簡文靜，邵 康，肖 瑜，曹博洋，謝欣彤，盛海艷，宋淑芬，劉仁斌，王先明

1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，廣東 廣州 510630；

2.深圳市第二人民醫(yī)院甲乳外科，廣東 深圳 518035；

3.深圳華大基因研究院，廣東 深圳 518083

MUTYH c.892-2A＞G剪切位點突變在家族性乳腺癌中的意義

簡文靜1,2，邵 康3，肖 瑜2，曹博洋3，謝欣彤2，盛海艷2，宋淑芬2，劉仁斌1，王先明2

1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，廣東 廣州 510630；

2.深圳市第二人民醫(yī)院甲乳外科，廣東 深圳 518035；

3.深圳華大基因研究院，廣東 深圳 518083

背景與目的：MUTYH基因變異與結(jié)直腸癌患癌風(fēng)險升高有關(guān)，但其突變與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性尚不明確，該研究探討MUTYH c.892-2A＞G剪切位點突變在中國家族性乳腺癌中的意義。方法：采用二代測序(next generation sequencing，NGS)方法檢測95個家族性乳腺癌患者及親屬MUTYH基因突變情況，并與BRCA1、BRCA2基因突變情況進(jìn)行比較。結(jié)果：95個家系224名受試者中有4個家系共7名受試者檢出MUTYH c.892-2A＞G突變，突變率為3.1%，其中只有1例先證者檢出MUTYH c.892-2A＞G突變。95個家系中也只有1例先證者檢出攜帶BRCA1突變；5個家系中共9名受試者檢出攜帶BRCA2突變，突變率為4.0%。MUTYH c.892-2A＞G突變?nèi)藬?shù)分別與BRCA2、BRCA1突變?nèi)藬?shù)相比較，不存在基因共突變現(xiàn)象。結(jié)論：MUTYH c.892-2A＞G突變雖然在有乳腺癌家族史的高危正常人群中突變率較高，但很可能是低外顯的乳腺癌發(fā)生相關(guān)的致病位點。

MUTYH；家族性乳腺癌；BRCA1；BRCA2

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤。5年流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，全世界約有11%的乳腺癌發(fā)生在中國，且發(fā)病率在迅速上升［1］。有家族史或攜帶遺傳突變基因是乳腺癌發(fā)生的高風(fēng)險因素。目前已知的乳腺癌易感基因BRCA1及BRCA2，其突變、重排及缺失僅與小于15%的家族性乳腺癌發(fā)生有關(guān)［2］，表明還有很多促進(jìn)家族性乳腺癌發(fā)生的突變基因還未被發(fā)現(xiàn)或證實。最近一項大型的協(xié)同研究發(fā)現(xiàn)，1個多基因風(fēng)險評分方法低于1%的個體，家族史對其有更大的影響，預(yù)示著稀有的基因突變很可能對乳腺癌有重要影響［3］。

MUTYH基因是一個參與DNA損傷后堿基切除修復(fù)的基因［2,4］，大量研究發(fā)現(xiàn)，MUTYH基因變異與結(jié)直腸癌患癌風(fēng)險升高有關(guān)［4-7］。但有研究表明，MUTYH基因突變與乳腺癌發(fā)生相關(guān)性尚不明確［8-11］。且在中國人群中，MUTYH突變與乳腺癌發(fā)生相關(guān)性的報道較少。因此，本項目旨在研究MUTYH c.892-2A＞G剪切位點突變在家族性乳腺癌中的分布頻率與特征，并對比BRCA1及BRCA2基因突變，觀察它們是否有共突變現(xiàn)象，探討MUTYH c.892-2A＞G剪切位點突變在家族性乳腺癌中的意義，為家族性乳腺癌風(fēng)險評估提供新依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

