鄒立軍， 黃 文， 莊遠(yuǎn)紅， 廖海艷， 吉 璐

(湖南第一師范學(xué)院 基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 長(zhǎng)沙 410205)

JNK1基因在金魚性腺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

鄒立軍， 黃 文， 莊遠(yuǎn)紅， 廖海艷， 吉 璐

(湖南第一師范學(xué)院 基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 長(zhǎng)沙 410205)

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為探明JNK1(c-JunN-terminalkinase1)在魚類性腺發(fā)育過程中的相關(guān)性，以模式動(dòng)物金魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印跡(Western blotting)技術(shù)檢測(cè)JNK1基因及其蛋白在金魚精巢和卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平。結(jié)果表明：金魚雄魚和雌魚的性腺指數(shù)(GSI)顯示性腺在發(fā)育過程中呈明顯的季節(jié)變化規(guī)律，其中在性腺成熟期GSI最高(P<0.05)。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示JNK1在卵巢發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，其在卵巢成熟期的表達(dá)量最高(P<0.05)，為成熟前期、退化吸收期和修整恢復(fù)期表達(dá)量的4.0、1.4和2.1倍；JNK1在精巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量總體呈現(xiàn)出微量變化的趨勢(shì)；在精巢成熟前期表達(dá)最低，成熟期、退化吸收期和修整恢復(fù)期表達(dá)量較成熟期有微量升高，且精巢發(fā)育全過程中的表達(dá)變化均無顯著性差異。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示其蛋白水平表達(dá)模式與mRNA的表達(dá)水平吻合。研究表明，JNK1在一定程度上與魚類卵巢發(fā)育相關(guān)，可能在促進(jìn)卵細(xì)胞的成熟方面具有重要作用。

金魚；JNK1；性腺發(fā)育；性腺指數(shù)

JNKs(c-Jun N-terminal kinases)蛋白激酶是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的成員，屬于進(jìn)化上保守的Serine/Threonine蛋白激酶[1-2]。它包含了雙磷酸化功能區(qū)Thr-Pro-Tyr，與c-Jun N端的活化區(qū)結(jié)合并使其第63、73位絲氨酸殘基磷酸化[3-4]。JNKs由JNK1、JNK2和JNK3 3個(gè)基因編碼，它們可選擇性地拼接成10種JNK的亞型，都能編碼46 ku和55 ku的蛋白產(chǎn)物[5-6]。JNK1和JNK2在體內(nèi)的各種組織中廣泛表達(dá)，而JNK3基因的表達(dá)形式具有組織特異性，通常只在大腦、心臟和睪丸中表達(dá)，且三者作用也不盡相同[7]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子TNF-α和IL-1、生長(zhǎng)因子EGF、放射線、熱休克、滲透壓及蛋白合成抑制劑等外界條件均能通過不同的信號(hào)通路激活JNK，進(jìn)而參與調(diào)控多種生理病理過程，如細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡、自噬和應(yīng)激反應(yīng)等[8-13]。

金魚(Carassiusauratus)，隸屬于鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，鯽屬(Carassius)。由于具備養(yǎng)殖方便，體外受精，胚胎發(fā)育速度快等方面的優(yōu)勢(shì), 已被廣泛用作模式動(dòng)物[14]，但迄今為止，關(guān)于JNK1在魚類發(fā)育中的研究還很有限。本實(shí)驗(yàn)室通過分子克隆技術(shù)獲得了JNK1全長(zhǎng)并發(fā)現(xiàn)其在金魚的性腺中表達(dá)存在性別二態(tài)性，即卵巢的表達(dá)量要顯著高于精巢[15]。為了探索JNK1與魚類性腺發(fā)育周期的相關(guān)性，本研究檢測(cè)并分析了JNK1在金魚性腺不同發(fā)育時(shí)期的mRNA和蛋白表達(dá)模式，以期找出不同時(shí)期的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究JNKs 家族在魚類性腺分化與發(fā)育中的功能提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于本實(shí)驗(yàn)的金魚購自長(zhǎng)沙市花鳥市場(chǎng)，雌雄均為40尾，1～2年齡，其中雌魚體長(zhǎng)9.9～15.1 cm，體重96.3～107.2 g；雄魚體長(zhǎng)9.7～14.5 cm，體重85.4～96.4 g。水溫控制在25℃～28℃左右，每天定時(shí)(早晚各1次)投喂固體餌料，流水充氧，滿足自然光照。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)樣品采集

