歐麗娟+羅建新+孫愛(ài)明+陳思羽+王凌云

摘 要 三聚氰胺能與銅離子（Cu2+）形成配合物，對(duì)熒光銅納米簇的合成有明顯抑制作用，且其抑制程度與三聚氰胺濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系?；诖藰?gòu)建了一種簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)三聚氰胺的方法。以聚T單鏈DNA為模板合成的銅納米簇作為熒光探針，當(dāng)三聚氰胺存在時(shí)，Cu2+與三聚氰胺生成配合物，阻礙銅納米簇的合成，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，三聚氰胺濃度在5～120 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為1.5 μmol/L，牛奶樣品中三聚氰胺加標(biāo)回收率為96.3%～104.4%。與傳統(tǒng)納米金/銀、量子點(diǎn)等方法相比，本方法具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 銅納米簇； 銅-三聚氰胺配合物； 熒光； 非標(biāo)記

1 引 言

三聚氰胺是一種低毒性的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，常用于制造三聚氰胺樹(shù)脂，是建筑業(yè)常用的防火材料。由于其分子中含氮量為66%，且無(wú)味，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)，一些不良企業(yè)為降低成本，在乳制品和飼料中添加三聚氰胺，以提高食品檢測(cè)中蛋白質(zhì)含量指標(biāo)。然而，三聚氰胺會(huì)與尿酸結(jié)合生成難溶于水的結(jié)石[1]，導(dǎo)致腎積水、腎結(jié)石等腎臟膀胱疾病，甚至死亡。因此，發(fā)展快速、準(zhǔn)確、靈敏的三聚氰胺的測(cè)定方法對(duì)保障乳制品安全具有重要的實(shí)際意義。

傳統(tǒng)的三聚氰胺檢測(cè)方法包括高效液相色譜法[2]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3]、電位滴定法[4]、酶聯(lián)免疫吸附分析法[5]等，上述方法一般需要專業(yè)的操作人員，且存在選擇性低或者精確度不高的不足，難以滿足實(shí)際食品監(jiān)管中快速、高效、低成本的檢測(cè)要求。近年發(fā)展的新方法， 如納米材料比色法[6～8]、熒光探針?lè)╗9]、分子印跡聚合物法[10]和表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)[11，12]等，與傳統(tǒng)方法相比，具有檢出限低、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，但是預(yù)處理過(guò)程繁瑣耗時(shí)，需要衍生或者昂貴的儀器。

最近，Qing等[13]發(fā)現(xiàn)，富含胸腺嘧啶T的單鏈DNA可作為合成銅納米簇的有效模板。聚T為模板合成的銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度高，而且尺寸和熒光強(qiáng)度可以通過(guò)聚T單鏈DNA的長(zhǎng)度來(lái)調(diào)節(jié)；此外，基于聚T單鏈DNA 的銅納米簇的合成在幾分鐘內(nèi)即可完成，比其它金屬納米簇的合成快速、簡(jiǎn)捷。如隨機(jī)dsDNA-銅納米簇合成中，為了保證雙鏈DNA模板的有效雜交，耗時(shí)需1 h以上[14]；DNA-銀納米簇的合成需要在黑暗中反應(yīng)24 h[15]；BSA-金納米簇的合成需要2 d[16]。

三聚氰胺可以通過(guò)芳香環(huán)上的氮原子與Cu2+形成配合物[17]。基于此，本研究提出了一種檢測(cè)三聚氰胺的方法。利用聚T單鏈DNA為模板合成的銅納米簇作為熒光探針，由于三聚氰胺與Cu2+發(fā)生配位反應(yīng)，阻礙了銅納米簇的合成，導(dǎo)致銅納米簇?zé)晒庑盘?hào)減弱。此方法用于三聚氰胺的檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、成本低，并成功用于實(shí)際牛奶樣品中三聚氰胺的檢測(cè)，在食品安全監(jiān)管等方面具有良好的應(yīng)用前景。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

