蔣燕，郭順，，鄒悅，陳力

(1南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京210023；2江蘇省中醫(yī)院)

麻黃堿對(duì)IL-17誘導(dǎo)的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT分泌CCL20的影響

蔣燕1，郭順1，2，鄒悅1，陳力2

(1南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京210023；2江蘇省中醫(yī)院)

目的 觀察麻黃堿對(duì)IL-17誘導(dǎo)的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT分泌CCL20的影響。方法 將HaCaT細(xì)胞隨機(jī)分為6組。A組加不含藥物的培養(yǎng)液， B組加含20 ng/mL IL-17的培養(yǎng)液，C、D、E分別加含20 ng/mL IL-17聯(lián)合800、1 200、1 600 μg/mL麻黃堿的培養(yǎng)液，F(xiàn)組加含20 ng/mL IL-17聯(lián)合50 μg/mL MTX的培養(yǎng)液。培養(yǎng)36 h后，采用ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液CCL20，采用RT-PCR法測(cè)定細(xì)胞中的CCL20 mRNA。結(jié)果 A、B、C、D、E、F組HaCaT細(xì)胞上清液CCL20水平分別為(97.72±1.86)、(159.43±7.09)、(147.05±2.25)、(138.60±8.04)、(126.66±7.04)、(114.39±3.90)pg/mL，HaCaT細(xì)胞CCL20 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.91±0.08、7.22±0.32、4.95±0.33、2.79±0.19、1.79±0.49、1.80±0.47；B、C、D、E、F組均高于A組(P均<0.05)，D、E、F組均低于B組(P均<0.05)，C、D組均低于F組(P均<0.05)。結(jié)論 麻黃堿能有效抑制IL-17誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞分泌CCL20，為麻黃治療銀屑病提供一定的理論依據(jù)。

麻黃堿；趨化因子；CCL20；白細(xì)胞介素17；銀屑??；人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞

銀屑病是一種由T細(xì)胞介導(dǎo)的持續(xù)存在的慢性、炎癥性疾病，其主要表現(xiàn)是角質(zhì)形成細(xì)胞的異常分化和增殖。Th17細(xì)胞是一類T細(xì)胞，其標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-17 具有強(qiáng)大的致炎性，在銀屑病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重要作用[1，2]。CCL20又稱為巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3α( MIP-3α)，是CC類趨化因子之一，在IL-17的誘導(dǎo)下表達(dá)明顯增加[3～5]；其也可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞增殖和活化，并募集炎性因子進(jìn)入皮損區(qū),導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生[4，5]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為銀屑病多采用清熱涼血法，現(xiàn)代中醫(yī)創(chuàng)新地提出汗法治療銀屑病亦可取得良好效果[6，7]。麻黃作為發(fā)汗藥之首，具有通腠理、解肌功效。麻黃堿是麻黃的主要成分，具有一定的發(fā)汗作用。2016年5～10月，我們以麻黃堿作為干預(yù)藥物，觀察其對(duì)IL-17介導(dǎo)的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT分泌CCL20的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備 人永生化的角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT購(gòu)于南京凱基生物有限公司，高糖DMEM、胎牛血清、0.25%胰酶/EDTA、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、DMSO購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；重組IL-17購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司，重組細(xì)胞因子溶解稀釋套裝購(gòu)于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。鹽酸麻黃堿購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，甲氨蝶呤注射液(MTX)購(gòu)于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司，TRIzol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄及SYBR Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司。倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，熒光定量PCR儀、酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞置于高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)中，于5% CO2、恒溫、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 藥物溶液制備 麻黃堿先高溫滅菌后用PBS(pH 7.2～7.4)溶解成10 mg/mL，母液儲(chǔ)存于4 ℃冰箱，臨用時(shí)用10%血清DMEM稀釋成各濃度加入孔中。MTX以高溫滅菌后用PBS(pH 7.2～7.4)稀釋成50 μg/mL待用，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱。

