陳廣福

銀杏達(dá)莫預(yù)處理對乳鼠離體腦片谷氨酸損傷的保護作用

陳廣福

目的 探討銀杏達(dá)莫預(yù)處理對乳鼠離體腦片谷氨酸損傷的保護機制。方法 取出生7天的SD乳鼠腦皮質(zhì)制備離體腦片，用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色判斷腦片活性后按隨機法分為正常對照組（A組）、谷氨酸（Glu）損傷組（B組）、銀杏達(dá)莫預(yù)處理損傷組（C組），C組于培養(yǎng)3天時進行藥物預(yù)處理24 h（銀杏達(dá)莫注射液濃度為40μg/ml）；腦片培養(yǎng)至4天時用1 mmol/L Glu復(fù)制損傷模型，損傷30 min后將3組轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)液中孵育至7天。A組不予任何處理。觀察腦片細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，尼氏小體計數(shù)，碘化丙啶（PI）染色比例。結(jié)果 （1）腦片形態(tài)學(xué)觀察：3天肉眼可見腦片輕度水腫，3～5天水腫逐漸消失，6天鏡下見典型的神經(jīng)細(xì)胞及少量膠質(zhì)細(xì)胞；7天細(xì)胞生長最旺盛，之后凋亡逐漸占據(jù)主導(dǎo)。（2）蘇木素-伊紅（HE）染色觀察細(xì)胞形態(tài)：A組神經(jīng)元呈多邊或梭形；B組較A組明顯減少；C組神經(jīng)元數(shù)量介于A組與B組之間，且組間存在差異。（3）尼氏體染色：A組尼氏小體清晰可見；B組尼氏小體陽性細(xì)胞數(shù)較A組明顯減少，而C組介于A組與B組之間，（4）PI（碘化丙啶）染色：A組細(xì)胞幾乎全部呈現(xiàn)胞核紅色熒光；B組熒光明顯減少、C組大量神經(jīng)元出現(xiàn)熒光，輪廊不清。結(jié)論 銀杏達(dá)莫預(yù)處理對乳鼠離體腦片的Glu損傷有保護作用。

腦片；預(yù)處理；銀杏達(dá)莫；保護作用

當(dāng)前缺血損傷機制和缺血性損傷的“瀑布效應(yīng)”是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的熱點之一，主要與腦細(xì)胞鈣超載、氧自由基的損害、能量耗竭、酸中毒、興奮性氨基酸的毒害作用有關(guān)[1]，既往研究結(jié)果表明，在腦缺血不同時間窗口期應(yīng)用神經(jīng)保護劑促進損傷組織向正常組織修復(fù)轉(zhuǎn)化，腦組織藥物預(yù)處理是通過藥物激發(fā)或模擬機體自身內(nèi)源性保護物質(zhì)而出現(xiàn)腦保護效應(yīng)，這可能與國外報道中講述的細(xì)胞胞體與軸突的損傷惡性循環(huán)有關(guān)[2]。目前銀杏達(dá)莫的腦保護作用受到國內(nèi)外的關(guān)注，相關(guān)實驗主要在神經(jīng)細(xì)胞和在體動物中展開，然而在離體腦片水平的研究少見報道。因此，本研究采用皮質(zhì)腦片培養(yǎng)建立谷氨酸（Glu）損傷模型，從腦片水平研究藥物的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

選擇出生7天的SD乳鼠，動物合格證號：SCJK（閩）2016-002。DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Hyclone公司），銀杏達(dá)莫注射液（批號H52020032貴州益佰制藥股份有限公司），其余染色試劑[碘化丙啶（PI）日本Solarbio公司]均為市售分析純試劑。

1.2 乳鼠皮質(zhì)腦片體外培養(yǎng)

參照本課題組前期報道方法體外培養(yǎng)SD乳鼠皮質(zhì)腦片。將乳鼠去腦殼取腦，剝除軟腦膜，切成400～500μm腦片，一部分用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色，一般均為紅色，若出現(xiàn)淡染區(qū)將這批腦片丟棄不用，將腦片活性好的放入6孔板內(nèi)培養(yǎng)，保持腦片在氣液界面上生長，第2天換液1次，以后每2天換1次，每次換液1.2 ml。腦片培養(yǎng)基成分：DMEM/F-12培養(yǎng)液85 ml+滅活無菌胎牛血清15 ml+雙抗溶液（10 kU/ml青霉素和10 kU/ml鏈霉素）1 ml，調(diào)節(jié)pH值至7.4。本實驗動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 實驗分組與模型的建立

