安紅強， 王萬軍

(西南交通大學 生命科學與工程學院， 成都 610031)

鐵皮石斛胚胎發(fā)生相關基因DoEMB8的克隆及表達分析

安紅強， 王萬軍

(西南交通大學 生命科學與工程學院， 成都 610031)

采用RACE和巢式PCR技術克隆出鐵皮石斛胚胎發(fā)生相關基因DoEMB8(Embryogenesis-associated protein EMB8)序列。序列分析表明該基因全長2077 bp，包含一個1824 bp的CDS，編碼608個氨基酸殘基。分子進化分析顯示，DoEMB8與海棗(Phoenixdactylifera)、油棕(Elaeisguineensis)、小果野芭蕉(Musaacuminatasubsp.malaccensis)等單子葉植物的親緣關系較近?？缒^(qū)分析顯示DoEMB8蛋白含有兩個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，亞細胞定位顯示該基因可能存在于線粒體。RT-qPCR分析表明，DoEMB8在原球莖不同發(fā)育時期表達量較為恒定，在PLB(Protocorm like body)中的表達量較原球莖不同時期要高，在組織表達分析中，種子中的表達量最高，較根中的表達量上升了3.16倍，表明該基因在胚胎發(fā)育時期有著持續(xù)穩(wěn)定且較高的表達，可能對植物胚胎發(fā)育起著重要作用。

鐵皮石斛； 胚胎發(fā)育相關基因； RACE； RT-qPCR

在大多數(shù)綠色植物中，胚胎發(fā)生在植物的生命周期中扮演著重要作用[1-2]。植物的胚胎發(fā)生是指從單細胞的受精卵到多細胞種胚的發(fā)育分化過程，胚胎形成包含兩個明顯的階段：早期形態(tài)學事件和后期生殖細胞的形成[3-4]。在植物胚胎發(fā)育過程中，成熟的植株都會經(jīng)過一個基本的形體發(fā)育過程，這包括芽、根端分生組織、子葉、幼根和子葉下胚軸的形成，之后，植物基底端軸線、徑向元素、表皮、基本組織和維管結(jié)構(gòu)會隨之形成；這些要素在植物胚胎發(fā)育的早期形成，并在植物整個生命周期中穩(wěn)定存在[5-9]。植物胚胎形成是一個非常復雜和有序的生物學過程，受到一些獨特基因群組的調(diào)控[10-12]，它是基因在機體內(nèi)外因素協(xié)同作用下，在時間和空間上順序表達的過程[13]。受精卵極性的建立是胚胎發(fā)育的第一步，而第一個發(fā)現(xiàn)與極性建立有關的基因是GNDM/EMB30(GN)，該基因的突變體造成胚胎失去根部和下胚軸[14-15]。因而EMB可能對植物胚胎發(fā)生過程具有重要的調(diào)控作用。

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，通常生長于懸崖和林中覆蓋有苔蘚的樹干上[16-17]，由于其在自然環(huán)境中萌發(fā)率極低，因而對該植物的研究通常通過人工組培的方式進行。其種胚發(fā)育過程要經(jīng)過原球莖時期，由于其種胚較小，因而對其種胚發(fā)育的研究比較困難，且原球莖發(fā)育的分子機理尚不清楚。本研究擬根據(jù)鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組序列片段，采用RACE技術對胚胎發(fā)育相關基因DoEMB8進行克隆擴增，并采用生物信息學手段對該基因的編碼蛋白進行理化性質(zhì)分析和功能預測，再通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和2-△△Ct方法對該基因在原球莖不同發(fā)育時期及不同組織的表達情況進行分析，推測該胚胎發(fā)育相關基因在原球莖時期的功能，為后續(xù)研究該基因調(diào)控鐵皮石斛胚胎發(fā)育分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛種子源自云南，接種于含1.07 μmmol/L NAA的1/2MS培養(yǎng)基上，在種子發(fā)育的不同階段分別取原球莖形成、原分生組織形成、頂端分生組織形成、橢球形原球莖、葉原基維管系統(tǒng)形成、根端分生組織形成和原球莖退化共7個時期材料；從體胚誘導而來的材料中取類原球莖(protocorm-like body, PLB)；從接種于1/2MS培養(yǎng)基上的幼苗取根、莖、葉3種組織材料；從實驗室花盆栽培的成熟的鐵皮石斛植株上取整個花朵和種子，取材后液氮速凍保存于-80℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成

