安曉剛+杜捷+齊偉男+劉璐+李小燕+甘海玲+盧小泉

摘 要 以紫脲酸銨（Murexide，MU）為還原劑及保護(hù)劑，采用水熱合成法，合成了紫脲酸銨保護(hù)的熒光金納米簇（MU-Au NCs），合成方法簡(jiǎn)單、快速?；诰穼?duì)MU-Au NCs的熒光猝滅現(xiàn)象，建立了快速、超靈敏檢測(cè)精胺的“Turn off”型熒光分析方法，在優(yōu)化的條件下，本方法檢測(cè)精胺的線性范圍為0.003～300 μmol/L，檢測(cè)限為1 nmol/L（S/N=3）。本方法為構(gòu)建精胺生物傳感器及實(shí)際樣品檢測(cè)提供了理論基礎(chǔ)和參考。

關(guān)鍵詞 紫脲酸銨； 金納米簇； 熒光猝滅； 精胺； 生物胺

1 引 言

生物胺（Biogenic amines， BA）主要包括精胺（Spermine， SPM）、腐胺（Putrescine， PUT）和亞精胺（Spermidine， SPD）， 通過(guò)微生物產(chǎn)生的活性物質(zhì)在食物的儲(chǔ)存和加工過(guò)程中形成[1，2]， 廣泛存在于食品中[1，3]， 易對(duì)生物胺敏感人群健康造成危害[1，3，4]。研究發(fā)現(xiàn)， 癌癥患者體內(nèi) SPM 水平會(huì)顯著增加[5]， 臨床上將 SPM 水平作為早期診斷腫瘤的標(biāo)志物和治療效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一， 但對(duì)于SPM代謝改變的具體機(jī)制尚不完全清楚。因此， 檢測(cè)生物胺含量對(duì)于保證消費(fèi)者的健康具有重要意義。然而， 除個(gè)別規(guī)定外[1]， 我國(guó)以及歐洲對(duì)于食物中生物胺含量均未做出明確限定和要求。近年來(lái)， 由于食品安全問(wèn)題頻頻發(fā)生， 引起了人們對(duì)食品安全的高度重視， 食品中生物胺含量檢測(cè)成為近年研究熱點(diǎn)。目前， 生物胺檢測(cè)分析方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）[6，7]、毛細(xì)管電泳法[8，9]等， 這些方法對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高， 操作繁瑣。因此， 靈敏、有效的檢測(cè)方法， 對(duì)于食品質(zhì)量監(jiān)測(cè)、保護(hù)消費(fèi)者健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

靈敏度是衡量檢測(cè)方法性能的重要指標(biāo)。近些年出現(xiàn)的一些生物分子超靈敏檢測(cè)方法， 因其簡(jiǎn)單、高效、靈敏， 在臨床診斷[10]、食品質(zhì)量控制[11]和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的標(biāo)記物包括電化學(xué)活性分子[12]、熒光染料[13]、高量子產(chǎn)率的聚合物[14]以及酶如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）[15]等， 但這些材料通常存在熒光性質(zhì)不穩(wěn)定、容易光漂白等不足。貴金屬納米簇是近年來(lái)興起的熒光標(biāo)記材料， 具有低毒、熒光性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)， 極大提高了檢測(cè)的靈敏度[16，17]， 彌補(bǔ)了傳統(tǒng)標(biāo)記物的不足， 而且提高了信號(hào)放大能力和分子檢測(cè)的靈敏度， 且方法簡(jiǎn)便。

紫脲酸銨（Murexide， MU）是一種紅紫酸銨鹽， 微溶于冷水， 能與很多陽(yáng)離子形成不同顏色的絡(luò)合物， 常被作為一種絡(luò)合滴定指示劑用于分析化學(xué)絡(luò)合滴定[18]、電極表面修飾[18～21]及生物分子檢測(cè)[22～26]。由于其具有分子量小、對(duì)pH值敏感、還原性強(qiáng)， 能與很多陽(yáng)離子形成不同顏色的絡(luò)合物的優(yōu)點(diǎn)， 常作為生物分子檢測(cè)指示劑[24]。如Grudpan等[24]將 MU 作為流動(dòng)注射法檢測(cè) Ca2+的顏色指示劑； Shamsipur等[27]將 MU 用于制備銅鎳配合物。