于2015年3月至2016年2月分別按月份采集樣本，在性腺成熟期(3月—5月)、性腺退化吸收期(6月—8月)、性腺修整恢復(fù)期(9月—11月)和性腺成熟前期(12月至翌年2月)4個(gè)時(shí)期各取健康雌、雄金魚各10尾，測(cè)量金魚的主要生物學(xué)指標(biāo)并迅速解剖其性腺，生物學(xué)指標(biāo)包括體長(zhǎng)(Body length, BL)，體重(Body weight, BW)，性腺重(Gonad weight, GW)，去內(nèi)臟重(Visceral weight, VW)后得凈重(BW-VW)；計(jì)算性腺成熟系數(shù)(GSI)=[GW/(BW-VW)]×100。將卵巢、精巢兩種組織用液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。

1.1.3 主要儀器和試劑

NanoDrop 2000核酸蛋白測(cè)定儀(Thermo Scientific)；Centrifuge 5904R 離心機(jī)(Eppendorf)；MyCy-clerTM Thermal Cycler PCR 儀(BioRad)；凝膠電泳槽(北京六一)；GDS7500 凝膠成像系統(tǒng)(UVP)；ABI 7500 HT platform實(shí)時(shí)定量PCR儀(Applied Biosystems)；蛋白電泳Mini-PROTEAN Tetra系統(tǒng)(BioRad)；Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件；Gel-Pro圖像分析軟件和SPSS 19.0軟件。

總RNA提取TRIzol Reagent (Invitrogen-Life Technologies)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，DNA Ladder和SYBR Premix ExTaqTM(TaKaRa)；蛋白酶抑制劑Cocktail，Protein Ladder和NBT/BICP 顯色劑 (Thermo Scientific)；JNK1抗體，β-actin抗體和IgG-AP二抗(Santa Cruz)；RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天)。

1.1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 中金魚的JNK1和β-actin基因序列，在各自的編碼區(qū)序列(CDS)設(shè)計(jì)特異引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成；引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

表 1 本研究所用到引物

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA 第一條鏈合成

將得到的性腺樣本參照Trizol Reagent說明書提取總RNA，將總RNA沉淀溶解于DEPC水中。用1% 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA片段的完整性。分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度及純度，且保證D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之間。取1 μg總RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，產(chǎn)物保存于-20℃冰箱。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)

采用Quantitative Real-time PCR(qPCR)檢測(cè)JNK1(β-actin作內(nèi)參) 在金魚性腺發(fā)育過程中的mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)條件為50℃預(yù)變性2 min；95℃變性10 min，95℃退火15 s，60℃延伸45 s，40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線程序：95℃，60 s；60℃，60 s，從60℃開始上升至95℃獲得熔解曲線。根據(jù)不同樣本的擴(kuò)增曲線，確定擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)，參照Livak等[16]提出的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法2(-ΔΔCt)，對(duì)相對(duì)定量的結(jié)果進(jìn)行分析，得到性腺不同發(fā)育時(shí)期JNK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量圖譜。為確保qPCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，每個(gè)樣品均重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.3 蛋白免疫印跡(Western blotting)

取金魚不同發(fā)育時(shí)期性腺組織用少量液氮研磨至粉末狀，再加入含蛋白酶抑制劑Cocktail的RIPA裂解液，12 000 r/min 4℃離心20 min，取上清, 取4 μL用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，其余分裝保存于-80℃。采用Western blotting標(biāo)準(zhǔn)步驟[17]進(jìn)行操作。一抗稀釋濃度分別為：兔抗JNK1抗體(1∶1000)，鼠抗β-actin抗體(1∶2000)。二抗稀釋濃度為：抗兔或抗鼠IgG-AP(1∶30 000)。顯影結(jié)果通過Gel-Pro軟件分析計(jì)算JNK1/β-actin的灰度值, 最終得到JNK1 蛋白豐度的相對(duì)表達(dá)圖。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 性腺成熟系數(shù)的周年變化

