李美佳，張維娜，渠開攀，王 冰

1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷整形外科，山東 青島 266000；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，山東 青島 266000

跨膜接頭蛋白CBP對皮膚鱗癌細(xì)胞A431生長增殖的負(fù)調(diào)控作用研究

李美佳1，張維娜1，渠開攀1，王 冰2

1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷整形外科，山東 青島 266000；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，山東 青島 266000

背景與目的：跨膜接頭蛋白(Csk-binding protein，CBP)是新發(fā)現(xiàn)的Src家族成員，與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。該研究旨在觀察CBP基因過表達(dá)對皮膚鱗癌細(xì)胞系A(chǔ)431增殖及細(xì)胞凋亡的影響，探討其相關(guān)的分子機(jī)制。方法：構(gòu)建CBP-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)融合蛋白的慢病毒過表達(dá)載體，采用反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的方法建立CBP過表達(dá)的A431細(xì)胞株。實驗分為親本細(xì)胞組(未進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的A431細(xì)胞)、對照組(A431細(xì)胞轉(zhuǎn)染僅含EGFP陰性對照病毒)和實驗組(A431細(xì)胞轉(zhuǎn)染CBP-EGFP病毒)。在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，驗證轉(zhuǎn)染成功與否；CCK-8法檢測CBP過表達(dá)對A431細(xì)胞增殖能力的影響，并采用流式細(xì)胞術(shù)( flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測對細(xì)胞凋亡的影響；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)和蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測Lck、Csk和Fyn三種上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子分別在mRNA和蛋白中的表達(dá)水平變化。結(jié)果：建立了穩(wěn)定過表達(dá)CBP的A431細(xì)胞株；CCK-8法結(jié)果提示，CBP過表達(dá)明顯抑制細(xì)胞生長，第2～6天的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；FCM檢測顯示，實驗組細(xì)胞凋亡率顯著增加，與親本細(xì)胞組及對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)；RTFQ-PCR結(jié)果顯示，實驗組A431細(xì)胞Lck mRNA的相對表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.001)，實驗組細(xì)胞Csk和Fyn mRNA的表達(dá)分別約為親本細(xì)胞組的1.6倍和3.8倍，表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.001)；Western blot結(jié)果表明，實驗組Lck蛋白的相對表達(dá)水平明顯下降(P＜0.001)，實驗組細(xì)胞Csk和Fyn蛋白與親本細(xì)胞組和對照組相比表達(dá)明顯增加(P＜0.001)。結(jié)論：CBP過表達(dá)可抑制皮膚鱗癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及壞死。CBP通過調(diào)節(jié)上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的蛋白酪氨酸激酶Lck、Csk和Fyn來調(diào)控細(xì)胞的增殖活性。

皮膚鱗癌；跨膜接頭蛋白；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC)起源于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，是世界第2常見的非黑色素瘤皮膚癌［1］。皮膚鱗癌的發(fā)病涉及多個基因的改變［2］，其具體的機(jī)制當(dāng)前尚未完全闡明，因此，進(jìn)一步尋找與該病發(fā)生相關(guān)的基因是一項非常有意義的工作。跨膜接頭蛋白(Csk-binding protein，CBP)是近年來新發(fā)現(xiàn)的Src家族中的一個成員，其主要參與細(xì)胞的生長、增殖和分化等過程，并與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)［3］。但CBP對皮膚鱗癌生物學(xué)特性的影響及與皮膚鱗癌發(fā)生的關(guān)系，相關(guān)研究較少。本實驗初步探討CBP過表達(dá)對皮膚鱗癌的細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人皮膚鱗癌細(xì)胞株A431購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，CBP-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)融合蛋白及慢病毒載體由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建。CCK-8購自北京泛博生物化學(xué)有限公司。Annexin V apoptosis detection kit APC購自美國eBioscience公司。Csk、Fyn和Lck引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量試劑盒均購自美國Roch公司。兔抗人Csk、Fyn和Lck多克隆抗體購自美國Abgent公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自生工生物工程(上海)股份有限公司。ECL發(fā)光試劑購自美國Thermo公司。激光共聚焦顯微鏡為Leica SP8。流式細(xì)胞儀為美國BD公司C6。PCR儀為美國Bio-Rad公司CFX96。