本研究以紫脲酸銨為還原劑及保護(hù)劑， 采用簡(jiǎn)單、快速的水熱法， 合成了具有藍(lán)色熒光、熒光性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、分散性以及水溶性好的金納米簇（MU-Au NCs）?；诰穼?duì)其的熒光猝滅現(xiàn)象， 建立了快速、超靈敏檢測(cè)精胺的“Turn Off”型熒光分析方法， 對(duì)精胺線性檢測(cè)范圍為0.003～300 μmol/L， 檢出限為 1 nmol/L。本研究不僅拓展了金納米簇的種類， 而且建立了簡(jiǎn)單、超靈敏檢測(cè)精胺的分析方法， 為生物實(shí)際樣品及食物中生物胺含量檢測(cè)提供了理論依據(jù)和技術(shù)參考。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

安捷倫-G9800A 熒光分光光度計(jì)（美國(guó)Agilent公司）； TENSOR-37 型傅立葉變換紅外光譜儀（德國(guó)布魯克公司）； JEM-2100 高分辨率透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）； Veeco Nanoscope 3D 原子力顯微鏡（美國(guó) Veeco Nanoscope公司）； FLS 920 穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀（美國(guó) Edinbergh 公司）； PB-10 PH 計(jì)（德國(guó) Sartorius 公司）； FA 2004型分析電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）； ZD-A 21 真空冷凍干燥機(jī)（南京載智自動(dòng)化設(shè)備有限公司）；

氯金酸（HAuCl4， 分析純， 金含量> 47.8%， 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）； 精胺（純度 98%， Aladdin公司）； 紫脲酸銨（分析純， Aladdin 公司）； 谷胱甘肽（純度 99%， 北京百靈威科技有限公司）； 透析袋（MWCO 500～1000 Da， 上海源葉生物科技有限公司）； 其余試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司， 純度均大于 99%； 實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 紫脲酸銨保護(hù)的金納米簇（MU-Au NCs）的合成 在4.48 mL 二次蒸餾水中加入 520 μL 48 mmol/L氯金酸溶液， 30℃恒溫水浴和磁力攪拌下， 將 5 mL 10 mmol/L紫脲酸銨溶液逐滴加到上述溶液中， 反應(yīng) 30 min后取出， 14000 r/min離心20 min， 取上清液， 透析 48 h， 收集透析內(nèi)液， 即得到紫脲酸銨保護(hù)的金納米簇（MU-Au NCs）， 4℃保存， 備用。

2.2.2 MU-Au NCs性質(zhì)表征 采用熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜、熒光壽命分析及高分辨透射電子顯微鏡對(duì)制備的 MU-Au NCs 形貌、粒徑大小及光學(xué)性能進(jìn)行了表征。熒光光譜采用 Agilent G 9800A 熒光分光光度計(jì)測(cè)定， 激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均設(shè)定為5； 熒光壽命分析采用 FLS 920 穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀測(cè)定， 參比溶液為L(zhǎng)UDOX 硅溶膠（30% 硅膠水溶液）； 原子力顯微鏡（AFM）圖譜采用美國(guó) Veeco Nanoscope 3D 原子力顯微鏡測(cè)得， 將樣品分散在無(wú)水乙醇中， 用表面打磨干凈云母片（或硅片）沾取， 自然晾干， 進(jìn)行樣品掃描。

2.2.3 對(duì)精胺的檢測(cè) 取 2 mL MU-Au NCs 溶液用 pH 7.0 的 PBS 緩沖液稀釋至 3 mL， 分別加入500 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)精胺溶液（以二次蒸餾水為空白樣品）， 混合均勻， 反應(yīng) 30 min 后進(jìn)行熒光檢測(cè)。空白樣與待測(cè)樣品熒光強(qiáng)度差值用ΔF（ΔF=F0-F1）表示， 熒光猝滅程度用（F0-F1）/F0表示， 其中F0和 F1分別代表空白溶液和樣品溶液的熒光強(qiáng)度。

