劉建軍，鄭世睿，姚舒婷，彭志勤，萬軍民，王秉，胡智文

(1.浙江理工大學材料與紡織學院，杭州 310018；2. 山東英利實業(yè)有限公司，山東濰坊 262700)

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可逆交聯(lián)聚電解質微膠囊的制備及表征

劉建軍1，鄭世睿2，姚舒婷1，彭志勤1，萬軍民1，王秉1，胡智文1

(1.浙江理工大學材料與紡織學院，杭州 310018；2. 山東英利實業(yè)有限公司，山東濰坊 262700)

微膠囊在醫(yī)藥、食品、化妝品、日用品等行業(yè)都有重要應用，其中作為緩釋載體的智能降解型微膠囊受到人們越來越多的關注。以MnCO3微粒為模板，采用聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)作為壁材，通過層層自組裝(LBL)方法得到二硫鍵交聯(lián)的聚電解質微膠囊，并對該微膠囊的形貌和化學結構進行了表征分析。結果表明：制備得到微膠囊粒徑分布均勻，大小在2.40 μm左右，壁厚約為55.25 nm；具有一定的機械強度，在高濃度的聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)溶液中會發(fā)生可逆彈性形變；傅里葉紅外光譜顯示，PAH中的部分氨基已經(jīng)與交聯(lián)劑3,3′-二硫代二丙酸(DPA)中的羧基在EDC/NHS 存在的條件下發(fā)生了交聯(lián)反應，從而形成了比較穩(wěn)定的囊壁結構。

微膠囊；緩釋；模板法；層層自組裝；可逆交聯(lián)

0 引 言

微膠囊是一種以天然或人工合成高分子作為囊壁材料組成的微型中空結構容器或者包裝物。微膠囊的內(nèi)部既可以是中空的，也可以用來填充內(nèi)容物，所以通常用來包埋小分子藥物、多肽、蛋白質、核酸等物質，從而降低外界環(huán)境對包埋物的影響[1-5]。如今，微膠囊作為一種有效載體，在藥物控釋、基因傳遞、靶向治療等方面受到廣泛關注[6-7]。

近年來，微膠囊的新型制備技術不斷涌現(xiàn)，例如：多流體復合電噴法、層層自組裝法、懸浮聚合法、模板法等[8-12]。其中，模板-層層自組裝法制備得到的微膠囊具有尺寸可控、囊壁材料選擇多樣、易引入功能基團從而賦予微膠囊智能響應的優(yōu)點。囊壁材料的選擇會影響到微膠囊的緩釋、流動、溶解、滲透等性能。根據(jù)細胞及生物體內(nèi)外環(huán)境的不同，制備在體外保持結構穩(wěn)定、在體內(nèi)pH或者酶的作用下可以降解的微膠囊，對于闡明膠囊材料在體內(nèi)的變化機制，實現(xiàn)藥物的有效傳遞具有重要價值[7,13-16]。

本文設計和構建一種二硫鍵可逆交聯(lián)聚電解質微膠囊，該膠囊以MnCO3微粒為模板，聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)作為壁材，通過層層自組裝方法得到。本文利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)、原子力顯微鏡(AFM)、激光共聚焦顯微鏡(CLSM)和傅里葉變換紅外光譜(FTIR-ATR)等測試方法系統(tǒng)表征了微膠囊的形貌和化學結構，為其在生物醫(yī)用領域的應用提供理論指導。

1 實 驗

1.1 實驗試劑

聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH，Mw ≈ 65 kD)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、熒光素異硫氰酸酯(FITC)、一水合硫酸錳(MnSO4·H2O)、碳酸氫銨(NH4HCO3)、3,3′-二硫代二丙酸 (3,3′-Dithiodipropionic acid，DPA)、氯化鈉(NaCl)、N-羥基丁二酰亞胺(1-hydroxy-2,5-pyrrolidinedione，NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)、聚苯乙烯磺酸鈉(Poly(sodium-p-styrenesulfonate)，PSS，Sigma-Aldrich公司) ，試劑均為分析純；實驗用水為經(jīng) Milli-Q water system(millipore，USA)過濾的超純水。