1.2 方法

1.2.1 CBP過表達(dá)細(xì)胞株制備

根據(jù)慢病毒載體操作說明，收集處于對數(shù)生長期的正常A431細(xì)胞，以5 000個/孔接種于96孔板內(nèi)，按MOI值為100加入反轉(zhuǎn)錄病毒。轉(zhuǎn)染96 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白熒光表達(dá)，檢測轉(zhuǎn)染率，擴(kuò)大培養(yǎng)建立穩(wěn)定的CBP過表達(dá)細(xì)胞株。實驗分為親本細(xì)胞組(未進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的A431細(xì)胞)、對照組(A431細(xì)胞轉(zhuǎn)染僅含EGFP陰性對照病毒)和實驗組(A431細(xì)胞轉(zhuǎn)染CBP-EGFP病毒)。

1.2.2 CCK-8檢測各組細(xì)胞增殖率

收集處于對數(shù)生長期的上述3組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，分別接種于96孔板，100 μL/孔。以上各組均設(shè)立1個調(diào)零孔和4個平行復(fù)孔。在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下預(yù)培養(yǎng)24 h后開始檢測0、24、48、72、96和120 h(即第1、2、3、4、5和6天)6個時間點細(xì)胞增殖情況，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)溫育2 h，多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度(D)值。以D值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測細(xì)胞凋亡

收集處于對數(shù)生長期的上述3組細(xì)胞，以5×104個/孔接種于12孔板內(nèi)，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下預(yù)培養(yǎng)24 h完全貼壁后，撤血清饑餓12 h，再換成10%的G-DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h。分別用0.25%胰蛋白酶消化各組細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，冷PBS、1×Binding Buffer各洗滌細(xì)胞1次，再用100 μL 1×Binding Buffer重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL。取1 mL加入2.5 μL Annexin V-APC避光室溫下反應(yīng)15 min，2 300×g離心30 s后用500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，再加2.5 μL PI，用4 0 0目的篩網(wǎng)過濾后，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)

收集以上各組A431細(xì)胞，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，SYBR Green標(biāo)記產(chǎn)物，按照RTFQ-PCR檢測試劑盒操作說明建立反應(yīng)體系。反應(yīng)條件： 95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s、 60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s，40個循環(huán)。各樣品目的基因和管家基因進(jìn)行RTFQ-PCR反應(yīng)，分別獲得Ct值，通過2-△△Ct方法分析各樣品相對CBP表達(dá)差異，每組實驗重復(fù)3次。各組實驗以親本細(xì)胞組的表達(dá)量設(shè)定為1，計算出其他組的相對表達(dá)量，以相對倍數(shù)進(jìn)行作圖。所檢測的基因及相關(guān)PCR引物序列見表1。

1.2.5 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測

收集對數(shù)生長期的3組細(xì)胞，每組約107個細(xì)胞，加入200 μL預(yù)冷的蛋白裂解液4 ℃裂解2 h，4 ℃下20 800×g離心20 min，收集上清。BCA法測定蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min。10%SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫低速搖床封閉2 h，加入一抗4 ℃搖床過夜溫育。TBST漂洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫?fù)u床溫育2 h。加入ECL顯色液，室溫避光溫育3～5 min，曝光、顯影。

表 1 RTFQ-PCR引物Fig. 1 RTFQ-PCR Primer

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CBP在A431細(xì)胞中的表達(dá)

反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞(MOI值為100)，轉(zhuǎn)染72 h后出現(xiàn)綠色熒光，熒光表達(dá)于細(xì)胞膜，轉(zhuǎn)染后96 h熒光表達(dá)達(dá)到高峰，轉(zhuǎn)染細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下觀察，實驗組和對照組均可見綠色熒光幾乎遍布整個視野(圖1A、C)，同時采集同視野兩組細(xì)胞在普通光鏡下分布情況(圖1B、D)，兩種病毒的轉(zhuǎn)染率均接近100%，說明建立了穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

2.2 CBP過表達(dá)對A431細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法對3組細(xì)胞的生長情況進(jìn)行檢測，第1～5天，親本細(xì)胞組和對照組細(xì)胞增殖率均在逐漸增加，第6天開始趨于穩(wěn)定，兩組之間各時間點增殖效率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。實驗組細(xì)胞在檢測的第2～6天內(nèi)的增殖效應(yīng)明顯低于親本細(xì)胞組和對照組，統(tǒng)計分析顯示，第2～6天組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示CBP過表達(dá)明顯抑制細(xì)胞的生長效率(圖2)。

圖 1 激光共聚焦顯微鏡觀察反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染效率Fig. 1 The transfection e fficiency was examined by laser confocal scanning microscope