將生長至3天的腦片按隨機數(shù)字表法分為正常對照組（A組）、Glu損傷組（B組）、銀杏達(dá)莫預(yù)處理損傷組（C組）3組，每組12片。B組、C組分別采用1mmol/L Glu建立損傷模型，C組于損傷前給予40μg/ml銀杏達(dá)莫預(yù)處理24 h。各組操作完畢移入正常培養(yǎng)液中繼續(xù)孵育至7天。A組不給予任何處理。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 腦片形態(tài)學(xué)觀察 每次換液前在倒置顯微鏡觀察腦片活性、生長狀況及污染情況。

1.4.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 石蠟切片脫蠟后進行HE染色。在倒置顯微鏡下觀察3組腦片細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.4.3 尼氏體染色 石蠟切片脫蠟后用1.2%甲苯胺藍(lán)染色，中性樹膠封片。每組選5張切片，在高倍視野下隨機取不重疊的5個視野，計數(shù)尼氏小體。

1.4.4 PI染色 取各組培養(yǎng)至7天的腦片，在培養(yǎng)液中加入50 μL的PI溶液染色30 s，熒光顯微鏡下（40×物鏡，6.4×目鏡）觀察各組腦片細(xì)胞的紅染色比例。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 腦片形態(tài)學(xué)觀察

培養(yǎng)3天肉眼見腦片微水腫，邊緣變薄呈半透明，貼于透膜上，鏡下見腦片中心出現(xiàn)少量自然凋亡細(xì)胞；3～5 天水腫逐漸消失，邊緣細(xì)胞逐漸增多，形態(tài)不典型；6天鏡下見較多典型的神經(jīng)細(xì)胞；7天細(xì)胞生長達(dá)到高峰。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

A組腦片細(xì)胞層次清楚，HE染色后神經(jīng)元呈梭形或多棱形，數(shù)量較多，膜完整，胞體紅染，胞核清晰，形狀不規(guī)則的膠質(zhì)細(xì)胞圍繞細(xì)胞周邊（圖1a）；B組腦片不清晰，染色后細(xì)胞數(shù)量較A組明顯減少，胞膜邊緣不清，多數(shù)胞核固縮，細(xì)胞水腫，部分胞體見脫核現(xiàn)象，呈空泡樣或皺縮變形（圖1b）；C組神經(jīng)元數(shù)量介于A組與B組之間，大多細(xì)胞形態(tài)典型，部分細(xì)胞出現(xiàn)水腫，胞膜較完整，未見細(xì)胞脫核，胞質(zhì)紅染較為均勻（圖1c）。

圖1a

圖1b

圖1c

2.3 尼氏體染色結(jié)果

尼氏體染色結(jié)果見圖2、表1：A 組染色后尼氏小體清晰可見，神經(jīng)元數(shù)量多（圖2a）；B 組染色后陽性細(xì)胞數(shù)較A 組明顯減少（均P＜0.05），尼氏小體丟失現(xiàn)象，形狀變異大，染色后胞質(zhì)出現(xiàn)空泡（圖2b）；C組染色后尼氏小體數(shù)量較B 組明顯增多，尼氏小體聚集在細(xì)胞核周圍，染色均一，尼氏小體丟失現(xiàn)象，出現(xiàn)胞質(zhì)空泡（圖2c）。

圖2a

圖2b

圖2c

表1 各組腦片尼氏體細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)比較

2.4 PI染色結(jié)果

圖3a

圖3b

圖3c

A 組熒光顯微鏡下觀察，熒光紅色顯色少，零星出現(xiàn)幾個紅色熒光點，死亡和凋亡細(xì)胞數(shù)量少（圖3a）；B組大面積出現(xiàn)熒光紅色散點圖，紅色熒光點密度密集，說明死亡和凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多（圖3b）；C組出現(xiàn)熒光紅色散點圖有所減少，紅色熒光點密度稀薄，介于A組和B組之間，死亡和凋亡細(xì)胞數(shù)量有所減少（圖3c）。