取上述凍存的材料，用液氮研磨進行組織破碎，采用Plant RNA Kit (OMEGA BIO-TEK)試劑盒提取鐵皮石斛總RNA，通過RNase-free DNase I (TaKaRa, 大連)在膜上消化去除總RNA中的基因組污染。提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳來鑒定完整性，D260 nm/280 nm比值法進行RNA純度鑒定，取1 μg電泳條帶完整，D260 nm/280 nm比值位于1.8～2.1的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄酶采用TaKaRa的Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)進行cDNA第一鏈的合成，cDNA稀釋10倍后凍存于-80℃用于后續(xù)RT-qPCR實驗。

1.2.2 RACE克隆及測序分析

以實驗室已經(jīng)測過的轉(zhuǎn)錄組序列片段為模板，采用Primer Premier 5.0設計3′RACE巢式引物，在模板序列3′端設計兩個上游引物EMB8-3R和EMB8-3RN，送交成都擎科生物公司合成，并與下游通用引物3RP和3RNP配對使用進行巢式PCR擴增，PCR克隆產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行膠回收，構(gòu)建重組載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，搖菌活化后進行藍白斑篩選，最終挑取陽性單克隆送交成都擎科生物公司測序。測序得到的序列經(jīng)NCBI中的Blastn比對分析確認為EMB8目的基因后，與原轉(zhuǎn)錄組序列拼接得到DoEBM8序列。

1.2.3 生物信息學分析

使用NCBI的BlastP進行蛋白相似性比對，并取排名靠前的前15個物種的相似序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，選取最大分值667分以上，序列覆蓋度87%以上的25個物種EMB同源序列，用于后續(xù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用ClustalX進行序列比對，MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用NCBI中的Open Reading Frame Finder (ORF Finder) 進行開放閱讀框(ORF)查找，Conserved domains(CDD)進行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，bioXM用于編碼區(qū)(CDS)蛋白翻譯，采用DNAStar中的Protean進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析，DNAMAN進行多重序列比對分析。使用ProtParam 進行蛋白理化性質(zhì)分析，TMHMM進行跨膜區(qū)分析，SignalP進行信號肽分析，用TargetP預測DoEMB8蛋白的亞細胞定位。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析

為了研究鐵皮石斛不同原球莖發(fā)育時期及不同組織中DoEMB8的表達量情況，本文采用RT-qPCR方法來對其表達量情況進行研究。以克隆拼接得到的基因序列為模板，根據(jù)熒光定量PCR引物設計原則，在基因3′端設計RT-qPCR引物，Tm值為55℃～65℃，引物長度介于18～30 bp之間，引物擴增長度為100～300 bp(表1)。以Actin作為內(nèi)參基因，RT-qPCR實驗采用TaKaRa的SYBR Premix ExTaqTMII (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa, 大連)，在Roche公司的LightCycler?96熒光定量PCR儀上進行，反應體積為10 μL: 5 μL SYBR Premix，0.8 μL (5 μmol)每個引物，2.9 μL ddH2O，0.5 μL cDNA，反應條件為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火10 s，72℃延伸25 s，共40個循環(huán)；最后95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s用于生成M值熔解曲線。同一樣本反應設立3個技術重復孔，每種樣本設立3次生物學重復實驗，并設立陰性對照實驗。技術重復誤差采用儀器配套軟件LightCycler?96 SW 1.1分析，所有技術重復誤差均≤0.25，采用2-△△Ct計算方法進行相對表達量分析。

表1 RACE克隆及RT-qPCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1DoEMB8序列結(jié)構(gòu)分析

3′RACE克隆得到了348 bp的3′末端序列(圖1)，與轉(zhuǎn)錄組片段拼接后共得到2077 bp的基因序列，采用NCBI中的ORF Finder查找到最長的ORF位于14～1837 bp之間，編碼608aa的氨基酸殘基序列。利用DNASTAR中的Protean對DoEMB8蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)構(gòu)分析如圖2所示，該蛋白含有21個α螺旋，45個β折疊，33個γ轉(zhuǎn)角及26個無規(guī)卷曲。NCBI的CDD結(jié)構(gòu)域分析顯示，該基因在124～445位氨基酸殘基之間含有一個Abhydrolase super family結(jié)構(gòu)域，在187～428位氨基酸殘基之間含有一個Abhydrolase_1結(jié)構(gòu)域特征，多重序列比對分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，DoEMB8蛋白序列較為保守，尤其在結(jié)構(gòu)域中保守性更高。

圖1 RNA電泳圖及DoEMB8 3′RACE擴增結(jié)果

A：泳道1～13分別代表原球莖形成、原分生組織形成、頂端分生組織、橢球形原球莖、葉原基維管系統(tǒng)形成、根端分生組織形成、原球莖退化、類原球莖PLB、根、莖、葉、花和種子RNA電泳圖；B：表示3′RACE擴增結(jié)果