含30個(gè)堿基的聚胸腺嘧啶寡聚核苷酸鏈（T30）由上海生工生物工程公司合成。3-（N-嗎啉基）-丙磺酸（MOPs）、抗壞血酸、CuSO4·5H2O、NaCl 和三聚氰胺（北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司）；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（>18.25 MΩ·cm）。

Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫公司），激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，掃描范圍500～660 nm，激發(fā)狹縫設(shè)定為5.0 nm，發(fā)射狹縫設(shè)定為10.0 nm。

2.2 熒光銅納米簇的制備

T30DNA為模板的銅納米簇的制備參照文獻(xiàn)[13]的方法稍作修改，簡(jiǎn)述如下：將5 μmol/L T30-DNA、MOPs緩沖液（10 mmol/L MOPs，150 mmol/L NaCl，pH 7.6）、3 mmol/L抗壞血酸溶液混合均勻后，加入300 μmol/L CuSO4溶液，避光反應(yīng)1 min，得到熒光銅納米簇。

2.3 三聚氰胺的檢測(cè)

將300 μmol/L CuSO4溶液與不同濃度的三聚氰胺溶液混勻，室溫下孵育20 min。反應(yīng)后的溶液加入到含有5 μmol/L T30-DNA、MOPs緩沖液、3 mmol/L抗壞血酸溶液的體系中，室溫下避光反應(yīng)1 min，立即進(jìn)行熒光檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)原理

三聚氰胺可以通過(guò)芳香環(huán)上的N與Cu2+形成配合物[17]，基于此，本研究構(gòu)建了檢測(cè)三聚氰胺的策略，如圖1所示。以含30個(gè)堿基的聚胸腺嘧啶的單鏈DNA為模板，以抗壞血酸為還原劑， Cu2+被還原為Cu0，并富集在T30單鏈DNA上，生成具有強(qiáng)熒光的銅納米簇，并作為信號(hào)報(bào)告探針（圖1A）。當(dāng)三聚氰胺存在時(shí)，與Cu2+發(fā)生配位反應(yīng)，不利于Cu2+被還原為Cu0簇?fù)碓趩捂淒NA上，從而阻礙銅納米簇的合成，導(dǎo)致合成銅納米簇的熒光強(qiáng)度大大降低（圖1B），熒光強(qiáng)度降低的程度與三聚氰胺的濃度相關(guān)，基于此可以實(shí)現(xiàn)三聚氰胺的檢測(cè)。

3.2 三聚氰胺對(duì)熒光銅納米簇合成的影響

為了考察三聚氰胺是否能夠間接抑制CuNCs的合成，測(cè)定了三聚氰胺存在與否時(shí)CuNCs的熒光光譜。如圖2a所示， Cu2+不存在時(shí)，無(wú)熒光信號(hào)，說(shuō)明未合成CuNCs；Cu2+存在時(shí)，630 nm出現(xiàn)強(qiáng)的熒光發(fā)射峰（圖2b），證明在抗壞血酸作用下，Cu2+被還原為Cu0，聚集在T30單鏈DNA上，生成CuNCs，產(chǎn)生強(qiáng)的熒光信號(hào)。當(dāng)加入120 μmol/L三聚氰胺后，熒光強(qiáng)度大大降低（圖2c），說(shuō)明三聚氰胺與Cu2+形成配合物，阻礙了銅納米簇的合成，導(dǎo)致體系的熒光強(qiáng)度降低。以上結(jié)果表明，可以利用三聚氰胺對(duì)銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的減弱程度檢測(cè)三聚氰胺。

3.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

銅納米簇的合成時(shí)間對(duì)熒光檢測(cè)三聚氰胺有重要影響。研究表明，隨著銅納米簇合成時(shí)間的延長(zhǎng)，不加三聚氰胺時(shí)的空白熒光信號(hào)值F0基本趨于平穩(wěn)，但是加三聚氰胺的響應(yīng)熒光信號(hào)強(qiáng)度F有略微的增加，導(dǎo)致F0/F逐漸降低，降低了信噪比（圖3A）。因此，實(shí)驗(yàn)選用銅納米簇合成時(shí)間為1 min。