3 討論

腦缺血再灌注I/R損傷是復(fù)雜的病理過程，包括缺血期原發(fā)性損傷和再灌注期繼發(fā)性損傷，其中細(xì)胞凋亡在繼發(fā)性腦細(xì)胞死亡中起著關(guān)鍵作用。缺血再灌注損傷機制可能[3]：興奮性氨基酸毒性作用；自由基損傷；細(xì)胞內(nèi)鈣超載；能量代謝障礙及酸中毒；細(xì)胞凋亡；炎癥免疫反應(yīng)蛋白酶激活；線粒體功能異常；蛋白合成及基因表達(dá)的變化等等。研究表明，采取適度腦缺血預(yù)處理可改善缺血性損傷所引起的神經(jīng)元損害[4-5]。而藥物的預(yù)處理是在缺血預(yù)處理的理論基礎(chǔ)上，通過藥物模擬缺血預(yù)處理作用，對腦I/R損傷具有保護作用，可減輕炎癥反應(yīng)，激活酶活性，清除自由基，減少鈣超載等[6]，具有很好的臨床研究價值。本實驗采用離體腦片培養(yǎng)，建立相對的藥物損傷預(yù)處理的模式，并根據(jù)I/R的發(fā)病機制中的興奮性氨基酸大量釋放學(xué)說，用高濃度模擬腦缺血建立I/R模型。從檢測酶學(xué)指標(biāo)及形態(tài)學(xué)免疫熒光等觀察比較研究。體外培養(yǎng)的神經(jīng)元可按實驗需要控制其生長條件，便于直接觀察細(xì)胞形態(tài)、生化改變，其培養(yǎng)條件及在科研領(lǐng)域的應(yīng)用已日趨成熟[7]。腦片標(biāo)本實際上是一種短時間離體移植培養(yǎng)的制備技術(shù)兼?zhèn)溆性隗w腦實驗和離體神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的某些特點，現(xiàn)在利用微孔膜培養(yǎng)腦片操作簡單，神經(jīng)元存活時間長并且有良好細(xì)胞反應(yīng)性。在神經(jīng)元代表培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，20世紀(jì)腦片技術(shù)得以發(fā)展，并用于電生理學(xué)、生物化學(xué)、病理生理、藥理學(xué)、分子生物學(xué)等諸多領(lǐng)域，因此國內(nèi)外實驗室被廣泛采用[8]。離體腦片實驗介于整體和細(xì)胞水平之間，既有相對完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間相互關(guān)系，又能在體外人工控制實驗條件[9]。

