聶 軍，周 波，張郁林

三峽大學(xué)人民醫(yī)院心胸外科，湖北 宜昌 443000

長鏈非編碼RNA PANDAR在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)和臨床意義

聶 軍，周 波，張郁林

三峽大學(xué)人民醫(yī)院心胸外科，湖北 宜昌 443000

背景與目的：長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用。LncRNA CDKN1A反義鏈啟動子DNA損傷激動RNA(promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA，PANDAR)與多種腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)。探討非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)組織中l(wèi)ncRNA PANDAR的表達(dá)及臨床意義。方法：采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)方法檢測94例新鮮NSCLC組織標(biāo)本及相對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本中PANDAR的表達(dá)，分析其與NSCLC的臨床病理特征、診斷價值和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：PANDAR在NSCLC組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織(P＜0.001)；PANDAR低表達(dá)和高表達(dá)組在腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病分期和分化程度方面差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.197，P=0.002；χ2=7.126，P=0.008；χ2=6.271，P=0.012；χ2=8.147，P=0.004)；受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線的曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.797(95%CI：0.614～0.849；P＜0.001)，靈敏度和特異度分別是49.8%和84.3%，Youden指數(shù)為0.402；PANDAR低表達(dá)和高表達(dá)組在總生存期(overall survival，OS)及無進(jìn)展生存期(progression free survival，PFS)上的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.282，P=0.007；χ2=6.777，P=0.009)。結(jié)論：PANDAR在NSCLC中低表達(dá)，可以作為NSCLC的新型生物標(biāo)志物和診斷靶標(biāo)。

CDKN1A反義鏈啟動子DNA損傷激動RNA；非小細(xì)胞肺癌；受試者工作特征曲線；臨床病理特征；生物標(biāo)志物

肺癌是目前致死率較高的惡性腫瘤之一［1］，超過85%的肺癌屬于非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)［2］。盡管近年來NSCLC的臨床治療手段不斷改進(jìn)，但多數(shù)患者在癌癥晚期才被診斷，患者的總生存期(overall survival，OS)沒有顯著提高［3］。因此，探究NSCLC分子機(jī)制對于疾病早期的診斷和治療是非常有必要的。

過去對腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究主要集中在蛋白編碼基因，近年來非編碼基因家族的新成員—長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)被廣泛關(guān)注。lncRNA不能被翻譯成蛋白質(zhì)，以往研究發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞分化、免疫應(yīng)答和多種生物學(xué)過程中起重要作用［4-6］，說明lncRNA在真核細(xì)胞基因組調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。此外，包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤中都表現(xiàn)出lncRNA的失調(diào)［7-9］。lncRNA的分子機(jī)制多種多樣，可能在包括染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工等不同水平的基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用。例如，HOTAIR可以通過重復(fù)染色質(zhì)編程來促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移［10］，Linc-MD1能夠作為一個海綿滴定測量來控制肌肉分化［11］。

最近，許多l(xiāng)ncRNA被發(fā)現(xiàn)能夠與RNA結(jié)合蛋白(如hnRNP、SUZ12和NF-YA等)反應(yīng)，從而調(diào)控基因表達(dá)［12-14］。CDKN1A反義鏈啟動子DNA損傷激動RNA(promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA，PANDAR)是首個被報道的lncRNA［15］。PANDAR可與轉(zhuǎn)錄因子NF-YA相互作用，抑制促凋亡基因的表達(dá)［16-17］。而且Jing等［18］研究發(fā)現(xiàn)，PANDAR在肺癌中低表達(dá)，并且可通過調(diào)控Bcl-2基因促進(jìn)凋亡從而影響NSCLC的生長，本研究旨在探究PANDAR在NSCLC中的臨床病理特征、診斷價值和預(yù)后等臨床意義，以期為NSCLC的治療提供新的分子基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本采集