2.2.4 樣品處理與分析 取5 g 待測(cè)冷鮮豬肉樣品加入20 mL 的0.4 mol/L 的HClO4， 經(jīng)勻漿機(jī)粉碎勻漿， 4℃， 2500 r/min離心10 min， 收集上清液[28]。對(duì)沉淀部分進(jìn)行再次提取， 方法同上?；旌蟽纱翁崛〉纳锨逡?， 用0.4 mol/L HClO4定容至25 mL， 然后加入pH 7.0 的 PBS（0.12 mol/L）緩沖液。

取 2 mL MU-Au NCs 溶液， 加入上述樣品提取液 1 mL， 分別加入 300 μL濃度為1×108 mol/L， 1×107 mol/L， 1×106 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)精胺溶液， 反應(yīng) 30 min后檢測(cè)熒光， 平行3次實(shí)驗(yàn)， 計(jì)算RSD值。

3 結(jié)果與討論

3.1 MU-Au NCs的微觀形貌表征

高分辨透射電子顯微鏡（TEM）及原子力顯微鏡（AFM）表征結(jié)果如圖 1所示。透射電鏡圖譜（圖1A）表明， MU-Au NCs 具有良好的分散性， 平均粒徑為 2 nm， 晶格明顯， 為 0.23 nm， 間距幾乎相同， 與金納米簇的典型特征一致， 證明制備得到的是金納米簇。AFM圖（圖1B）顯示 MU-Au NCs 呈球形， 高度小于 2 nm。

3.2 MU-Au NCs的紅外光譜分析

化學(xué)反應(yīng)前后物質(zhì)中化學(xué)鍵及官能團(tuán)的變化可以間接反映化學(xué)反應(yīng)機(jī)理。不同物質(zhì)的傅里葉變換紅外光譜圖如圖2所示。

在紫脲酸銨的紅外光譜中， 3658 cm1處為NH 的伸縮振動(dòng)， 3041 cm1處為 CC 的伸縮振動(dòng)， 2838 cm1處為CH的伸縮振動(dòng)， 1690 cm1處為CO的伸縮振動(dòng)， 1291 cm1處為CO的彎曲振動(dòng)。對(duì)于紫脲酸銨與氯金酸反應(yīng)制備的金納米簇（MU-Au NCs）， 3735 cm1處為NH的伸縮振動(dòng)， 3421 cm1處為OH的伸縮振動(dòng)， 2896 cm1處為CH的伸縮振動(dòng)， 1632 cm1處為CO的伸縮振動(dòng)， 1060 cm1處可能為COAu的彎曲振動(dòng)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)， 紫脲酸銨與氯金酸反應(yīng)后， NH伸縮振動(dòng)減弱， 紫脲酸銨于3041 cm1處的CC伸縮振動(dòng)及 1291 cm1處的CO彎曲振動(dòng)消失， 1690 cm1處的CO伸縮振動(dòng)減弱， 于3421 cm1處產(chǎn)生了劇烈的OH的伸縮振動(dòng)， 并于 1060 cm1處產(chǎn)生了一個(gè)新的彎曲振動(dòng)特征峰， 可能為 COAu的彎曲振動(dòng)。以上變化表明， 紫脲酸銨與氯金酸發(fā)生了相互作用， 紫脲酸銨分子修飾到Au NCs表面。

3.3 MU-Au NCs 的光學(xué)性質(zhì)表征

熒光性質(zhì)是貴金屬納米簇的主要性質(zhì)之一。如圖 3A 所示， MU-AuNCs 在 330 nm處有紫外吸收峰， 在 280和 335 nm 有熒光激發(fā)峰， 在 445 nm 處有熒光發(fā)射峰。此金納米簇溶液在可見(jiàn)光下呈無(wú)色透明， 在 365 nm 波長(zhǎng)紫外燈下發(fā)出藍(lán)色熒光（圖3A插圖）。熒光壽命分析結(jié)果如圖3B 所示， MU-Au NCs的熒光壽命持續(xù)時(shí)間約20 ns， 與參比溶液 LUDOX 相比， 熒光壽命持續(xù)時(shí)間約是其 3 倍。熒光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 C所示， 此金簇在1～12月內(nèi)熒光性質(zhì)較穩(wěn)定， 具有良好的熒光性質(zhì)。

