陳強趙翠娟

JNK抑制劑對燒傷后大鼠腸黏膜損傷的影響

陳強1趙翠娟2

目的探討JNK抑制劑對燒傷后大鼠腸黏膜損傷的干預作用及其可能的機制。方法將72只SD大鼠，分為正常對照（C）組8只，燒傷對照（B）組32只，燒傷+SP600125干預（A）組32只。A組與B組給予90℃水燙傷7S，造成30%體表面積Ⅲ度燒傷。A組于燒傷前2小時腹腔注射SP600125，劑量20 mg/kg。A組、B組燒傷后第1天、第3天、第5天、第7天各組分別處死大鼠8只，C組大鼠實驗后第2天處死。采用HE染色法觀察燒傷后大鼠回腸組織形態(tài)學變化；通過流式細胞儀檢測大鼠回腸凋亡率的變化；采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測大鼠回腸中細胞因子IL-6和TNF-a的含量；免疫組織化學染色檢測p-JNK表達。結果與B組相比，A組各時相點回腸黏膜凋亡率均減少，IL-6和TNF-a含量降低，p-JNK表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。結論通過抑制p-JNK表達，可以減少燒傷模型大鼠回腸黏膜組織細胞凋亡，降低炎性介質IL-6和TNF-a含量，從而減輕黏膜組織損傷。

燒傷；c-Jun氨基末端激酶；凋亡；炎癥介質

腸道黏膜屏障是機體正常防御的重要屏障，在腸源性感染的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[1]。研究表明嚴重創(chuàng)傷、燒傷、休克、出血等均可導致腸功能障礙、腸內細菌及毒素移位，進一步加重原發(fā)疾病，誘發(fā)多器官功能障礙及其他重要并發(fā)癥的發(fā)生，這與腸道黏膜上皮損傷、免疫功能紊亂及腸道菌群失調有關[2]。

c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）被磷酸化后可以使許多參與炎癥反應的細胞因子的基因表達，且在調解Thl/Th2免疫細胞的分化中的起到重要作用，并且參與細胞凋亡[3]；本研究采用JNK選擇性抑制劑SP600125抑制JNK的活化，并檢測大鼠回腸黏膜內的P-JNK、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-6（interferon-6，IL-6）以及腸道黏膜上皮細胞凋亡的改變情況，探討SP600125對燒傷后大鼠腸黏膜損傷的干預作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD大白鼠72只，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證編號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 實驗儀器和試劑

流式細胞儀來自內蒙古醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院；IL-6和TNF-a的ELISA試劑盒、p-JNK抗體、SP600125及其他試劑均購自福州邁新公司。

1.3 大鼠燙傷模型的制作及分組

健康SD大鼠72只，雌雄不分，體質量（180±20）g。實驗室標準動物管理及飼養(yǎng)條件，定時供食，自由飲水飼養(yǎng)1周后試驗，隨機分為正常對照（C）組8只，燒傷對照（B）組32只，燒傷+SP600125干預組（A）組32只。C組只給予麻醉和剃毛，不予燒傷。A組與B組給予90℃水燙傷7s，造成30%體表面積Ⅲ度燒傷。傷后各組均給予正常飲食及飲水；干預組（A）于燒傷前2小時腹腔注射SP600125，劑量20 mg/kg，SP600125溶解于二甲亞諷（DMSO）中；B組及C組腹腔注射等體積二甲亞諷。B組及A組燒傷后第1天、第3天、第5天、第7天各組分別處死大鼠8只，C組大鼠實驗后第2天處死。

1.4 實驗觀察

采用HE染色法觀察A、B組燒傷后1天、第3天、第5天、第7天及C組的大鼠回腸組織形態(tài)學變化；通過流式細胞儀檢測A、B組燒傷后1天、第3天、第5天、第7天及C組大鼠回腸凋亡率的變化；采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢A、B組測燒傷后1天、第3天、第5天、第7天及C組大鼠回腸中細胞因子IL-6和TNF-a的含量；大鼠回腸組織標本制作冰凍切片， 進行p-JNK免疫組織化學染色，用JD801形態(tài)學顯微圖像分析系統(tǒng)計算灰度值（IA），IA越高則表示其表達水平越低。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 病理組織學