1.2.3 HaCaT細(xì)胞上清液中CCL20水平檢測(cè) 采ELISA法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，常規(guī)消化后按5×105/孔種植于6孔板，置于37 ℃、5% CO2恒溫孵箱中。24 h后觀察鋪板均勻、生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，將細(xì)胞隨機(jī)分為6組。A組加不含藥物的培養(yǎng)液2 mL， B組加含20 ng/mL IL-17的培養(yǎng)液2 mL，C、D、E、分別加含20 ng/mL IL-17聯(lián)合800、1 200、1 600 μg/mL麻黃堿的培養(yǎng)液2 mL，F(xiàn)組加含20 ng/mL IL-17聯(lián)合50 μg/mL MTX的培養(yǎng)液2 mL。培養(yǎng)36 h后收集上清液，以2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清。用PBS(pH 7.2～7.4)稀釋細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度到1×106/mL。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成分。以2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，操作實(shí)驗(yàn)完成后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔光密度(OD值)；根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用間接法讀取各樣品的CCL20水平。

1.2.4 HaCaT細(xì)胞CCL20 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，常規(guī)消化后按35×105/孔種植于直徑6 mm小皿中，置于37 ℃、5% CO2恒溫孵箱中。24 h后觀察鋪板均勻、生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，細(xì)胞分組與用藥同1.2.3，培養(yǎng)36 h。①HaCaT細(xì)胞總RNA提?。翰捎肨RIzol法。小皿中加入4 ℃的TRIzol 1 mL，然后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，在室溫下放置5 min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離；然后加入0.2 mL氯仿，蓋緊離心管管蓋，用手上下振蕩15 s，溶液呈乳白狀，無(wú)分層現(xiàn)象；室溫靜置3 min后，4 ℃下以12 000 r/min離心15 min；取出離心管，樣品分為無(wú)色的上清水相、中間的白色層及粉紅色的下層有機(jī)相。小心吸取無(wú)色上清水相，移至另一離心管；向得到的上清水相加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10 min；4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，小心去除上清；緩慢沿管壁加入75%乙醇(用DEPC處理過(guò)的水配制)1 mL，輕輕混勻。4 ℃下以12 000 r/min離心10min，小心吸盡上清；室溫干燥沉淀5 min，加入30～50 μL的無(wú)RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-70 ℃保存。②RNA純度測(cè)定及定量：取RNA樣品，用Buffer稀釋100倍，測(cè)定樣品在260 nm和280 nm的OD值確定RNA的質(zhì)量。計(jì)算公式：RNA濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×0.04 μg/μL。比色皿光徑1 cm，OD260/OD280在1.8～2.1可進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。③cDNA的合成：反應(yīng)液的配制按說(shuō)明書進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min (反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)) ，85 ℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)) ，合成第一鏈cDNA。④熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)：引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。CCL20上游引物為5′-ACCTCTGCGGCGAATCAGAA-3′,下游引物為5′- GATAGCATTGATGTCACAGCCTTCATT-3′，擴(kuò)增片段為134 bp；內(nèi)參照β-action上游引物為 5′-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′，下游引物為5′-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3′，擴(kuò)增片段為132 bp。RT-PCR反應(yīng)液的配制按說(shuō)明書進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL 。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，循環(huán)40次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCT計(jì)算，以CCL20 與β-actin 的比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組HaCaT 細(xì)胞上清液CCL20水平比較 A、B、C、D、E、F組HaCaT細(xì)胞上清液CCL20水平分別為(97.72±1.86)、(159.43±7.09)、(147.05±2.25)、(138.60±8.04)、(126.66±7.04)、(114.39±3.90)pg/mL，B、C、D、E、F組HaCaT細(xì)胞上清液CCL20水平均高于A組(P均<0.05)，D、E、F組HaCaT細(xì)胞上清液CCL20水平均低于B組(P均<0.05)，C、D組HaCaT細(xì)胞上清液CCL20水平均低于F組(P均<0.05)。