選取2014年12月—2016年10月來自深圳地區(qū)醫(yī)院95個乳腺癌家系共224名受試者作為研究對象，其中乳腺癌患者104例，未患乳腺癌的受試者120名。家族性乳腺癌定義為家族成員中有2個以上1級親屬患乳腺癌。所有乳腺癌患者均經(jīng)病理學(xué)確診。乳腺癌患者年齡為25～80歲，中位年齡為54歲。未患乳腺癌的受試者年齡為11～77歲，中位年齡為36歲。所有受試者參加研究前均知情同意，并簽署知情同意書。未患乳腺癌的受試者年齡低于18歲者，均由其監(jiān)護人代理簽署同意書。

1.2 主要試劑

血液DNA提取試劑盒QIAamp? DNA Blood mini kit購自德國QIAGEN公司，PCR擴增試劑KAPA2G? Robust HotStart ReadyMix購自美國Kapa Biosystems公司，DNA分子量Marker購自寶生物工程(大連)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，二代測序(next generation sequencing，NGS)和Sanger測序由深圳華大基因研究院完成。

1.3 實驗方法

1.3.1 人全血DNA的提取

每個受試者使用EDTA抗凝管收集約5 mL靜脈血，經(jīng)DNA提取試劑盒QIAamp?DNA Blood mini kit提取樣本中基因組DNA 200 μL，使用Qubit?2.0檢測DNA濃度，每份樣本的DNA獲得量大于等于2 μg。

1.3.2 樣本的文庫構(gòu)建與上機測序

基因組DNA經(jīng)隨機打斷、純化、末端修復(fù)加A后，與Hiseq測序所需特殊接頭連接，然后經(jīng)PCR預(yù)擴增，乳腺癌易感基因芯片目標(biāo)區(qū)域靶向雜交捕獲和PCR再擴增后，得到目標(biāo)區(qū)域DNA的Hiseq上機文庫。經(jīng)質(zhì)控合格后的文庫DNA，按照Hiseq測序平臺的操作說明進(jìn)行上機測序，保證每個文庫的原始數(shù)據(jù)量達(dá)到0.6 Gb以上，目標(biāo)區(qū)域的平均測序深度為200X，目標(biāo)區(qū)域覆蓋度超過99%。

1.3.3 生物信息分析與突變解讀

下機數(shù)據(jù)由華大基因研究院進(jìn)行專業(yè)解讀，首先對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理和質(zhì)量控制，然后將所得序列用BWA軟件比對到人的參考基因組Hg19上，經(jīng)Picard和GATK軟件去重，校正和突變檢測后，找到樣本中的點突變和插入或缺失突變；最后，對目標(biāo)區(qū)域的乳腺癌易感基因突變進(jìn)行解讀，找出致病突變。

1.3.4 Sanger驗證

為了驗證高通量測序所獲MUTYH突變位點的準(zhǔn)確性，采用金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測序技術(shù)對突變位點進(jìn)行測序驗證。首先對該突變位點所在的區(qū)域設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴增，引物序列為MUTYH-892_F：5’-AGAACTGGAA TGGGGCTTCT-3’；MUTYH-892_R：5’-CAGCCCAGGCTAACTCTTTG-3’，然后以提取的基因組DNA為模板，使用設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴增，擴增的條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性25 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；最后72 ℃充分延伸8 min。40 μL擴增的體系為：2X Kapa2G Robust HotStart ReadyMix 20 μL，引物F和R各2 μL(10 μmol/L)，DNA模板1 μL(50 ng/μL)，最后加雙蒸水補至40 μL。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證后，進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化及測序。最后根據(jù)測序峰圖分析目標(biāo)位點的突變情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，MUTYH c.892-2A＞G剪切位點突變頻率分別與BRCA1、BRCA2基因突變頻率的比較采用配對資料的t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MUTYHc.892-2A＞G突變的檢出及驗證