C組大鼠各時相點腸黏膜結構完整、細胞排列整齊；與C組比較，B組和A組傷后第1天出現不同程度腸黏膜水腫、毛細血管充血，絨毛縮短。傷后第7天，各組腸黏膜組織比較差異最大，B組出現黏膜絨毛壞死、脫落，淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，腸黏膜局部腺體減少，黏膜下明顯充血水腫；與B組比較，A組損傷不同程度減輕，主要表現為絨毛腫脹、黏膜充血水腫，毛細血管充血。

2.2 大鼠回腸黏膜凋亡

與C組相比，A組及B組回腸黏膜凋亡率均增加，第7天最高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與B組相比，A組各時相點回腸黏膜凋亡率均減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 大鼠回腸黏膜IL-6、TNF-a表達

與C組相比，A組及B組大鼠回腸黏膜分泌IL-6、TNF-a的量均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與B組相比，A組各時相點回腸黏膜分泌的IL-6、TNF-a量在傷后均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.4 大鼠回腸黏膜p-JNK的表達

與C組相比，A組及B組回腸黏膜p-JNK的表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與B組相比，干預組各時相點p-JNK均減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

3 討論

嚴重燒傷后可導致胃腸道黏膜損傷，腸道菌群失調，細菌移位，侵入而播散全身發(fā)生“腸源性感染”，甚至可導致全身炎癥反應綜合征（SIRS）和多器官功能障礙（MODS），因而保護燒傷后腸道屏障是燒傷治療整個過程的一個重要環(huán)節(jié)[4]。其中主要的機制包括，嚴重燒傷患者發(fā)生應激反應后全身重要臟器血液重新分布，導致胃腸道黏膜嚴重缺血、缺氧，可引起腸黏膜萎縮凋亡，腸道黏膜機械屏障遭到破壞，細菌和內毒素可直接進入腸系膜淋巴結或血液循環(huán)并向全身播散[5]；腸道免疫系統(tǒng)功能低下，促炎癥反應及抗炎癥反應調節(jié)的失衡，導致炎癥介質釋放導致中性粒細胞過度活化，加重內皮細胞損傷；所以，在燒傷動物模型中大量炎癥介質如IL-1α，TNF-α、IFN-γ、IL-6分泌增高[6]。腸黏膜屏障是機體防御腸道有害刺激的第一道防線，腸組織損傷后主要表現為炎癥反應和細胞凋亡兩方面。在本實驗中，嚴重燒傷大鼠回腸黏膜絨毛壞死、脫落，炎癥細胞浸潤，局部腺體減少，黏膜下明顯充血水腫，同時回腸黏膜凋亡明顯增加（P＜0.05），并且與正常對照組相比，回腸黏膜分泌IL-6、TNF-a的量增加（P＜0.05）。

c-Jun氨基末端激酶（JNK）屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族成員之一，在應激、損傷、炎癥因子和氧自由基等刺激條件下而被活化，直接或間接通過激活轉錄因子AP-1家族的Jun和Fos等，促進相關基因的表達和蛋白質的合成，從而在調節(jié)細胞凋亡、分化和增殖、組織炎癥反應等病理生理過程中起到重要作用[7]。實驗研究發(fā)現，JNK參與多種疾病及病理過程，如炎癥性腸病、腸缺血再灌注損傷等[8-9]。本實驗結果顯示，與正常對照組相比，嚴重燒傷大鼠回腸黏膜p-JNK的表達明顯增加（P＜0.05），給予JNK選擇性抑制劑SP600125抑制JNK的活化后，可以減少腸黏膜萎縮凋亡，減少炎癥介質IL-6、TNF-a分泌，同時明顯改善燒傷大鼠回腸黏膜病理損傷（P＜0.05）。