2.2 各組HaCaT細(xì)胞CCL20 mRNA表達(dá)比較 A、B、C、D、E、F組HaCaT細(xì)胞CCL20 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.91±0.08、7.22±0.32、4.95±0.33、2.79±0.19、1.79±0.49、1.80±0.47，B、C、D、E、F組HaCaT細(xì)胞CCL20 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于A組(P均<0.05)，D、E、F組HaCaT細(xì)胞中CCL20 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于B組(P均<0.05)，C、D組HaCaT細(xì)胞CCL20 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于F組(P均<0.05)。

3 討論

Th17細(xì)胞作為影響銀屑病發(fā)生發(fā)展的重要T細(xì)胞廣受關(guān)注，其向皮損遷移浸潤(rùn)是銀屑病最先發(fā)生的過(guò)程[8]。IL-17是Th17細(xì)胞特異產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的致炎效應(yīng)，也可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生各種趨化因子。CCL20是IL-17誘導(dǎo)分泌的重要趨化因子，其特異性受體CCR6多表達(dá)于Th17細(xì)胞中的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞[9]。CCL20與CCR6的惟一選擇性保證了CCR6陽(yáng)性細(xì)胞即Th17細(xì)胞準(zhǔn)確遷移定位至皮損部位[10]。CCL20特異性募集Th17細(xì)胞，也可誘導(dǎo)其增殖活化分泌大量促炎因子IL-17、IL-22、TNF-α等；這些炎性因子也可以被CCL20募集至皮損部位，并且可以刺激角質(zhì)細(xì)胞異常增殖并釋放更多細(xì)胞因子,以活化T細(xì)胞[4，5，11]?；罨蟮腡細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可通過(guò)影響增殖及凋亡調(diào)控基因的表達(dá)，再次影響角質(zhì)細(xì)胞的增生，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生發(fā)展[1]。研究表明，IL-17顯著增加CCL20的表達(dá), 具有劑量和時(shí)間依賴性[5]。在正常角質(zhì)形成細(xì)胞中CCL20低水平表達(dá)，而CCL20在銀屑病皮損中呈高表達(dá)，皮損越嚴(yán)重表達(dá)程度越高[5，11]。本次實(shí)驗(yàn)以IL-17作為誘導(dǎo)因子介導(dǎo)永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)分泌CCL20模擬銀屑病體外實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)易模型。現(xiàn)代醫(yī)家總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為銀屑病常由“血”論治，常治以清熱涼血法。宋坪等[7]提出從“玄府”論治新觀點(diǎn)，在治療上采用“開(kāi)通玄府法”治療斑塊狀銀屑病，常用藥物麻黃、桂枝等，治療銀屑病也取得一定成效。我們?cè)谇捌谘芯恐幸炎C實(shí)，單藥麻黃可以拮抗小鼠銀屑病樣模型的發(fā)生[12]。麻黃堿作為麻黃的主要成分，分子量較小，易溶于水、乙醇等溶劑，較為穩(wěn)定，并且有研究表明其具有較強(qiáng)發(fā)汗作用[13]。本研究將麻黃堿溶于pH適宜的PBS中，并且分成800、1 200、1 600 μg/mL的濃度分別干預(yù)IL-17誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞，為“汗法”治療銀屑病的體外實(shí)驗(yàn)提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。MTX在臨床運(yùn)用治療銀屑病得到廣泛應(yīng)用，取得較好療效[14]。其藥理學(xué)作用主要是競(jìng)爭(zhēng)性抑制四氫葉酸在胸腺嘧啶合成過(guò)程中傳遞甲基的作用，以阻止細(xì)胞周期中DNA的合成，可以影響銀屑病中角質(zhì)細(xì)胞異常增殖達(dá)到治療目的；也有研究發(fā)現(xiàn)，MTX可以抑制體內(nèi)淋巴細(xì)胞的增殖活化[15]；另有部分學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，其可能在抑制T細(xì)胞活化并且抑制活化后趨化因子的生成以阻斷銀屑病惡性循環(huán)的免疫效應(yīng)有重要作用[16，17]。因此，本次實(shí)驗(yàn)參考以往文獻(xiàn)[18]及前期實(shí)驗(yàn)以50 μg/mL MTX干預(yù)IL-17誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞作為陽(yáng)性參照組。