圖 2 CCK-8檢測CBP過表達(dá)對細(xì)胞增殖能力的影響Fig. 2 The e ff ect of overexpression CBP on prolieration ability of human cSCC cell line A431 were detected by CCK-8 assay

2.3 CBP過表達(dá)對A431細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin V Apoptosis Detection Kit APC染色，F(xiàn)CM檢測的散點圖分析結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞發(fā)生中晚期凋亡壞死的細(xì)胞為(27.2±0.70)%，親本細(xì)胞組和對照組分別為(9.9±1.50)%和(15.33±2.00)%。由此可見，實驗組細(xì)胞出現(xiàn)凋亡及壞死的數(shù)量顯著增多，與親本細(xì)胞組及對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001，圖3)，說明CBP過表達(dá)可以誘導(dǎo)A431細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象。

2.4 CBP過表達(dá)對Lck、Csk和Fyn在mRNA中表達(dá)水平的影響

RTFQ-PCR檢測結(jié)果表明，實驗組A431細(xì)胞Lck mRNA的表達(dá)約為親本細(xì)胞組的0.4倍，相對表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.001)，親本細(xì)胞組與對照組之間表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；實驗組細(xì)胞Csk和Fyn mRNA的表達(dá)分別約為親本細(xì)胞組的1.6倍和3.8倍，表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.001)，親本細(xì)胞組與對照組之間表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖4)。

2.5 Western blot檢測Lck、Csk和Fyn蛋白表達(dá)水平

We s t e r n b l o t結(jié)果顯示，與對照組(0.857±0.007)和親本細(xì)胞組(0.910±0.006)相比，實驗組Lck蛋白的相對表達(dá)水平(0.809±0.016)明顯下降(P＜0.001)，親本細(xì)胞組與對照組的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；實驗組細(xì)胞Csk和Fyn蛋白相對表達(dá)(0.786±0.006，1.313±0.039)與親本細(xì)胞組(0.542±0.007，0.000±0.000)和對照組(0.527±0.007，0.416±0.008)相比明顯增加(P＜0.001，圖5)。這與3種基因在mRNA水平的表達(dá)結(jié)果相一致。

圖 3 FCM法檢測CBP過表達(dá)對A431細(xì)胞凋亡的影響Fig. 3 The e ff ect of overexpression CBP on apoptosis and mortality rate of human cSCC cell line A431 were detected by FCM

圖 4 RTFQ-PCR分析CBP過表達(dá)對Lck，Csk和Fyn在mRNA表達(dá)水平的影響Fig. 4 The in fluence of overexpression CBP on the relative mRNA expression of Lck, Csk and Fyn assayed by RTFQ-PCR

圖 5 Western blot檢測CBP在A431細(xì)胞中過表達(dá)對Lck，Csk和Fyn活性的影響Fig. 5 The in fluence of overexpression CBP on the activation of Lck, Csk and Fyn measured by Western blot

3 討 論

皮膚鱗癌的發(fā)生大多位于暴露輻射紫外線較多的皮膚部位，如面部和上肢，致使外形受損，嚴(yán)重影響患者的身心健康。有研究顯示，其發(fā)病率一直呈持續(xù)上升趨勢，給衛(wèi)生保健系統(tǒng)造成巨大的負(fù)擔(dān)，因此其防治越來越受到重視［4］。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)及遺傳學(xué)的發(fā)展，靶分子治療在皮膚鱗癌中的應(yīng)用越來越受關(guān)注。CBP是2000年發(fā)現(xiàn)報道的新基因，是跨膜接頭蛋白家族成員之一，腫瘤相關(guān)性是其研究的熱點［3］。關(guān)于CBP在腫瘤中的表達(dá)和其在腫瘤中的生物學(xué)影響的報道不少，但在不同類型的腫瘤中，其表達(dá)結(jié)果各異。在神經(jīng)母細(xì)胞細(xì)胞系中，敲除CBP基因可促進(jìn)其增殖，使CBP過表達(dá)則出現(xiàn)明顯的抑制作用，提示CBP可能在某些類型的腫瘤中起抑制作用［5］。然而，在腎癌組織中，CBP過表達(dá)有致癌作用，并與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)［6］。在非小細(xì)胞肺癌中，CBP明顯抑制伴有c-Src上調(diào)類型的腫瘤細(xì)胞生長，而對不伴有c-Src上調(diào)類型的腫瘤細(xì)胞沒有抑制作用［7］。因此，CBP的作用機(jī)制根據(jù)腫瘤類型不同而不同［3］。