1.2 MnCO3微粒模板的制備

將適量的NH4HCO3和MnSO4·H2O溶于超純水中，分別配制成0.20 mol/L和0.02 mol/L的NH4HCO3和MnSO4溶液備用。取400 mL MnSO4溶液置于2 L燒杯中，向其中加入80 mL無水乙醇，用高速磁力攪拌器攪拌使其混合均勻。在磁力攪拌器攪拌下向燒杯中迅速加入400 mL NH4HCO3溶液，持續(xù)攪拌5 min，然后靜置10 min使其反應沉淀，直至生成的所有微粒粒子完全沉淀。用高速離心法快速收集微粒粒子，并用超純水洗滌3次，最后按照一定比例分散在超純水中備用。

1.3 層層自組裝法制備中空微膠囊

自組裝溶液的配制：準確稱取29.25 g NaCl溶于適量超純水中，待溶解完全，轉移至1 L容量瓶中，定容，得0.50 mol/L的NaCl溶液，用NaOH溶液調節(jié)pH至10備用；稱取2.00 g PAH溶于適量NaCl溶液中，完全溶解后于1 L容量瓶中定容，得2.00 g/L PAH溶液備用；準確稱取0.41 g的DPA，0.37 g的EDC和0.22 g的NHS加入到加入適量超純水，攪拌使其完全溶解，轉移溶液至1 L容量瓶中，定容，得到0.1%的DPA-EDC-NHS溶液備用。

微膠囊的制備：模板-層層自組裝法制備微膠囊示意圖如圖1所示。取適量上述步驟中制備的MnCO3微粒模板(微粒凈重約500～1000 mg)置于50 mL離心管中，用超純水洗滌3次，離心后去上清液并收集微粒。向離心管內(nèi)加入30 mL 2 mg/mL的PAH溶液，使微粒重新分散，孵育30 min，然后以3000 r/min的轉速離心3 min，去上清，用超純水洗滌3次。將組裝有一層PAH的微粒重新分散至30 mL的0.1%的DPA-EDC-NHS溶液中，孵育30 min，然后3000 r/min 下離心3 min，去上清，超純水洗3次。重復以上自組裝過程4 次，最后得到核殼結構的膠體微粒，其組成為MnCO3@(PAH/DPA)4。將此核殼結構的膠體微粒用0.1 M 的鹽酸處理10 min，期間輕微振蕩離心管以保持粒子懸浮。3000 r/min 離心5 min，去上清。然后加入0.01 M的EDTA 溶液離心洗滌3次，除去Mn2+。再用超純水洗滌3次，得到組成為(PAH/DPA)4的微膠囊。

圖1 模板-層層自組裝法制備微膠囊示意圖

1.4 微膠囊的表征

1.4.1 場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)分析

將制得的MnCO3模板微粒和微膠囊分別均勻分散在超純水溶液中(濃度約為1× 106個/mL)，用微量移液器吸取20 μL懸浮液滴加到潔凈的硅片上，在37 ℃條件下烘干。采用FE-SEM (Hitachi，S4800)在1 kV電壓下觀察模板微粒和微膠囊的表面形貌。

1.4.2 原子力顯微鏡(AFM)分析

將制備得到的(PAH/DPA)4微膠囊加入到20%的PSS溶液中，渦旋30 min使其分散均勻。用微量移液器吸取20 μL懸浮液滴加至潔凈硅片上，在37 ℃條件下烘干，采用AFM(PSIA，XE-100E)觀察。

1.4.3 激光共聚焦顯微鏡(CLSM)分析

量取一定體積的微膠囊懸浮液，與等體積的100 μg/mL的熒光染料FITC溶液混合，振蕩反應過夜，以3000 r/min的轉速離心洗滌3次，得到FITC標記的微膠囊。取適量FITC標記的微膠囊均勻分散于超純水和20%(w/w)的PSS溶液中(濃度約為1× 106個/mL)，分別取1 mL 微膠囊滴到兩個潔凈的35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，采用激光共聚焦顯微鏡(徠卡，SP5)分別進行觀察。