收集95個家系共224名受試者的外周血，分離出白細(xì)胞，提取DNA及建庫后，用NGS技術(shù)對MUTYH基因全外顯子及其外顯子與內(nèi)含子連接區(qū)域進(jìn)行檢測。在這224名受試者中，7名受試者檢出MUTYH c.892-2A＞G突變，突變信息見表1。接著我們將檢測出的MUTYH c.892-2A＞G剪切突變位點進(jìn)行Sanger測序及PCR電泳以進(jìn)一步驗證(圖1、2)。該突變發(fā)生在該基因1號染色體，在氨基酸編碼區(qū)892位上的2個bp堿基A突變?yōu)镚，是雜合的剪切位點突變。該基因位點在千人數(shù)據(jù)庫正常人群中的突變頻率為0.3%，在東亞人群中的突變率為2.77%。其在ClinVar數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)中均有報道［10］，被判定為引起遺傳性腫瘤發(fā)病風(fēng)險升高的致病突變。

7名受試者分別來自4個有乳腺癌家族史的家系。家系圖譜見圖3。在家系1中，我們只檢測了先證者及其女兒，先證者未檢出該突變，而其未患病的女兒攜帶該突變。在家系2中，我們檢測了先證者、先證者姐姐及其4個外甥女，發(fā)現(xiàn)先證者亦未攜帶該突變，而其4個外甥女中有3個攜帶該突變。在家系3中，我們檢測了先證者、先證者姐姐及其女兒，只發(fā)現(xiàn)先證者及其女兒都攜帶MUTYH基因突變，未檢出攜帶其它基因突變；而先證者的姐姐未發(fā)現(xiàn)攜帶該基因突變(圖1)。在家系4中，我們檢測了先證者、先證者姐姐及先證者女兒，發(fā)現(xiàn)其姐姐攜帶該突變，而先證者及其女兒不攜帶該突變。即4個家族的先證者中只有1個先證者發(fā)現(xiàn)MUTYH c.892-2A＞G剪切位點突變，其余6個均為不同家系先證者的未患病親屬。

表 1 MUTYH c.892-2A＞G突變位點在千人數(shù)據(jù)庫及東亞人群中的突變頻率Tab. 1 Mutation frequencies of MUTYH c.892-2A＞G in 1 000 genomes project and East Asians

圖 1 Sanger測序驗證MUTYH c.892-2A＞G位點突變測序圖Fig. 1 Picture of MUTYH gene mutation veri fied by Sanger sequencing

圖 2 樣本2和5是家系3的兩個受試者的MUTYH c.892-2A＞G位點突變PCR電泳圖，在567 bp處可見清晰的目標(biāo)條帶Fig. 2 Electrophoresogram of MUTYH c.892-2A＞G was tested by PCR, and patients 2 and 5 from the third family in the red frames were MUTYH c.892-2A＞G with target bands at 567 bp

2.2MUTYHc.892-2A＞G突變頻率與BRCAs突變頻率比較

我們同時檢測了這95個家系的BRCA1和B R C A 2基因突變情況，檢測結(jié)果見表2。在這9 5個家系中，有1個家系的先證者存在BRCA1突變，有5個家系共9個受試者存在B R C A 2突變，這6個家系發(fā)生BRCA突變的位點不一致，它們核酸改變位點分別是BRCA2基因位點c.793+1G＞C、c.7617+1G＞A、c.8946_8947delAG、c.9100C＞T、c.5344_5345insA及BRCA1基因位點c.3770_3771delAG。

我們將MUTYH c.892-2A＞G突變?nèi)藬?shù)分別與BRCA1、BRCA2基因突變?nèi)藬?shù)進(jìn)行比較，雖然結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但MUTYH c.892-2A＞G在這95個家族中有7個受試者存在突變(7/224)，而且主要發(fā)生在目前未患病的受試者中(6/7)，而BRCA2、BRCA1在6個家族中的突變位點各不相同，突變率分別為2/224和1/224，并且這6個家族的先證者都存在BRCA1或BRCA2突變(表2、3)。另外，我們沒有觀察到這95個家系人群中存在MUTYH與BRCA基因共突變現(xiàn)象。