為了探討CBP對皮膚鱗癌的作用，本實驗將構(gòu)建有CBP基因的載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入A431細(xì)胞中，觀察CBP過表達(dá)對A431細(xì)胞增殖及凋亡的影響。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，CBP表達(dá)上調(diào)可使細(xì)胞增殖活性明顯下降。細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，上調(diào)表達(dá)CBP有助于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，甚至導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生壞死。CBP主要由SFK家族的Fyn磷酸化激活后招募胞質(zhì)蛋白Csk到脂筏上，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)SFKs參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和惡性疾病發(fā)?。?］。也有研究證明，CBP-Fyn-Sam68-RasGAP復(fù)合體參與SFK負(fù)性調(diào)控Ras蛋白［9］。本研究通過RTFQ-PCR和Western blot檢測Csk和Fyn蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，實驗組伴隨外源性CBP表達(dá)的提高，Csk及Fyn的表達(dá)都顯著提高。Lck是細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的上游激活蛋白。提示CBP表達(dá)增強(qiáng)后，會相應(yīng)的抑制Lck表達(dá)，阻斷Lck的激酶活性。因此，我們認(rèn)為CBP招募CSK進(jìn)入脂筏發(fā)揮抑制作用，可能主要是通過阻斷LCK等活化類蛋白酪氨酸激酶的磷酸化，進(jìn)而阻斷了下游信號的傳導(dǎo)。

本研究表明，CBP的表達(dá)可以抑制皮膚癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具有明顯的抑癌效應(yīng)。它是一種新的腫瘤抑制基因，可通過調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)蛋白酪氨酸激酶的表達(dá)來實現(xiàn)其功能。后續(xù)需要圍繞CBP對皮膚癌細(xì)胞的侵襲、遷移及體內(nèi)效應(yīng)展開進(jìn)一步的研究。

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CBP mediates negative regulation of growth and proliferation of cutaneous squamous cell carcinoma A431 in vitro

LI Meijia1, ZHANG Weina1, QU Kaipan1, WANG Bing2

(1. Department of Burn and Plastic Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China; 2. Department of Immunology, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China)

WANG Bing E-mail: wangbing@qdu.edu.cn

Background and purpose: The transmembrane adaptor Csk-binding protein (CBP), a recently identi fied tyrosine kinase of the Src family, is implicated in various aspects of cancer cell biology. This study aimed to investigate the e ff ect of the transmembrane protein CBP on the proliferation and apoptosis ability of A431 cells of human cutaneous squamous cell carcinoma and the implicated molecular mechanism. Methods: The CBP-EGFP lentiviral vector was constructed. A431 cells were transfected with CBP-EGFP lentiviral vector or negative-EGFP lentiviral vector, or remained untransfected. The transfection efficiency was detected by laser confocal microscope. After additional culture, the proliferation potential of A431 cells was assayed with CCK-8, and the apoptotic rate was assessed by flow cytometry (FCM). Lck, Csk and Fyn mRNA levels were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) and their protein levels by Western blot. Results: The A431 cell line with overexpression ofPAG was constructed successfully. CCK-8 results suggested that overexpression of CBP markedly inhibited cell growth, with statistically signi ficant di ff erences at 2-6 days between the groups (P＜0.05). FCM showed that both the apoptotic rate and the death rate of the cells transfected with CBP-EGFP lentiviral vector were increased signi ficantly compared to those of the cells transfected with negative-EGFP lentiviral vector or untransfected cells (P＜0.001). RTFQ-PCR results showed that the Lck mRNA relative expression level of the cells transfected with CBP-EGFP lentiviral vector was signi ficantly reduced (P＜0.001), but Csk and Fyn mRNA expression levels were 1.6 times and 3.8 times as high as the untransfected cells, respectively (P＜0.001). Western blot results showed that the Lck protein level was signi ficantly decreased after transfection with CBP-EGFP lentiviral vector (P＜0.001), whereas the Csk and Fyn protein levels were signi ficantly increased (P＜0.001). Conclusion: The ectopic expression of CBP might inhibit the proliferation or growth of A431 cells, induce cell apoptosis and accelerate cell death, which may be related to down-regulation of Lck and up-regulation of Csk and Fyn expression.

cutaneous squamous cell carcinoma; Csk-binding protein; proliferation; apoptosis

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.07.002

R739.5

A

1007-3639(2017)07-0527-06

2017-02-01

2017-03-30）

王 冰 E-mail: wangbing@qdu.edu.cn