1.4.4 傅里葉變換紅外光譜(FTIR-ATR)測定

取適量PAH和DPA粉末以及冷凍干燥后的(PAH/DPA)4微膠囊粉末分別和純溴化鉀(KBr，Sigma)混合壓片，采用傅里葉紅外變換光譜儀(ThermoElectron，Nicolet5700)對樣品進行紅外光譜分析，掃描范圍為4000 ～ 500 cm-1，分辨率4 cm-1。

2 結果與討論

圖2(a)為通過模板法制備得到的MnCO3微粒的掃描電鏡圖。根據(jù)Image J軟件統(tǒng)計測量，MnCO3微粒的粒徑為(1.9±0.2) μm。微粒呈現(xiàn)規(guī)整的球形形貌，尺寸分布比較均勻，是理想的微膠囊制備模板。從單個MnCO3微粒的放大圖可以看出，微粒表面形貌比較粗糙，存在一些尖錐狀微結構。圖2(b)為層層自組裝并且去除MnCO3微粒模板后得到微膠囊的掃描電鏡圖。與常見的微膠囊不同，(PAH/DPA)4微膠囊在干態(tài)下并未發(fā)生塌陷，而是保持良好的球形。由于微膠囊本身呈中空狀態(tài)，推測該微膠囊的囊壁具有較高的機械強度。此外，與MnCO3微粒模板相比，微膠囊的尺寸略有增大((2.4±0.2) μm)，表面呈現(xiàn)凹凸形態(tài)，這是由于層層自組裝過程中壁材組裝不均勻造成的。

圖2 MnCO3微粒和微膠囊的場發(fā)射掃描電鏡圖

圖3為(PAH/DPA)4微膠囊分散于20%的PSS溶液中干燥后所得樣品的原子力顯微圖像。從圖3中可以看出，微膠囊表面呈現(xiàn)褶皺形貌，這是由于在高滲透壓條件下，囊壁的機械強度無法支撐膠囊結構產(chǎn)生形變，進而在干燥后塌陷，并且塌陷后的微膠囊直徑有所增加，同時也說明微膠囊內(nèi)部的MnCO3微粒模板已被除去。通過AFM圖像的剖面圖中最低處與基底之間的高度差，可以得到微膠囊壁厚為(55.25±1.62) nm。相比光滑平面上PAH/DPA多層膜的厚度有所增加，這是因為MnCO3模板粗糙表面可以吸附聚電解質的量更多，從而生成更厚的膜[17]。

圖3 微膠囊的原子力顯微鏡圖

圖4為FITC熒光標記的(PAH/DPA)4微膠囊的熒光共聚焦顯微鏡圖。從圖4(a)可以看出(PAH/DPA)4微膠囊在超純水中具有良好的分散性，沒有明顯團聚的現(xiàn)象。由于在水中存在一定的溶脹，使得水溶液中的微膠囊粒徑比干燥狀態(tài)下粒徑略大。圖4(b)是微膠囊在20%濃度的PSS溶液中的圖像，對比圖4 (a)可以證明微膠囊在高濃度的PSS溶液中存在明顯的形變現(xiàn)象，這是由于PSS溶液滲透壓較大，使得微膠囊受到壓迫而變形，同時也佐證了原子力顯微圖像得出的假設。