圖2 鐵皮石斛DoEMB8蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測

Fig 2 The secondary structure ofD.officinaleDoEMB8 protein

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

從圖4中可以看出，青梨(Pyrusxbretschneideri)、梅花(Prunusmume)、草莓(Fragariavescasubsp.vesca)、落花生(Arachisipaensis)、綠豆(Vignaradiatavar.radiata)、大豆(Glycinemax)聚為一支A；陸地棉(Gossypiumhirsutum)、麻風樹(Jatrophacurcas)、蓖麻(Ricinuscommunis)聚為一支B；葡萄(Vitisvinifera)、巨桉(Eucalyptusgrandis)聚為一支C；甜菜(Betavulgarissubsp.vulgaris)、猴面花(Erythrantheguttata)、芝麻(Sesamumindicum)聚為一支D；荷花(Nelumbonucifera)單成一支E，以上幾支A-E同屬雙子葉植物(I類)。鐵皮石斛單成一支G；海棗(Phoenixdactylifera)、油棕(Elaeisguineensis)、小果野芭蕉(Musaacuminatasubsp.malaccensis)聚為一支H；菠蘿(Ananascomosus)、狗尾草(Setariaitalica)、水稻(OryzasativaJaponicaGroup)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、玉米(Zeamays)和甘蔗(SaccharumhybridcultivarR570)聚為一支I，且H和I兩支與鐵皮石斛情緣關系較近，它們們同屬單子葉植物(II類)。而無油樟(Amborellatrichopoda)單成一支F，處于I類與II類之間，這與其在植物進化關系中自成一目一科一屬的植物學分類特征相一致。

2.3 生物信息學分析

利用ProtParam在線軟件對DoEMB8蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)分析，分子質(zhì)量為67 049.9 u，等電點為6.55，帶負電荷殘基數(shù)(Asp+Glu)62，帶正電荷殘基數(shù)(Arg+Lys)59，分子式為C3013H4715N813O872S24，脂肪系數(shù)為96.83，親水系數(shù)為0.062，不穩(wěn)定系數(shù)為46.56，屬于不穩(wěn)定蛋白。采用TMHMM在線軟件對DoEMB8蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果如圖5所示，該蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)，在第60～82和571～593位氨基酸處含有兩個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，1～59位氨基酸和594～608位氨基酸處于細胞膜內(nèi)，83～570位氨基酸處于細胞膜外(圖5)。SignalP在線軟件分析顯示該蛋白不含信號肽(圖6)。亞細胞定位分析表明，DoEMB8蛋白最有可能分布在線粒體中(0.165)，存在與分泌通路的可能性為0.060，葉綠體為0.038，在其他地方的可能性為0.491。

2.4 表達量分析

根據(jù)2-△△Ct方法計算得到的DoEMB8的相對表達量如圖7所示。從圖7-A可以看出，DoEMB8在原球莖的7個不同原球莖發(fā)育時期表達量較為恒定，只是在根端分生組織形成(p7)時期表達量有所上升，而在由體胚誘導而來的類原球莖PLB中表達量較高，是種子萌發(fā)的原球莖形成時期(p2)的2.05倍，說明該基因在整個原球莖發(fā)育時期持續(xù)穩(wěn)定表達。在不同組織中，DoEMB8在種子中的表達量最高(圖7-B)，較根中的表達量上升了3.16倍，在花中表達量最低，較根下降了4.32倍，葉中的表達量較根下降了1.45倍，莖和根的表達量較為一致，表明該基因在種子時期表達較不同組織中要高，也從側(cè)面說明該胚胎發(fā)育相關基因在種胚及胚胎發(fā)育時期有著較高的表達量，可能在胚胎發(fā)育中起著重要作用。

圖3 不同物種EMB蛋白多重序列比對分析

圖4 不同植物EMB蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

圖5 DoEMB8蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測

圖6 DoEMB8蛋白信號肽預測

圖7原球莖不同發(fā)育時期及不同組織中DoEMB8的表達量

A中p2～p8分別代表原球莖形成、原分生組織形成、頂端分生組織、橢球形原球莖、葉原基維管系統(tǒng)形成、根端分生組織形成、原球莖退化；PLB代表類原球莖時期