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示雌魚和雄魚的性腺成熟系數(shù)(GSI)變化趨勢(shì)基本一致，且性腺發(fā)育不同時(shí)期的GSI呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)變化規(guī)律，但是卵巢GSI均值要顯著高于精巢。如圖1所示，GSI 在性腺成熟期(3月—5月)數(shù)值最高，此時(shí)卵巢發(fā)育至Ⅳ期或Ⅴ期，雌魚的GSI高達(dá)20.2348±3.0160；隨后進(jìn)入卵巢退化吸收期(6月—8月)，此時(shí)GSI 均值顯著降低(P<0.05)，至休整恢復(fù)期(9月—11月)降到最低(P<0.05)，卵巢成熟前期GSI顯著增加(P<0.05)。金魚精巢GSI值較低；雖然在性腺成熟期(3月—5月)出現(xiàn)高峰，但值僅為7.0751±1.7332；此時(shí)的精巢一般處于Ⅴ期，繁殖結(jié)束后進(jìn)入精巢退化吸收期，此時(shí)GSI顯著降低(P<0.05)，隨后的修整恢復(fù)期GSI水平較退化期無顯著性差異，進(jìn)入精巢成熟前期GSI又顯著升高(P<0.05)。

圖1 金魚雄魚和雌魚性腺成熟系數(shù)(GSI)的周年變化Fig 1 Profiles of gonadosomatic index (GSI) in male and famale goldfish

數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=10)，圖中標(biāo)有不同的字母表示存在顯著性差異(P<0.05)；下同

2.2JNK1 mRNA在金魚性腺發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)水平

通過分析熔解曲線(圖2)來判斷引物的特異性，橫坐標(biāo)代表反應(yīng)溫度，縱坐標(biāo)代表反應(yīng)過程中生成的產(chǎn)物量。如圖2 所示，金魚JNK1和β-actin引物熔解曲線分別在78.89℃和82.42℃時(shí)表現(xiàn)為特異性單峰，表明沒有引物二聚體的產(chǎn)生，產(chǎn)物為目的產(chǎn)物，因此引物適用于本次實(shí)驗(yàn)。

JNK1在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)(圖3)。在性腺成熟前期(12月至翌年2月)JNK1表達(dá)最低，隨后進(jìn)入繁殖期，卵巢發(fā)育成熟(3月—5月)，JNK1的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)且達(dá)到峰值，為3.985±0.380，進(jìn)入卵巢退化吸收期(6月—8月)后JNK1表達(dá)顯著降低(P<0.05)到2.856±0.426，到卵巢修整恢復(fù)期(9月—11月)JNK1表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05)為1.901±0.101，最后逐漸恢復(fù)到性腺成熟前期水平。

JNK1在精巢發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量總體呈現(xiàn)出微量變化的趨勢(shì)(圖3)；在精巢成熟前期(12月至翌年2月)JNK1表達(dá)最低，在精巢成熟期(3月—5月)表達(dá)量微量升高，為1.3363±0.2343；隨后精巢進(jìn)入退化吸收期(6月—8月)和修整恢復(fù)期(9月—11月)，而這期間JNK1的表達(dá)量無明顯變化，分別為1.2103±0.1239和1.2345±0.1997；最后逐漸恢復(fù)到精巢成熟前期水平；JNK1在精巢發(fā)育全過程中的表達(dá)變化均無顯著性差異。

圖2 引物熔解曲線

A：JNK1引物熔解曲線; B：β-actin引物熔解曲線

2.3 JNK1蛋白在金魚不同性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平

通過Western blotting技術(shù)檢測(cè)了JNK1 蛋白在金魚性腺發(fā)育周年的表達(dá)模式，結(jié)果顯示JNK1蛋白在雌性金魚卵巢不同發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)出較大的波動(dòng)(圖4-A)，Gel-Pro軟件分析顯示其表達(dá)的總體趨勢(shì)與mRNA的表達(dá)模式吻合(圖4-C)，即卵巢成熟前期表達(dá)量最低，到達(dá)卵巢成熟期JNK1蛋白表達(dá)量升到較高水平(P<0.05)，隨著進(jìn)入卵巢退化吸收期和修整恢復(fù)期，JNK1蛋白表達(dá)逐漸降低。