3.4 精胺對(duì)MU-Au NCs 熒光猝滅響應(yīng)

樣品檢測(cè)的特異性對(duì)于熒光探針檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用是非常重要的。為了探究構(gòu)建的金納米簇?zé)晒忖缧吞结槞z測(cè)精胺的特異性， 選擇精胺測(cè)定常見(jiàn)的干擾物谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸、組氨酸（His）、賴氨酸（Lys）等、評(píng)價(jià)此熒光探針的特異性， 取高于最高檢測(cè)限濃度10 倍的干擾物加入MU-Au NCs溶液中， 觀察干擾物對(duì)精胺檢測(cè)的影響， 計(jì)算熒光強(qiáng)度差值ΔF值和熒光猝滅程度。如圖 4A所示， 測(cè)試的干擾物對(duì)精胺檢測(cè)影響較小， 說(shuō)明此探針對(duì)精胺檢測(cè)的選擇性和特異性比較好。圖4B的結(jié)果說(shuō)明， 不同濃度的精胺對(duì)MU-Au NCs 熒光猝滅強(qiáng)度不同， 可利用此原理進(jìn)行精胺的檢測(cè)。

3.5 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

pH值及離子強(qiáng)度是主要影響因素， 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大。由圖5A可見(jiàn)， 當(dāng) pH=7時(shí)， 對(duì)精胺檢測(cè)有一定的影響， 但總體影響較小， 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用方便， 故選擇最適 pH=7。圖5B表明， 在測(cè)試的范圍內(nèi)， 離子強(qiáng)度對(duì)精胺猝滅金納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響也較小。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果， pH值 及離子強(qiáng)度對(duì)精胺檢測(cè)的影響較小， 后續(xù)實(shí)驗(yàn)中離子干擾影響可以忽略。

3.6 方法的檢測(cè)性能

不同濃度的精胺存在時(shí)， MU-Au NCs 的熒光光譜如圖6所示， 隨著精胺濃度增大， MU-Au NCs 的熒光猝滅程度增大。熒光猝滅程度（F0-F1）/F0與精胺濃度在0.003～300 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.0023x+0.0356（r=0.9982）， 檢出限為 1 nmol/L（S/N=3）。

將本方法與文獻(xiàn)報(bào)道的其它方法進(jìn)行比較（表1）可知， 本方法對(duì)精胺的檢測(cè)范圍較寬， 且檢出限相對(duì)較低。盡管本方法與文獻(xiàn)報(bào)道的超高液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（UHPLC-TQMS）方法相比， 靈敏度（檢測(cè)限）稍低， 但本方法操作簡(jiǎn)單、快速， 適于常規(guī)的快速檢測(cè)。

3.7 實(shí)際樣品分析

為了評(píng)價(jià)所構(gòu)建的熒光探針對(duì)實(shí)際樣品中 SPM 檢測(cè)的實(shí)用性， 檢測(cè)了市售冷鮮豬肉在貯藏過(guò)程中的精胺含量。采用標(biāo)準(zhǔn)加樣回收法對(duì)豬肉提取液中的 SPM 含量進(jìn)行了測(cè)定， 結(jié)果見(jiàn)表 2。豬肉中 SPM 的平均回收率為 97.1%～105.6%， 表明此熒光探針能夠適用于實(shí)際樣品中精胺的檢測(cè)要求。

4 結(jié) 論

以紫脲酸銨作為還原劑及保護(hù)劑， 采用水熱合成法， 簡(jiǎn)單、快速合成了直徑<2 nm的熒光金納米簇（MU-Au NCs）?；诰穼?duì)紫脲酸銨保護(hù)的金納米簇的熒光猝滅現(xiàn)象， 建立了快速、超靈敏檢測(cè)精胺的“Turn off”型熒光分析方法， 對(duì)精胺線性檢測(cè)范圍為0.003～300 μmol/L， 檢出限為 1 nmol/L。本研究拓展了金納米簇的種類， 為構(gòu)建基于貴金屬納米簇的生物傳感器及生物樣品檢測(cè)提供了基礎(chǔ)和參考。

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