三聚氰胺與銅離子發(fā)生配位反應(yīng)，繼而阻礙銅納米簇的合成，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。因此，配位反應(yīng)時(shí)間也是一個(gè)重要因素。從圖3B可見(jiàn)，隨著絡(luò)合時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)0/F逐漸增加， 20 min達(dá)到最大并趨于平穩(wěn)。故選取三聚氰胺與Cu2+的配位反應(yīng)時(shí)間為20 min。

Cu2+被還原為Cu0結(jié)合在單鏈DNA上，形成熒光銅納米簇[14]。低濃度的Cu2+不利于合成銅納米簇。但是高濃度的Cu2+可與抗壞血酸產(chǎn)生氧的自由基降解DNA鏈，導(dǎo)致模板濃度降低，從而使銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度降低[18]。因此，Cu2+的濃度對(duì)銅納米簇的熒光信號(hào)有重要影響。從圖3C可見(jiàn)，Cu2+濃度在100～700 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，F(xiàn)0/F先增加，于300 μmol/L達(dá)到最大值，繼續(xù)增大Cu2+濃度，F(xiàn)0/F反而降低。故選擇最佳Cu2+濃度為300 μmol/L。

抗壞血酸濃度也是影響銅納米簇合成的一個(gè)重要參數(shù)。從圖3D可知，隨著抗壞血酸濃度的增加，F(xiàn)0/F逐漸增大，在3 mmol/L處達(dá)到最大。故選取3 mmol/L作為最佳抗壞血酸濃度。

3.4 傳感器的分析性能

在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同濃度的三聚氰胺進(jìn)行了檢測(cè)。圖4A為630 nm處熒光強(qiáng)度與三聚氰胺濃度的校正曲線圖。結(jié)果表明，隨著三聚氰胺濃度升高，熒光信號(hào)逐漸降低，在5～120 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.998，檢出限為1.5 μmol/L （S/N=3），遠(yuǎn)低于國(guó)家規(guī)定的三聚氰胺限量值1 mg/kg[19]。與文獻(xiàn)報(bào)道的納米金、納米銀等方法[6，7，8，11，12]相比， 本方法檢出限更低，并且方法操作簡(jiǎn)單、快速。

為了證明本方法對(duì)三聚氰胺檢測(cè)的特異性，考察了牛奶中存在的常見(jiàn)金屬離子（Ca2+，F(xiàn)e3+，Zn2+）及氨基酸（甘氨酸Gly，賴氨酸Lys，組氨酸His）等其它可能產(chǎn)生干擾的物質(zhì)（葡萄糖Glc，苯胺Ani）的影響。從圖4B可見(jiàn)，只有三聚氰胺會(huì)導(dǎo)致銅納米簇?zé)晒怙@著降低，大多數(shù)干擾物質(zhì)的加入對(duì)銅納米簇?zé)晒鉀](méi)有影響。盡管L-組氨酸的咪唑環(huán)也可與Cu2+發(fā)生配位反應(yīng)，導(dǎo)致銅納米簇?zé)晒鉁p弱，但是響應(yīng)信號(hào)遠(yuǎn)小于三聚氰胺。

3.5 實(shí)際牛奶樣品分析

采用本方法檢測(cè)了牛奶樣品中三聚氰胺。牛奶樣品處理方法同文獻(xiàn)[20]：在牛奶樣品中加入三氯乙酸，超聲提取20 min，15000 r/min離心兩次。上清液過(guò)濾后，用NaOH溶液調(diào)至pH 7.0，采用本法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，牛奶樣品中未檢測(cè)出三聚氰胺。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。樣品的加標(biāo)回收率在96.3%～104.4%之間，表明本方法具有良好的可靠性和準(zhǔn)確性，可用于實(shí)際樣品中三聚氰胺的檢測(cè)。