圖 3 四個家系圖譜Fig. 3 Pedigree maps of four families

表 2 6個家系中BRCA1/2基因的突變信息及在千人數(shù)據(jù)庫中的突變頻率Tab. 2 BRCA1/2 gene mutation in six families with breast cancer and their mutation frequency in 1 000 genomes project

表 3 MUTYH c.892-2A＞G突變與BRCA1/2基因突變頻率的比較Tab. 3 Comparison of mutation frequency between MUTYH c.892-2A＞G and BRCA1/2 genes

3 討 論

5%～10%的乳腺癌是由于基因突變異常而從家族遺傳而來的。與乳腺癌遺傳相關(guān)的重要基因BRCA1、BRCA2突變，使BRCA1、BRCA2表達(dá)缺失而導(dǎo)致乳腺癌和(或)卵巢癌的產(chǎn)生。有研究表明，攜帶BRCA1突變的人群患乳腺癌的概率為50%～90%，而攜帶BRCA2突變的人群患乳腺癌或卵巢癌的概率為41%～87%［12］。但除了BRCA1/2基因突變外，還存在其他稀有的基因，如CDH1、CHEK2、BARD1、MUTYH及PALB2等基因的突變可能與遺傳性家族性乳腺癌相關(guān)。但這些基因突變在中國家族性乳腺癌中的研究較少。

人MUTYH基因位于1號染色體短臂，包含15個內(nèi)含子與16個外顯子，編碼含535個氨基酸的蛋白［13］，參與氧化堿基8-oxodG錯誤復(fù)制所導(dǎo)致的錯配修正［4］。若MUTYH基因發(fā)生突變，DNA修復(fù)缺陷很可能導(dǎo)致癌癥的易感性［13-14］。多項研究證實，MUTYH突變與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)，如MUTYH突變在結(jié)直腸癌、MUTYH相關(guān)性息肉病發(fā)生中的分子機制被廣泛研究［4,15-17］。而在乳腺癌研究中，MUTYH突變與乳腺癌發(fā)生風(fēng)險相關(guān)性尚存在爭議［9-11,16］。如有研究報道顯示，在有乳腺癌及結(jié)直腸癌家族史的人群中，MUTYH突變的頻率有所增加，并認(rèn)為雜合的MUTYH突變與乳腺癌的表型有關(guān)［11］。但另一項病例對照研究結(jié)果顯示，不能確定MUTYH突變與乳腺癌是否有相關(guān)性［9］。在中國人群中，AluYb8MUTYH等位基因頻率可能與早發(fā)型乳腺癌有關(guān)［16］。

本研究發(fā)現(xiàn)，95個乳腺癌家系中MUTYH c.892-2A＞G突變主要在有乳腺癌家族史而目前未患乳腺癌的親屬(3.1%)中被檢出。在1000 Genomes Project中該基因位點突變的總頻率為0.3%，在東亞人種中的突變頻率為2.7%，說明MUTYH c.892-2A＞G突變是東亞人群特有的高頻突變，其與乳腺癌的家族血統(tǒng)有關(guān)。但在本研究中，只有1例乳腺癌患者檢測出MUTYH c.892-2A＞G位點突變，同時沒有檢測出攜帶其它基因突變(本研究課題檢測了27個與家族性乳腺癌發(fā)生相關(guān)的基因)，該基因位點突變在該家系中是否符合家系共分離現(xiàn)象還有待進(jìn)一步考究。但有研究表明，MUTYH c.892-2A＞G位點突變后，會產(chǎn)生異常的轉(zhuǎn)錄本，截短MUTYH蛋白的表達(dá)；并且突變的蛋白出現(xiàn)核定位失?。?8］，可能導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)缺陷，引起腫瘤的發(fā)生。其次，因為BRCA1/2是目前公認(rèn)的乳腺癌遺傳相關(guān)的基因，攜帶BRCA基因突變的人群患乳腺癌的概率為40%～90%。因此本研究亦比較了MUTYH c.892-2A＞G突變與BRCAs突變的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者無明顯關(guān)聯(lián)，也沒有檢測出有MUTYH與BRCAs基因共突變現(xiàn)象。但是從檢出分布來看，在這些研究家系中，MUTYH c.892-2A＞G突變主要分別在有乳腺癌家族史的高危健康人群中，僅有一個家系的先證者攜帶，而BRCAs陽性突變位點在每個家系中不一致，且每個陽性家系的先證者都有BRCAs突變。這些結(jié)果也進(jìn)一步表明，MUTYHc.892-2A＞G突變與中國家族乳腺癌的發(fā)生有一定的關(guān)系，但很可能是一個低外顯遺傳易感基因，需要進(jìn)一步擴大樣本量，也需要延長隨訪時間觀察這些攜帶者將來是否發(fā)生乳腺癌。從家系1和家系2的分布來看，兩個家系的先證者都未攜帶MUTYHc.892-2A＞G突變，而在她們的一級親屬及二級親屬，都發(fā)生了MUTYH突變，該突變是從父系遺傳過來還是新生突變？很遺憾我們未能檢測父系的樣本。