銀杏達(dá)莫是第四代銀杏葉提取物加入雙嘧達(dá)膜的復(fù)合制劑，主要成分是銀杏黃酮甙、銀杏苦內(nèi)酯、白果內(nèi)酯和雙嘧達(dá)莫等，銀杏達(dá)莫具有拮抗血小板活性因子（PAF），抑制血小板的活化與聚集，降低血粘度；清除氧自由基，防止自由基對神經(jīng)細(xì)胞的損傷，抑制自由基誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡；改善微循環(huán)，增強紅細(xì)胞變形能力，降低血液粘滯度；刺激前列環(huán)素和內(nèi)皮舒張因子，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載；抑制血小板的第一相和第二相聚集，抗血栓形成[10]。目前國外文獻(xiàn)很少有報道銀杏達(dá)莫相關(guān)研究，但是在國內(nèi)有大量的動物實驗和臨床實驗的研究。銀杏達(dá)莫直接保護神經(jīng)元，加強神經(jīng)傳導(dǎo)、加快神經(jīng)遞質(zhì)的更新，改善組織代謝，穩(wěn)定細(xì)胞膜、維持正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，降低缺血粘度、抑制血小板和紅細(xì)胞的高聚集性、增加紅細(xì)胞的變形性，擴張動脈血管、降低血管壁通透性、改善水腫，增強細(xì)胞對缺血缺氧的耐受性。其腦保護作用已經(jīng)得到大量基礎(chǔ)與臨床研究的證實。研究表明，銀杏達(dá)莫可減輕腦I/R 損傷，可選擇性的高效清除細(xì)胞外液中的氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，減輕細(xì)胞膜的損傷[11]。體外研究表明，銀杏達(dá)莫可減輕腦缺血造成的細(xì)胞外谷氨酸的堆積。本實驗采用的銀杏達(dá)莫濃度是以往腦片細(xì)胞損傷保護實驗中的最佳保護濃度。本實驗結(jié)果與損傷組比較，銀杏達(dá)莫預(yù)處理組細(xì)胞存活率有明顯提高，光鏡下細(xì)胞形態(tài)大體正常，尼氏小體丟失減少，PI的紅染比例明顯下降，說明銀杏達(dá)莫可能通過多個方面起到腦保護作用。一方面，銀杏達(dá)莫通過還原作用滅活自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，維持細(xì)胞膜和線粒體功能穩(wěn)定，對I/R 損傷具有保護作用[12]；另一方面，銀杏達(dá)莫抑制興奮性氨基酸介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流，阻斷Glu的興奮性效應(yīng)，起到腦保護作用[13]；同時可抑制線粒體內(nèi)膜的滲透性轉(zhuǎn)運孔道開放，維護線粒體產(chǎn)能，抑制I/R 損傷。有關(guān)具體藥物成分的保護機制有待進一步探討。對于一種損傷，銀杏達(dá)莫預(yù)處理在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、凋亡率、尼氏小體計數(shù)等方面可能存在差異，相關(guān)機制仍需進一步實驗。

綜上所述，銀杏達(dá)莫24 h預(yù)處理皮層腦片可減輕Glu損傷，銀杏達(dá)莫的保護作用其有關(guān)機制尚待進一步研究。

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Protective Effects of Ginkgo Leaf Extract and Dipyridamole Pretreatment on Glutamate Injury in Neonatal Rat Brain Slices

CHEN Guangfu Anesthesiology Department, Fuzhou Second Affiliated Hospital of Xiamen University, Fuzhou Fujian 350007, China

Objective To study the protective mechanism of ginkgo leaf extract and dipyridamole pretreatment on glutamate injury in neonatal rat brain slices. Methods The isolated brain slices of SD rats were collected and stained with 2,3,5-triphenyltetrazole (TTC) to determine the activity of brain slices. The rats were divided into normal control group (group A), glutamate (Glu) injury group (group B), ginkgo leaf extract and dipyridamole pretreatment injury group (group C), group C was cultured for 3 days for 24 hours (ginkgo dipyrass injection concentration of 40μg/Ml). Brain slices were cultured for 4 days and then damaged with 1 mmol/ L Glu. After 30 minutes of injury, the three groups were transferred to normal culture medium for 7 days. Group A did not handle any treatment. To observe the morphological changes of brain cells, the number of Nissl bodies, the ratio of propidium iodide (PI) staining, Results (1) brain tablets morphological observation: 3 days the brain can be seen mild brain edema, 3 to 5 days of edema gradually disappeared, 6 days under the microscope to see the typical nerve cells and a small amount of glial cells; 7 days the most vigorous growth of cells, followed by apoptosis gradually dominated. (2) Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the morphological changes: the neurons in group A were polygonal or fusiform; group B was signifcantly lower than group A; the number of neurons in group C was between group A and group B difference. (3) Nissl body staining: group A neonatal body is clearly visible; B group of Nissl body positive cells than the A group was significantly reduced, and C group between the A group and B group, (4) PI (propidium iodide) Staining in group A showed that red fluorescence was almost all in group A; fluorescence was signifcantly reduced in group B, and fuorescence was observed in large groups of neurons in group C. Conclusion Ginkgo leaf extract and dipyridamole pretreatment had protective effect on Glu injury in neonatal rat brain slices.

brain slices; pretreatment; ginkgo leaf extract and dipyridamole; protective effect

R743

A

1674-9316（2017）16-0146-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．16．080

福建省福州市科技計劃社會發(fā)展項目（2015-S-141-19）

廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院麻醉科，福建 福州 350007