4 結論

本實驗初步說明JNK活化在嚴重燒傷大鼠模型腸道黏膜損傷中的作用，抑制JNK活化后通過抑制腸黏膜凋亡及促炎癥因子的釋放，從而減輕嚴重燒傷后腸道黏膜損傷及腸道屏障功能破壞，抑制JNK活化可以作為預防腸道黏膜損傷的治療靶點。

表1 各組大鼠實驗后的回腸黏膜凋亡率、IL-6、TNF-a 及p-JNK的表達比較

[1]盧書明，劉麗娜． 重視腸黏膜屏障功能障礙的防治[J]． 醫(yī)學與哲學：臨床決策論壇版，2011，32（5）：48-49，74．

[2]Clark JA，Coopersmith CM． Intestinal crosstalk： a new paradigm for understanding the gut as the “motor” of critical illness[J]． Shock，2007，28（4）：384-393．

[3]Chenxi Wu，Changyan Chen，Jianli Dai，et al． Toll pathway modulates TNF-induced JNK-dependent cell death inDrosophila[J]．Open Biol，2015，5（7）：140171．

[4]郭光華． 危重燒傷的早期救治[J]． 感染、炎癥、修復，2015，16（2）：67-69．

[5]Deitch EA． Gutoriginsepsis：evolution of a concept[J]． Surgeon，2012，10（6）：350-356．

[6]孫超，李毅，王洪瑾． 硫化氫對燒傷大鼠腸道組織干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α含量的影響[J]． 中華損傷與修復雜志：電子版，2013，8（2）：22-25．

[7]Weston CR，Davis RJ． The JNK signal transduction pathway[J]．CurrOpin Cell Biol，2007，19（2）：142-149．

[8]Kiran Assi，Rex Pillai，Antonio Gómez-Mu?oz，et al． The specific JNK inhibitor SP600125 targetstumour necrosis factor-Aproduction and epithelial cell apoptosisin acute murine colitis[J]．Immunology，2006，118（1）：112-121．

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Effect of the JNK Inhibitor on the Mucosal Injury of Rats After Burns

CHEN Qiang1ZHAO Cuijuan21 Department of Burn Surgery, Baogang Hospital, Baotou Inner Mongolia 014010, China; 2 Department of Gastroenterology

burns; c-Jun amino terminal kinase; apoptosis; infammatory mediators

intraperitoneal injection of SP600125 2 hours before burn, with a dose of 20 mg/kg. Rats in group A and group B were sacrificed first days, third days, fifth days and seventh days respectively. 8 rats were killed in each group, and C rats were sacrificed second days after the experiment. HE staining method was used to observe the morphological changes of the ileum in rats after burn; The apoptosis rate of ileum in rats was measured by flow cytometry; Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the levels of cytokines IL-6 and TNF-a in the ileum of rats; Immunohistochemical staining was used to detect the expression of p-JNK.ResultsCompared with group B, the apoptotic rate of ileum mucosa in A group was decreased, the content of IL-6 and TNF-a decreased, and the expression of p-JNK decreased, the difference was statistically signifcant (P＜0.05).ConclusionBy inhibiting the expression of p-JNK, it can reduce the apoptosis of the ileum mucosa tissue and reduce the content of inflammatory mediators IL-6 and TNF-a in the burn model rats, thereby reducing the damage of mucosal tissue.

1內蒙古包鋼醫(yī)院燒傷外科，內蒙古 包頭 014010；2消化內科

陳強

R11

A

1674-9308（2017）16-0208-03

10．3969/j．issn．1674-9308．2017．16．113

[Abstract]ObjectiveTo investigate the intervention effect of JNK inhibitors on intestinal mucosa injury in rats after burn and its possible mechanism.Methods72 SD rats were divided into normal control (C) group 8, burn control (B) group 32, and burn +SP600125 intervention (A) group 32. A group and B group were treated with 90 degree water burn 7S, resulting in 30% surface area, third degree burns. Group A