圖3 JNK1在金魚性腺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平

注：數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=6)，圖中標(biāo)有不同的字母表示存在顯著性差異(P<0.05)

JNK1蛋白在精巢在發(fā)育過程中的總體表達(dá)量較低(圖4-B)，其中在精巢成熟前期(12月至翌年2月)表達(dá)量最低，在進(jìn)入成熟期后(3月—5月)微量升高，隨后在精巢退化吸收期和修整恢復(fù)期的表達(dá)量均維持在較低水平；且JNK1蛋白表達(dá)水平在精巢各發(fā)育過程中無顯著性差異(圖4-C)。

圖4 JNK1在金魚卵巢(A)和精巢(B)不同發(fā)育時(shí)期的蛋白表達(dá)水平以及蛋白豐度柱形圖(C)Fig 4 Protein expression level of JNK1 in different developmental phases of ovary (A) and testis (B) in goldfish and protein abundance column chart (C)

3 討論

JNK 信號(hào)通路是真核細(xì)胞中高度保守的一條重要信號(hào)通路。研究證實(shí)，JNK信號(hào)通過蛋白激酶間的酶促磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與了生物體組織器官的分化及發(fā)育調(diào)控[18-19]。通常情況下，JNK的活性是由其磷酸化水平?jīng)Q定的；因此，外源信號(hào)主要按照MAPK kinase kinase(MAPKKK)-MAPK kinase(MAPKK)-JNK的方式進(jìn)行調(diào)控和傳遞[20]。一系列研究表明，JNK在細(xì)胞凋亡過程中扮演了重要角色。在海鞘(Ascidian) 蝌蚪幼體的尾巴退化時(shí)伴隨了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)JNK信號(hào)的激活是引起尾部細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要因素；隨后用JNK活性抑制劑SP600125處理早期蝌蚪幼體，發(fā)現(xiàn)其尾部細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)重抑制，從而阻礙尾部退化及變態(tài)過程[21]。在Kuan等[22]的研究中，條件性敲除JNK1或JNK2的小鼠均可以正常存活，但是同時(shí)敲除JNK1和JNK2 的小鼠神經(jīng)管發(fā)育出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷，腦細(xì)胞凋亡速率增加，從而導(dǎo)致其在胚胎期死亡。新近報(bào)道了哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞發(fā)育調(diào)控蛋白SPAG9 (Novel human sperm-associate antigen 9) 在人類的精巢特異性表達(dá)，且SPAG9蛋白結(jié)構(gòu)與JNK相互作用蛋白JIP(JNK interacting protein)同源，進(jìn)一步研究顯示SPAG9功能與JNK密切相關(guān)，表明JNK可能參與生殖細(xì)胞的分化調(diào)控[23-24]。隨后研究發(fā)現(xiàn)JNK信號(hào)負(fù)調(diào)控果蠅性腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育，JNK信號(hào)增強(qiáng)導(dǎo)致性腺正常功能出現(xiàn)缺陷[25]。