本次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用ELISA測(cè)定麻黃堿、MTX干預(yù)IL-17誘導(dǎo)的細(xì)胞分泌CCL20，結(jié)果表明IL-17能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞分泌CCL20，麻黃堿能依賴濃度抑制這一效應(yīng)，MTX也能達(dá)到明顯地抑制效果，且MTX的抑制效應(yīng)比低、中濃度的麻黃堿強(qiáng)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與此相一致：IL-17能夠提升HaCaT細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平，麻黃堿隨著濃度的增加抑制效應(yīng)更強(qiáng)；MTX能夠明顯地抑制其表達(dá)水平，并且比低、中濃度麻黃堿平均表達(dá)水平低。此結(jié)果表明，IL-17能夠明顯提高HaCaT細(xì)胞分泌CCL20的能力，MTX作為臨床療效確切的藥品能夠明顯抑制其分泌能力，與既往研究相符[18]。低濃度與中濃度的麻黃堿雖然沒(méi)有MTX的抑制效應(yīng)強(qiáng)，但是從三組不同濃度麻黃堿的比較來(lái)看，隨著麻黃堿的濃度升高，HaCaT細(xì)胞分泌CCL20的水平、CCL20 mRNA相對(duì)表達(dá)量越來(lái)越低。這表明麻黃堿能夠抑制IL-17誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞分泌CCL20，提示麻黃堿可能在抑制銀屑病活化Th17細(xì)胞及其分泌趨化分子這一環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)為麻黃組成方有效治療銀屑病提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為“汗法”治療銀屑病提供理論基礎(chǔ)。

[1] Zaba LC, Fuentesduculan J, Eungdamrong NJ, et al. Psoriasis is characterized by accumulation of immunostimulatory and Th1/Th17 cell polarizing myeloid dendritic cells [J]. J Investi Dermatol, 2009,129(1):79-88.

[2] Romagnani S. Human Th17 cells[J]. Arthritis Res Ther, 2008,10(2):206.

[3] Kim TG, Byamba D, Wu WH, et al. Statins inhibit chemotactic interaction between CCL20 and CCR6 in vitro: possible relevance to psoriasis treatment[J]. Exp Dermatol, 2011,20(10):855-857.

[4] Muhr P, Renne J, Schaefer V, et al. Primary human keratinocytes efficiently induce IL-1-dependent IL-17 in CCR6+T cells[J]. Exp Dermatol, 2010,19(12):1105-1107.

[5] Harper EG, Guo C, Rizzo H, et al. Th17 cytokines stimulate CCL20 expression in keratinocytes in vitro and in vivo: implications for psoriasis pathogenesis[J]. J Investi Dermatol, 2009,129(9):2175-2183.

[6] 王建茹,唐雪勇,楊志波,等.芻議汗法與尋常型銀屑病治療[J].中醫(yī)雜志,2014,55(5):444-445.

[7] 宋坪,王曉旭,楊茂譽(yù),等.開(kāi)通玄府、通絡(luò)解毒法治療斑塊狀銀屑病120例療效觀察[J].中醫(yī)雜志,2013,54(17):1476-1479.

[8] Li Q, Ke F, Zhang W, et al. Plasmin plays an essential role in amplification of psoriasiform skin inflammation in mice[J]. PLoS One, 2011,6(2):e16483.

[9] Singh SP, Zhang HH, Foley JF, et al. Human T cells that are able to produce IL-17 express the chemokine receptor CCR6[J]. J Immunol, 2008,180(1):214-221.

[10] Mabuchi T, Chang TW, Quinter S, et al. Chemokine receptors in the pathogenesis and therapy of psoriasis[J]. J Dermatol Sci, 2012,65(1):4-11.