收集2010年1月—2011年1月三峽大學(xué)人民醫(yī)院收治并確診為NSCLC的肺癌標(biāo)本94例，所有腫瘤標(biāo)本均經(jīng)病理診斷確診為NSCLC，并取距離腫瘤病灶組織邊緣5 cm以上、無癌浸潤的癌旁組織標(biāo)本作為對照，所有標(biāo)本均于液氮中保存?zhèn)溆??；颊吣挲g28～64歲，平均年齡(55.7±5.8)歲；高中分化59例，低分化35例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例，無轉(zhuǎn)移24例。所有患者術(shù)前均未接受化療或放療，均簽訂知情同意書，經(jīng)三峽大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。并通過電話或E-mail的形式定期隨訪48個月，記錄患者的生存狀況和疾病進(jìn)展情況。

1.2 材料

TRIzol購自美國Invitrogen公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit、Premix EX Taq DNA聚合酶和SYBR Green購自寶生物工程(大連)有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)所用的ABl7300 RTFQ-PCR儀購自美國ABI公司，組織破碎儀購自美國Qiagen公司。

1.3 方法

組織先用組織破碎儀進(jìn)行破碎后提取癌組織和癌旁組織的總mRNA?？俶RNA提取按照TRIzol?RNA 提取試劑操作說明進(jìn)行，所得RNA溶解于RNase Free H2O。Nano Drop檢測RNA濃度及純度，保證RNA的完整性(D260nm/ D280nm大于2.0)。按照試劑盒說明書特異度反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行RTFQ-PCR檢測各組PANDAR 的表達(dá)。反應(yīng)條件：95 ℃，2 min預(yù)變性；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；70 ℃，30 s，45個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線及溶解曲線。每個樣本設(shè)3個副孔，實驗重復(fù)3次。PANDAR相對表達(dá)量以GAPDH作為內(nèi)參照。

PANDAR引物［18］設(shè)計如下順義鏈：5’-TGCACACATTTAACCCGAAG-3’；反義鏈：5’-CCCCAAAGCTACATCTATGACA-3’；GAPDH引物順義鏈：5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’；反義鏈：5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

PANDAR相對表達(dá)量采用ΔΔCt法分析，ΔCt=CtPANDAR-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCtRCC-ΔCtNormal，用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)水平。對所得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量采用表示，資料采用t檢驗。將患者按PANDAR表達(dá)水平及臨床特征分組列出四格表，采用χ2檢驗分析；采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗比較兩組患者生存差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PANDAR在NSCLC組織中低表達(dá)

經(jīng)RTFQ-PCR檢測后，在94對NSCLC組織中，81.9%(67/94)的PANDAR表達(dá)水平顯著低于其對應(yīng)的癌旁組織，其中平均相對表達(dá)量為1.97，高于平均值為高表達(dá)，低于平均值為低表達(dá)。NSCLC癌組織中PANDAR表達(dá)量明顯低于癌旁組織(t=-4.016，P＜0.001，圖1)。

2.2 PANDAR表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征關(guān)系

PANDAR表達(dá)在患者的年齡、性別、病理類型及吸煙史間直接進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0.05)，表明PANDAR表達(dá)與患者的年齡、性別、病理類型及吸煙史無關(guān)；而與腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病分期及分化程度比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05，表1)。

表 1 PANDAR表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系Tab. 1 The correlation between the expression of PANDAR and clinical pathological characteristics in NSCLC patients[n(%)]

圖 1 PANDAR在癌組織和癌旁組織中的差異表達(dá)Fig. 1 The expression level of PANDAR in non-small-cell lung cancer

2.3 PANDAR作為NSCLC潛在生物標(biāo)志物的診斷價值

用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評價PANDAR作為NSCLC潛在的生物標(biāo)志物的診斷價值。其中，ROC曲線的曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.797(95%CI：0.614～0.849；P＜0.001)；靈敏度和特異度分別是49.8%和84.3%；Youden指數(shù)為0.402(圖2)。此ROC曲線表明PANDAR在NSCLC中具有診斷價值。