3 討論

胚胎發(fā)生是植物生命周期中關鍵的階段[8, 19]，是一個精細和復雜的調(diào)控過程，按照預設的步驟進行一系列的生物學進程以完成胚胎發(fā)育[19]。雖然植物胚胎發(fā)生通常是在種子萌發(fā)的情況下研究的，但是植物胚胎的萌發(fā)也有其他可行的方法，如體細胞胚胎發(fā)生、小孢子胚胎發(fā)生、合子胚萌發(fā)等[20-21]，這些胚胎發(fā)生模式是開花植物生命周期中重要的發(fā)育階段[21-23]。最近，有研究證實，基于幾個關鍵的胚胎發(fā)育過程標記，早期的胚胎發(fā)生可以當作研究植物發(fā)育的微型模型[24-25]，但是與植物的其他生物學過程相比，由于植物早期胚胎材料太小難以獲取，植物早期胚胎發(fā)生相關的分子機制仍有待繼續(xù)探索研究[22]。

目前，擬南芥[22-23]、歐洲油菜[26]、水稻[25]、陸地棉[27]和黃瓜[28]中均已鑒定出胚胎發(fā)生相關基因，例如：Tzafrir等采用胚胎缺損突變體方法在擬南芥中鑒定出244個正常胚胎發(fā)育所需的EMB基因[29]，但有關鐵皮石斛胚胎發(fā)育相關基因的研究還鮮見報道。本研究中克隆得到的DoEMB8編碼一個跨膜蛋白，含有兩個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，該蛋白含有自水解酶超家族結(jié)構(gòu)域，且較為保守。分子進化分析顯示DoEMB8同海棗(Phoenixdactylifera)、油棕(Elaeisguineensis)、小果野芭蕉(Musaacuminatasubsp.malaccensis)等單子葉植物的親緣關系最近，能較好地反映植物分類學特征。

胚胎發(fā)生相關基因是植物胚胎發(fā)育階段重要的基因，對該基因在胚胎不同發(fā)育時期的表達量進行定量分析，有助于預測該基因在植物整個胚胎發(fā)育期可能具有的功能。本研究中，DoEMB8在鐵皮石斛原球莖不同發(fā)育時期表達量較為恒定，只是在根端分生組織形成時期表達量較其他時期較高，說明該基因在原球莖的發(fā)育歷程中有著穩(wěn)定的表達，對維持原球莖的生長可能具有重要作用，這也與Skevell成功地利用T-DNA標簽技術分離到EMB30，且該基因在整個發(fā)育過程中持續(xù)表達所揭示的結(jié)果相一致[14]。而在由體胚誘導而來的類原球莖中，該基因的表達水平較種胚發(fā)育而來的原球莖要高出許多，說明雖然有著相似的形態(tài)特征，但體胚誘導的類原球莖與原球莖在基因表達方面卻有著一定的差異。不同組織的表達水平分析顯示，DoEMB8在根、莖、葉和花中的表達量都較低，且有著相似的表達水平，而在種子中的表達水平較高，明顯高于前4種組織，表明DoEMB8在種子時期可能具有重要的作用，這也與該基因?qū)儆谂咛グl(fā)育相關基因的注釋信息相一致。

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Cloning and expression analysis of embryogenesis-associated protein EMB8 (DoEMB8) inDendrobiumofficinaleKimuraetMigo

AN Hong-qiang, WANG Wan-jun

(School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China)

The embryogenesis-associated protein EMB8 (DoEMB8) inDendrobiumofficinaleKimuraetMigo was achieved by RACE and nest PCR technologies. The full length ofDoEMB8 was 2077 bp, contained an open reading frame (ORF) of 1824 bp that encoded 608 amino acid residues. Phylogenetic analysis showed that DoEMB8 had the closest relationship withPhoenixdactylifera,Elaeisguineensis,Musaacuminatasubsp.malaccensisand some other monocotyledon. DoEMB8 had 2 transmembrane helix structures and probably existed in mitochondrion analyzed by TMHMM and TargetP, respectively. RT-qPCR analysis showed that the expression level ofDoEMB8 was relatively constant in different development stages of protocorm, while it was higher in PLB(Protocorm like body) compared to that in protocorm. In different tissues, the expression level ofDoEMB8 was highest in seed and was 3.16 times higher than that in root, indicating thatDoEMB8 had relatively constant and higher expression level in embryonic development and may play an important role in plant embryonic development.

DendrobiumofficinaleKimuraetMigo; embryogenesis-associated protein EMB8; RACE; RT-qPCR

2016-08-01；

2016-08-10

國家自然科學基金委員會(31371232)

安紅強，碩士研究生，主要從事植物發(fā)育生物學研究，E-mail：1528241699@qq.com

王萬軍，教授，主要從事植物發(fā)育生物學研究，E-mail:wanjunwang@home.swjtu.edu.cn

Q78

A

2095-1736(2017)04-0001-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.04.001