4 結(jié) 論

基于三聚氰胺與Cu2+絡(luò)合形成配合物，阻礙銅納米簇的合成，從而降低銅納米簇的熒光，建立了一種檢測(cè)三聚氰胺的靈敏方法。本方法成本低、無(wú)需標(biāo)記，操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性好，可用于牛奶樣品中三聚氰胺檢測(cè)，具有良好的的應(yīng)用前景。

References

1 Langman C B， Alon U， Ingelfinger J. Pediatr. Nephrol.， 2009， 24（7）： 1263-1266

2 Zhong Y B， Zhang L J， Zhang H C， Liu J X， Wang J P. Chromatographia， 2011， 73（11）： 1211-1215

3 Braekevelt E， Lau B P Y， Feng S， Menard C， Tittlemier S. A. Food Addit. Contam. A， 2011， 28（1）： 698-704

4 YUAN Li-Yong， MA Chao-Wei， DU Ya-Hui， Henan Chemical Industry， 2004， 1（4）： 42-43

袁立勇， 馬朝衛(wèi)， 杜亞輝. 河南化工， 2004， 1（4）： 42-43

5 Liu J X， Zhong Y B， Liu J， Zhang H C， Xi J Z， Wang J P. Food Control， 2010， 21（12）： 1482-1487

6 Zhou Q Q， Liu N， Qie Z W. J. Agr. Food Chem.， 2011， 59（22）： 12006-12011

7 Ping H， Zhang M W， Li H K. Food Control， 2012， 23（1）： 191-197

8 Xavier S S J， Karthikeyan C， kumar G G. Anal. Methods， 2014， 6（8）： 8165-8172

9 Zhou Y Y， Yang J， Liu M. J. Luminescence， 2010， 130（5）： 817-820

10 Sun K J， Deng Q L， Guo T. RSC Adv.， 2015， 5（114）： 94084-94090

11 Zhang X F， Zou M Q， Qi X H. J. Raman Spectrosc.， 2010， 41（12）： 1655-1660

12 Lang T T， Panga S， He L L. Anal. Methods， 2015， 7（15）： 6426-6431

13 Qing Z H， He X X， Qing T P， Wang K M. Anal. Chem.， 2013， 85（24）： 12138-12143

14 Zhou Z， Du Y， Dong S. Anal. Chem.， 2011， 83（13）： 5122-5127

15 Xie J， Zheng Y， Ying J Y. J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（3）： 888-889

16 He H， Xie C， Ren J C. Anal. Chem.， 2008， 80（15）： 5951-5957

17 Zhu H， Zhang S X， Li M X， Shao Y H， Zhu Z W. Chem. Commun.， 2010， 46（13）： 2259-2261

18 Rotaru A， Dutta S， Jentzsch E， Gothelf K， Mokhir A. Angew. Chem. Int. Edit.， 2010， 49（33）： 5665-5667

19 Regulation of the Ministry of Health of the Peoples Republic of China. Ministry of Industry and Information Technology of the People's Republic of China. Ministry of Agriculture of the Peoples Republic of China. State Administration for Industry and Commerce. General Administration of Quality Supervision， Inspection and Quarantine of the Peoples Republic of China. No. 1519， Limit Value of Melamine in Food， 2011

關(guān)于三聚氰胺在食品中的限量值的公告. 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部， 中華人民共和國(guó)工業(yè)和信息化部， 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部， 國(guó)家工商行政管理總局， 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局公告， 第10 號(hào)， 2011

20 OU Li-Juan， LIU Hong-Wei， LIU Kai-Jian. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（8）： 1205-1209

歐麗娟， 劉宏偉， 劉開(kāi)建. 分析化學(xué)， 2014， 42（8）： 1205-1209