在對(duì)魚類JNK的研究中，已在黃鱔Monopterusalbus[26]，斑馬魚Daniorerio[27]，鯉魚CyprinuscarpioL.[28]，金魚[15]等魚類中獲得JNK1全長(zhǎng)并開展了相關(guān)研究。Huang等[29]通過顯微注射將JNK基因的顯性突變體(DNM-JNK)轉(zhuǎn)染至金魚的受精卵進(jìn)而抑制JNK活性，結(jié)果導(dǎo)致金魚胚胎死亡率顯著增加，同時(shí)引起多種器官(眼睛、神經(jīng)管以及肌肉)出現(xiàn)畸形。Xiao等[26]在黃鱔性逆轉(zhuǎn)研究中亦發(fā)現(xiàn)JNK1 在卵巢組織中的表達(dá)量要遠(yuǎn)高于精巢組織中的表達(dá)量, 推測(cè)JNK1可能在調(diào)控黃鱔卵巢組織退化過程中發(fā)揮了重要作用。采用SP600125 抑制劑處理斑馬魚早期胚胎，引起JNK 信號(hào)下調(diào)，除引起部分器官畸形外，還抑制了卵巢分化及性別決定，暗示了JNK信號(hào)通路參與了魚類性腺分化的調(diào)節(jié)[17, 27]。在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中激活MEKK1能夠誘導(dǎo)JNK異位表達(dá)，從而加快減數(shù)分裂進(jìn)程[30]。因此，JNK1可能在調(diào)控魚類性腺分化及發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。

已有研究證實(shí)，金魚JNK1在各組織中廣泛表達(dá)，但是在卵巢中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于精巢[15]，由此推斷，JNK1可能在調(diào)控金魚性腺發(fā)育過程中發(fā)揮作用。在本研究中，通過qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，JNK1精巢發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)量無顯著性差異，而在卵巢的發(fā)育過程中表達(dá)變量較大，且在成熟期的表達(dá)量要顯著高于其他時(shí)期(P<0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)了JNK1蛋白在性腺發(fā)育過程中的表達(dá)模式；結(jié)果顯示JNK1在性腺發(fā)育不同時(shí)期均有表達(dá)，但是在卵巢的表達(dá)量要遠(yuǎn)高于精巢，且在卵巢成熟期的表達(dá)量最高(P<0.05)。值得引起我們關(guān)注的是，無論是mRNA水平還是蛋白水平的表達(dá)，卵巢的表達(dá)量都要顯著高于精巢，表明JNK1在調(diào)控金魚卵巢發(fā)育及卵細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，本研究初步證實(shí)JNK1參與了金魚性腺發(fā)育調(diào)節(jié)，尤其在雌性金魚卵巢發(fā)育及卵細(xì)胞成熟過程中可能具有重要的調(diào)控作用，這為進(jìn)一步確定JNK1在魚類性別決定，性腺分化和發(fā)育中的功能提供了新的理論依據(jù)。但是對(duì)于JNK信號(hào)通路在如何調(diào)控卵巢發(fā)育方面的功能還有待今后進(jìn)一步研究。

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Expression analysis ofJNK1 in different developmental phases of gonad in goldfishCarassiusauratus

ZOU Li-jun, HUANG Wen, ZHUANG Yuan-hong, LIAO Hai-yan, JI Lu

(Laboratory of Basic Biology, Hunan First Normal University, Changsha 410205, China)

The objective of this study was to explore the correlation ofJNK1 gene in the process of gonad development of Goldfish (Carassiusauratus). The expression ofJNK1 was studied and analyzed in different developmental phases of gonad by using quantitative real-time PCR and Western blotting. It was found that gonadosomatic index (GSI) of males and females showed significant seasonal variation with the development process of gonad and was the maximium during the breeding period (P<0.05). The qPCR analysis revealed that the expression ofJNK1 firstly increased and then decreased at the development phases of ovary, reached the peak level at maturity phase (P<0.05)，4.0 times higher before sexual maturity, 1.4 times higher degradation phase and 2.1 times higher at the rest phase compared with that at maturity phase．In the testis， the expression ofJNK1 was found to be trace enhanced compared with before sexual maturity phase, however, the expression changes had no significant difference in the whole development process. Western blotting analysis showed that expression tendency of JNK1 protein was in line with that ofJNK1 mRNA. Together, these results suggest thatJNK1 plays an important role in the processes of the development of ovary and promoting the maturation of oocytes in fish.

Carassiusauratus；JNK1 gene； gonadal development; gonadosomatic index

2016-07-25；

2016-08-10

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014FJ4261)；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(14C0252)

鄒立軍，博士，講師，研究方向?yàn)榘l(fā)育生物學(xué), E-mail: zoulijun123@163.com

Q78

A

2095-1736(2017)04-0006-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.04.006