]、徐彩萍等[15]研究結果也表明乙醇提取葉綠素效果比丙酮好，但翁笑艷等[16]分析指出用丙酮提取地表水浮游植物中的葉綠素a，提取量更高。不同提取劑對不同植物中葉綠素的提取量不同，其原因應歸結于不同物種的細胞組成和結構上的差別。該試驗結果表明，乙醇比丙酮更有利于提取亞心形扁藻中的葉綠素，因此，進一步研究乙醇提取葉綠素的優(yōu)化條件以最大限度地獲取亞心形扁藻中的葉綠素。

2.2 亞心形扁藻中葉綠素的優(yōu)化提取條件

從表1可看出，不同試驗條件下提取的葉綠素含量從大到小依次為葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c。由極差R大小可見，影響葉綠素a提取量的因素主次順序依次為A、B、C，即乙醇濃度影響最大，提取時間次之，提取溫度影響最?。挥绊懭~綠素b提取量的因素主次順序依次為B、C、A，即提取時間影響最大，提取溫度次之，乙醇濃度影響最小；影響葉綠素c提取量的因素主次順序為依次C、B、A，即提取溫度影響最大，提取時間次之，乙醇濃度影響最小。

乙醇濃度對葉綠素a、b和c提取量的影響趨勢相似，且影響不大。3種葉綠素的提取量均在乙醇濃度為85%時達最大，說明85%乙醇濃度是最佳的提取劑濃度。提取時間對葉綠素b提取量的影響較大，對葉綠素a和c提取量的影響較小，這應與3種葉綠素的結構差異性有關；隨著時間的延長，提取量均下降，是因為葉綠素不穩(wěn)定。因此，提取葉綠素的時間應盡可能短，確定9 min為最佳提取時間。

提取溫度對3種葉綠素提取量的影響趨勢與提取時間對其的影響相似。說明提取亞心形扁藻中葉綠素有合適的提取溫度。當溫度升高時，葉綠素分解導致提取率下降，因此，確定優(yōu)化的提取溫度為35 ℃。

3 結論與討論

葉綠素主要包括a、b、c、d 4種，為適應不同光照條件下的生長，不同葉綠素吸收光的波長范圍不同。其中葉綠素a分子是光合作用的中心色素分子，任何進行放氧光合作用的植物細胞內(nèi)都含有葉綠素a；葉綠素b、c、d具有吸收光子的作用，葉綠素b主要存在于高等植物、綠藻中，葉綠素c主要存在于硅藻、褐藻、鞭毛藻中，葉綠素d主要存在于紅藻中[17]。

亞心形扁藻屬于綠藻門（Chorophyta）綠藻綱（Chlorphyceae）團藻目（Volocales）衣藻科（Chlamydomonaceae）扁藻屬（Platymonas），是具有4根鞭毛的海洋單細胞綠藻[3]，因此，細胞內(nèi)的葉綠素a和葉綠素b的含量高。亞心形扁藻中存在少量的葉綠素c，增加了其對某些波長光的吸收，有助于自身的生長。

楊洪芳等[18]用乙醇-超聲法萃取小球藻葉綠素a，確定的優(yōu)化條件是乙醇濃度95%、提取溫度53 ℃、提取時間10 min。楊代宇等[9]用乙醇提取鹽藻中葉綠素的優(yōu)化條件為乙醇濃度85%、提取時間12 min、提取溫度40 ℃。該試驗確定的乙醇提取亞心形扁藻中葉綠素的優(yōu)化條件是乙醇濃度85%、提取時間9 min、提取溫度35 ℃，在此條件下，葉綠素a、b、c的總提取量為9.07 mg/g。與楊洪芳等[18]、楊代宇等[9]的結果有所不同，說明微藻細胞的結構和組成影響葉綠素最佳提取條件的確定。

該試驗比較了丙酮和乙醇提取亞心形扁藻中葉綠素含量，發(fā)現(xiàn)乙醇提取效果明顯優(yōu)于丙酮，與楊代宇等[9]的研究結果一致。用丙酮提取葉綠素時提取時間長，易導致葉綠素的分解，影響其純度和質(zhì)量；同時丙酮易揮發(fā)，毒性較強，長時間接觸，不利于人體健康。用乙醇提取鹽藻和亞心形扁藻中的葉綠素時，時間短，避免了葉綠素的分解；提取溫度略高于室溫，提取量高；用乙醇作提取劑，避免了長期接觸丙酮對人體的毒害。該試驗結果將為從海洋微藻中提取用于食品、醫(yī)藥和日化工業(yè)的葉綠素提供參考。

參考文獻

[1] 劉艷，楊海波，趙蓮華，等.扁藻多糖的分離分析及其生物活性的初步研究[J].生物技術，2007，17（3）：53-56.

[2] 管英富，鄧麥村，金美芳，等.微藻光生物水解制氫技術[J].中國生物工程雜志，2003，23（4）：8-13.

[3] 扁藻[EB/OL].[2015-06-26].http：//baike.so.com/doc/5400776-5638377.html.

[4] 閆喜武，郭海軍，何志輝，等.用葉綠素法測定蝦池浮游植物初級生產(chǎn)力[J].大連水產(chǎn)學院學報，1998，13（2）：9-16.

[5] 鄭國棟，歐陽文，顏苗，等.葉綠素及其衍生物的藥理研究進展[J].中南藥學，2006，4（2）：146-148.

[6] 國家環(huán)境保護總局《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].4 版.北京：中國環(huán)境科學出版社，2002：670-671.

[7] 陳宇煒，高錫云.浮游植物葉綠素a含量測定方法的比較測定[J].湖泊科學，2000，12（2）：185-188.

[8] 李其雨，李愛芬，張成武.真眼點藻類色素的提取與測定方法[J].生態(tài)科學，2012，31（3）：278-283.

[9] 楊代宇，穆富香，白飛妮，等.鹽藻中葉綠素的提取方法比較及優(yōu)化條件[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2016，44（25）：7-9.

[10] 王友利.氮磷交互作用對兩種海洋微藻生長及細胞組分的影響[D].大連：大連大學，2015：13-14.

[11] 王英典，劉寧.植物生物學指導[M].北京：高等教育出版社，2001.

[12] 張麗彬，王啟山，徐新惠，等.乙醇法測定浮游植物葉綠素a含量的討論[J].中國環(huán)境監(jiān)測，2008，24（6）：9-10.

[13] 王玉芳，楊士斌，劉得銀，等.浮游植物葉綠素a 含量不同方法測定比較：以白洋淀區(qū)域水體為例[J].水文，2014，34（5）：57-60.

[14] 楊彩根，宋學宏，孫丙耀，等.浮游植物葉綠素a含量簡易測定方法的比較[J].海洋科學，2007，31（1）：6-9.

[15] 徐彩萍，劉霞，陳宇煒，等.浮游植物葉綠素a 濃度測定方法的比較研究[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學，2013，29（4）：438-442.

[16] 翁笑艷，林美愛，嚴穎，等.地表水浮游植物葉綠素a測定方法比較研究[J].中國環(huán)境監(jiān)測，2009，25（3）：37-38.

[17] 吳志強，周韋.葉綠素的類別概述[J].生物學通報，2014，49（9）：12-14.

[18] 楊洪芳，丁峰元，陳德輝，等.乙醇-超聲法在浮游植物葉綠素a含量測定中的應用[J].海洋漁業(yè)，2006，28（4）：310-312.