圖4 微膠囊的激光共聚焦顯微鏡圖像

圖5是PAH、DPA和(PAH/DPA)4成型微膠囊的紅外譜圖，其中：譜線a是PAH；譜線b是DPA；譜線c是(PAH/DPA)4。從PAH的譜線中可以看出，PAH 的O-H吸收帶和C-H吸收帶比較復雜，其伸縮振動峰分別出現(xiàn)在3444 cm-1和2973 cm-1附近，且峰寬較寬。1604 cm-1和1511 cm-1處分別為C-C鍵的伸縮振動峰和C-H鍵的變形振動峰；從DPA 的譜線中可以看出，在3216 cm-1和2927 cm-1處分別為O-H 和C-H 的伸縮振動峰，1747 cm-1處為C=O 的伸縮振動峰，1180 cm-1處為CH2的非平面搖擺振動峰，1376 cm-1處出現(xiàn)COO-對稱伸縮振動峰，871 cm-1處為C-C 的伸縮振動峰，750 cm-1和667 cm-1處分別為C-S 和S-S 的伸縮振動峰；(PAH/DPA)4微膠囊的譜線，結合DPA和PAH的譜線可以看出，在微膠囊中部分振動峰的位置發(fā)生偏移，這是因為PAH中的氨基發(fā)生交聯(lián)和微環(huán)境的改變導致。其中，在3430 cm-1和2921 cm-1處分別出現(xiàn)O-H和C-H的伸縮振動峰，1510 cm-1處為酰胺鍵的伸縮振動峰，1402 cm-1為C-N的伸縮振動峰，748 cm-1處為C-S 伸縮振動峰，說明PAH中的部分氨基已經(jīng)與DPA 中的羧基在EDC和NHS 存在的條件下發(fā)生了反應相結合，從而形成了比較穩(wěn)定的囊壁結構。

圖5 微膠囊及囊壁材料的紅外圖譜

3 結 論

采用模板-層層自組裝法制備了一種可逆交聯(lián)的聚電解質微膠囊。研究表明，以MnCO3微粒作為模板，PAH和DPA通過交聯(lián)反應可制得具有穩(wěn)定囊壁結構的(PAH/DPA)4微膠囊。該微膠囊尺寸大約為2.40 μm，壁厚約為55.25 nm，且在水中具有良好的分散性；具有一定的機械強度，在高濃度的聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)溶液中會發(fā)生彈性形變；傅里葉紅外光譜結果表明該微膠囊形成了比較穩(wěn)定的囊壁結構。該微膠囊大小適宜，所用囊壁材料具有良好的生物相容性，而且交聯(lián)反應具有可逆性，在藥物傳遞載體及控制釋放等生物醫(yī)用領域具備良好的應用前景。

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(責任編輯： 唐志榮)

Preparation and Characterization of Reversible Crosslinked Polyelectrolyte Microcapsules

LIUJianjun1,ZHENGShirui2,YAOShuting1,PENGZhiqin1,WANJunmin1,WANGBing1,HUZhiwen1

(1.College of Materials and Textiles, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China; 2. Shandong Yingli Industrial Co.,Ltd., Weifang 262700, China)

Microcapsules have been widely used in medicine, food, cosmetics and daily necessities. Especially, the smart degradable microcapsules which served as carriers for controlled release of drugs, DNA, RNA and proteins have got more and more attentions. In this paper, a novel disulfide bond cross-linking degradable polyelectrolyte microcapsule was prepared via layer-by-layer (LBL) method. MnCO3microparticles and 3,3′-Dithiodipropionic acid (DPA) were employed as templates and wall materials, respectively. The results show that the microcapsules have uniform shape:the size is approximately 2.40 μm while the wall thickness is 55.25 nm. The SEM and AFM results show that the microcapsules have mechanical strength to some extent and occurred reversible deformation. The FTIR results also indicate that the amino groups of PAH can partially cross-link with carboxy groups of DPA in the presence of EDC/NHS, leading to the formation of stable walls of microcapsules.

microcapsule; controlled-release; template method; layer-by-layer self-assembly; reversible crosslinked

10.3969/j.issn.1673-3851.2017.07.020

2016-10-30 網(wǎng)絡出版日期： 2017-01-19

國家自然科學基金項目(51603188)；浙江省自然科學基金項目(LQ15E030004)；浙江理工大學科研啟動基金項目(13012141-Y)

劉建軍(1990-)，男，江蘇南京人，碩士研究生，主要從事生物醫(yī)用材料方面的研究。

胡智文，E-mail：zstu17526@126.com

TB34

A

1673- 3851 (2017) 04- 0587- 05