2.4 PANDAR表達(dá)對患者生存關(guān)系的影響

對PANDAR在NSCLC患者生存關(guān)系中的影響進(jìn)行分析，PANDAR高表達(dá)組的患者平均OS為39個月(95%CI：34.9～45.3)，平均無進(jìn)展生存期(progression free survival，PFS)為43個月(95%CI：37.6～48.2)；PANDAR低表達(dá)組平均OS為28個月(95%CI：20.9～31.5)，平均PFS為23個月(95%CI：18.9～24.5)。對兩組患者采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存數(shù)據(jù)假設(shè)檢驗比較的log-rank檢驗表明，PANDAR的表達(dá)與NSCLC患者OS(χ2=7.282，P=0.007)及PFS(χ2=6.777，P=0.009)上的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，故可認(rèn)為兩組生存曲線不同(圖3)。從而表明PANDAR低表達(dá)與NSCLC不良預(yù)后顯著相關(guān)。

圖 2 NSCLC患者癌組織和癌旁組織的PANDAR ROC曲線Fig. 2 ROC curve of patients with NSCLC based on PANDAR expression in tumor tissues and adjacent tissues

圖 3 PANDAR表達(dá)與患者OS和PFS的關(guān)系Fig. 3 The relationship of PANDAR with OS and PFS

3 討 論

傳統(tǒng)的手術(shù)療法、化療和放射療法對于晚期NSCLC患者而言效果不理想。盡管NSCLC的診斷和治療已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展，其預(yù)后仍然很差，因此迫切需要對NSCLC發(fā)展機(jī)制進(jìn)行深入研究以研發(fā)新型且具有治療前景的診斷試劑，從而滿足每位NSCLC患者的治療需求。尋找能提升NSCLC臨床預(yù)后和確定最優(yōu)治療策略的新治療靶點具有重要意義。

多種lncRNA被發(fā)現(xiàn)與NSCLC相關(guān)。例如，HOTAIR在NSCLC中高度表達(dá)，與癌癥的預(yù)后顯著相關(guān)［18］；TUG1表達(dá)下調(diào)，通過調(diào)控p53影響NSCLC增殖［19］；HMLincRNA717表達(dá)下調(diào)，常預(yù)示預(yù)后不良［20］；PVT1在NSCLC中過表達(dá)，能促進(jìn)NSCLC進(jìn)展，影響患者預(yù)后［21］；PANDAR在Han等［22］的研究中被首次報道與NSCLC的疾病進(jìn)展和細(xì)胞凋亡相關(guān)。PANDAR屬于lncRNA，是NSCLC的預(yù)后標(biāo)志物，作為lncRNA，其癌基因的功能相當(dāng)復(fù)雜，且在不同的腫瘤中參與不同的信號通路，例如PANDAR在腎癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，且和腎癌TNM、AJCC分級和預(yù)后相關(guān)，提示其作為腎癌標(biāo)志物應(yīng)用于臨床的可能［23］。本研究選取檢測了lncRNA PANDAR的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者組織中PANDAR水平顯著低于相對應(yīng)的癌旁組織。

LncRNA在基因表達(dá)、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控、分化和凋亡等多種生物過程中發(fā)揮重要作用。我們推斷低表達(dá)的PANDAR可能與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。我們使用χ2檢驗來檢測PANDAR與各臨床病理特征間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PANDAR的表達(dá)受腫瘤體積大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病分期和分化程度等因素的影響，低水平的PANDAR與各因素均呈負(fù)相關(guān)，提示PANDAR可作為NSCLC預(yù)后的預(yù)測因素。本研究結(jié)果與Han等［22］報道的結(jié)果基本一致。

考慮到肺癌的不良預(yù)后及l(fā)ncRNA在癌癥中的重要作用，我們分析了NSCLC中PANDAR可能的預(yù)后作用。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)PANDAR的NSCLC患者平均OS及平均PFS較短，從而預(yù)示PANDAR低表達(dá)可作為NSCLC患者不良預(yù)后指標(biāo)。為進(jìn)一步檢測PANDAR在NSCLC中的診斷價值，我們通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，PANDAR具有NSCLC潛在的生物標(biāo)志物的診斷價值。以上結(jié)果表明，PANDAR在NSCLC診斷和預(yù)后中發(fā)揮重要作用。