[11] Homey B, DieuNosjean MC, Wiesenborn A, et al. Up-regulation of macrophage inflammatory protein-3 alpha/CCL20 and CC chemokine receptor 6 in psoriasis[J]. J Immunol, 2000,164(12):6621-6632.

[12] 郭順,時(shí)樂(lè),閆小兵,等.麻桂湯對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損的干預(yù)研究[J].中藥材,2014,37(6):1049-1052.

[13] 王艷宏,王秋紅,夏永剛,等.麻黃化學(xué)拆分組分的性味藥理學(xué)評(píng)價(jià)——化學(xué)拆分組分的制備及其解熱作用的研究[J].中醫(yī)藥信息,2011,28(5):7-10.

[14] 李常興,張錫寶,吳志華.甲氨蝶呤與銀屑病[J].皮膚性病診療學(xué)雜志,2004,11(2):200-203.

[15] Saporito FC, Menter MA. Methotrexate and psoriasis in the era of new biologic agents[J]. J Am Acad Dermatol, 2004,50(2):301-309.

[16] 梁漢昌,范雪金,梁福貴.甲氨蝶呤抑制尋常型銀屑病患者外周血MMP-9及VEGF的表達(dá)[J].實(shí)用藥物與臨床,2010,13(2):93-95.

[17] 張錫寶,李常興,何玉清,等.甲氨蝶呤對(duì)銀屑病患者皮損T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ mRNA影響的研究[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,2005,19(10):592-594.

[18] 張錫寶,彭振輝,曹振平.MTX對(duì)正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖的作用及影響[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,2003,17(6):371-373.

Effect of ephedrine on CCL20 secretion of IL-17-induced immortalized human keratinocytes (HaCaT)

JIANGYan1,GUOShun,ZOUYue,CHENLi

(1FirstClinicalMedicalCollegeofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Objective To observe the effect of ephedrine on CCL20 secretion of IL-17-induced immortalized human keratinocytes (HaCaT).Methods HaCaT cells were randomly divided into 6 groups.Cells in the group A were only treated by DMEM. Cells in the group B were treated with 20 ng/mL IL-17 nutrient solution. Cells in the groups C, D and E were treated with 800, 1 200 and 1 600 μg/mL ephedrine medium including 20 ng/mL IL-17. Cells in the group F were treated with 20 ng/mL IL-17 combined with 50 μg/mL MTX culture medium. After 36 h, ELISA was performed to determine the expression of CCL20 protein. RT-PCR was used to assess the expression of CCL20 mRNA. Results The expression levels of CCL20 protein in the cultural supernatant of HaCaT cells of groups A, B, C, D, E and F were (97.72±1.86), (159.43±7.09), (147.05±2.25), (138.60±8.04), (126.66±7.04), (114.39±3.90) pg/mL, respectively. The relative CCL20 mRNA expression in HaCaT cells of groups A, B, C, D, E, F were 0.91±0.08, 7.22±0.32, 4.95±0.33, 2.79±0.19, 1.79±0.49, 1.80±0.47, respectively. Groups B, C, D, E and F were higher than group A (allP<0.05); groups D, E, F were lower than group B (allP<0.05); groups C and D were lower than group F (all P<0.05).Conclusion Ephedrine can inhibit the CCL20 secretion of IL-17-induced HaCaT cells, and it provides a theoretical basis for the treatment of psoriasis by ephedrine or even diaphoresis.

ephedrine; chemotactic factor; CCL20; interleukin-17; psoriasis; immortalized human keratinocytes

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81603626)；江蘇省中醫(yī)院院級(jí)課題(Y14020)。

蔣燕(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)殂y屑病。E-mail： jiangyan20088@126.com

陳力(1960-)，女，碩士生導(dǎo)師，教授，主任醫(yī)師,主要研究方向?yàn)轲畀徏般y屑病等。E-mail： wandyyf@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.007

R285.5

A

1002-266X(2017)10-0024-04

2016-11-15)