總之，lncRNA PANDAR的表達(dá)失?？梢赃M(jìn)行NSCLC的疾病預(yù)后，并作為獨立的預(yù)后標(biāo)志。這一研究結(jié)果為NSCLC的治療提供了一個新的潛在標(biāo)記和治療手段。但受樣本數(shù)量限制，大樣本的深入研究有待進(jìn)一步開展，同時PANDAR在NSCLC中的生物功能及作用機(jī)制仍有待探究。

［1］ 宋 勇, 楊 雯. 2014年晚期非小細(xì)胞肺癌內(nèi)科治療進(jìn)展［J］. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 40(1): 10-15.

［2］ ETTINGER D S, WOOD D E, AKERLEY W, et al. Non-small cell lung cancer, version 6. 2015［J］. J Natl Compr Canc Netw, 2015, 13: 515-524.

［3］ 徐 燕, 王孟昭. 非小細(xì)胞肺癌免疫治療進(jìn)展［J］. 中國肺癌雜志, 2014, 46(3): 277-281.

［4］ CARPENTER S, AIELLO D, ATIANAND M K, et al. A long non-coding RNA mediates both activation and repression of immune response genes.［J］. Science, 2013, 341(6147): 789-792.

［5］ IMAMURA K, IMAMACHI N, AKIZUKI G, et al. Long non-coding RNA NEAT1-dependent SFPQ relocation from promoter region to paraspeckle mediates IL8 expression upon immune stimuli［J］. Mol Cell, 2014, 53(3): 393-406.

［6］ 胡 倩, 姚和瑞. 長鏈非編碼RNA與腫瘤研究現(xiàn)狀［J］.中華腫瘤防治雜志, 2014, 21(21): 1746-1750.

［7］ ZHANG E B, YIN D D, SUN M, et al. P53-regulated long non-coding RNA TUG1 affects cell proliferation in human non-small cell lung cancer, partly through epigenetically regulating HOXB7 expression［J］. Cell Death Dis, 2014, 5(5): 1243-1243.

［8］ ZHANG E, KONG R, YIN D, et al. Long non-coding RNA ANRIL indicates a poor prognosis of gastric cancer and promotes tumor growth by epigenetically silencing of miR-99a/miR-449a［J］. Oncotarget, 2014, 5(8): 2276-2292.

［9］ YUAN S, YANG F, YANG Y, et al. Long non-coding RNA associated with microvascular invasion in hepatocellular carcinoma promotes angiogenesis and serves as a predictor for hepatocellular carcinoma patients’ poor recurrence-free survival after hepatectomy［J］. Hepatology, 2012, 56(6): 2231-2241.

［10］ 潘林江, 王毅雯, 張麗潔, 等. 非小細(xì)胞肺癌組織中HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA的表達(dá)變化及意義［J］. 山東醫(yī)藥, 2016, 56(9): 1-3.

［11］ CESANA M, CACCHIARELLI D, LEGNINI I, et al. A long non-coding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA［J］. Cell, 2011, 147(2): 358-369.

［12］ HUARTE M, GUTTMAN M, FELDSER D, et al. A large intergenic non-coding RNA induced by p53 mediates global gene repression in the p53 response［J］. Cell, 2010, 142(3):409-419.

［13］ VANCE K W, PONTING C P. Transcriptional regulatory functions of nuclear long non-coding RNAs［J］. Trends Genet, 2014, 30(8): 348-355.

［14］ LI Z, CHAO T C, CHANG K Y, et al. The long noncoding RNA THRIL regulates TNFα expression through its interaction with hnRNPL ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(3): 1002-1007.

［15］ HUNG T, WANG Y, LIN M F, et al. Extensive and coordinated transcription of non-coding RNAs within cell-cycle promoters［J］. Nat Genet, 2011, 43(7): 621-629.

［16］ PENGPENG, WANG X Z. NF-YA underlies EZH2 upregulation and is essential for proliferation of human epithelial ovarian cancer cells［J］. Mol Cancer Res, 2013, 11(4): 9-11.

［17］ DALVAI M, MONDESERT O, BUGLER B, et al. Doxorubicin promotes transcriptional upregulation of Cdc25B in cancer cells by releasing Sp1 from the promoter.［J］. Oncogene, 2012, 32(42): 5123-5128.

［18］ JING C, WANG R, ZHANG K, et al. Long non-coding RNAs in non-small cell lung cancer as biomarkers and therapeutic targets［J］. J Cell Mol Med, 2014, 18(12): 2425-2436.

［19］ 李雨薇, 王裕民, 張雪瑩, 等. 長鏈非編碼RNA HOTAIR在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展［J］. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2015, 42(3): 228-235.

［20］ ZHANG E B, YIN D D, SUN M, et al. P53-regulated long non-coding RNA TUG1 affects cell proliferation in human non-small cell lung cancer, partly through epigenetically regulating HOXB7 expression.［J］. Cell Death Dis, 2014, 5(5): e1243-e1243.

［21］ XIE X, LIU H T, MEI J, et al. LncRNA HMlincRNA717 is down-regulated in non-small cell lung cancer and associated with poor prognosis［J］. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7(12): 8881-8886.

［22］ HAN L, ZHANG E B, YIN D D, et al. Low expression of long noncoding RNA PANDAR predicts a poor prognosis of nonsmall cell lung cancer and affects cell apoptosis by regulating Bcl-2［J］. Cell Death Dis, 2015, 6(2): e1665.

［23］ YANG Y R, ZANG S Z, ZHONG C L, et al. Increased expression of the lncRNA PVT1 promotes tumorigenesis in non-small cell lung cancer.［J］. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7(10): 6929-6935.

［24］ 金 露, 李一帆, 何 韜, 等. 長鏈非編碼RNA PANDAR在腎癌中的表達(dá)分析及臨床意義［J］. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2016(9): 1342-1345.

The expression and clinical signi ficance of PANDAR in non-small cell lung cancer

NIE Jun, ZHOU Bo, ZHANG Yulin
(Department of Thoracic Surgery, People’s Hospital of Sanxia University, Yichang 443000, Hubei Province, China)

NIE Jun E-mail: niejun197908@163.com

Background and purpose: Long non-coding RNA (lncRNA) is associated with carcinogenesis and cancer development. LncRNA promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA (PANDAR) was correlated with the progression and prognosis of various cancers. This study aimed to investigate the expression and clinical signi ficance of PANDAR in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods: Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) was used to detect PANDAR expression in 94 cases of NSCLC tissues and adjacent tissues. The association with patient clinic-pathological characteristics, diagnostic value and prognosis of PANDAR were further analyzed. Results: PANDAR expression was signi ficantly downregulated in the NSCLC compared with adjacent tissues (P＜0.001). There was signi ficant di ff erences between tumor size, lymphatic metastasis, TNM stage and histologic di ff erentiation in terms of PANDAR expression (χ2=9.197, P=0.002 4; χ2=7.126, P=0.008; χ2=6.271, P=0.012; χ2=8.147, P=0.004). The area under the curve (AUC) of receiver operating characteristic (ROC) curve was 0.797 (95%CI: 0.614-0.849; P＜0.001). The sensitivity and speci ficity were 49.8% and 84.3%, respectively. The index of Youden was 0.402. The di ff erences between PANDAR low expression and high expression groups were statistically signi ficant in overall survival time and progression free survival (χ2=7.282,P=0.007; χ2=6.777, P=0.009). Conclusion: The expression of PANDAR is down-regulated in patients with NSCLC and might prove useful as a biomarker for diagnosis and prognostic signi ficance.

Promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA; Non-small cell lung cancer; Receiver operating characteristic curve; Clinical pathological; Biomarker

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.07.008

R734.2

A

1007-3639(2017)07-0569-06

2017-02-09

2017-05-10）

聶 軍 E-mail：niejun197908@163.com