本研究初步探討了MUTYHc.892-2A＞G剪切位點突變在中國家族性乳腺癌中的分布特征，盡管其可能是與乳腺癌發(fā)生相關(guān)的低外顯基因，但仍需重視，尤其是乳腺癌和腸道腫瘤家族史都存在的家系人群更應(yīng)密切關(guān)注該基因的突變情況，為腫瘤防治提供一定依據(jù)。

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The signi ficance of MUTYH c.892-2A＞G splicing mutation in familial breast cancer

JIAN Wenjing1,2, SHAO Kang3, XIAO Yu2, CAO Boyang3, XIE Xintong2, SHENG Haiyan2, SONG Shufen2, LIU Renbin1, WANG Xianming2
(1. Department of Thyroid and Breast Surgery, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China; 2. Department of Thyroid and Breast Surgery, the Second People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China; 3. BGI-Research, BGI, Shenzhen 518083, Guangdong Province, China)

LIU Renbin E-mail: liur@vip.163.com

Background and purpose: It is suggested that MUTYH mutation is closed to high colorectal cancer risk, but it is not clear that the relationship between MUTYH mutation and susceptibility to familiar breast carcinoma. The study was to investigate the significance of MUTYH c.892-2A＞G splicing mutation in familial breast cancer. Methods: The mutations of MUTYH，BRCA1 and BRCA2 genes were tested by the next generation sequencing (NGS) method in total of 224 participants， from 95 families with breast cancer patients (containing breast cancer patients and their relatives), and then comparisons were carried out between them. The mutations detected by NGS were veri fied by Sanger sequencing. Results: Seven participants from 4 families had a MUTYH c.892-2A＞G splicing mutation, with a mutation rate of 3.1% (7/224), of which only one proband carried with this mutation. In 224 participants, only one proband carried with BRCA1 mutation. While 9 participants from 5 families had BRCA2 mutations, and their mutation rate was 4% (9/224). Further the BRCA2 mutation site detected in the proband of every family was not the same. There were no signi ficant di ff erences between the number of MUTYH c.892-2A＞G mutation and BRCA2 mutation or betweenthe number of MUTYH c.892-2A＞G mutation and BRCA 1 mutation. And there was no case which existed MUTYH and BRCAs gene co-mutations. Conclusion: Although its high mutation rate happens in the high-risk healthy population with a history of breast cancer, MUTYH c.892-2A＞G is likely to be a low penetrance gene mutation of susceptibility to breast cancer.

MUTYH; Familial breast cancer; BRCA1; BRCA2

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.07.005

R737.9

A

1007-3639(2017)07-0545-07

2017-03-16

2017-05-16）

深圳市科技研發(fā)資金課題(JCYJ20120614155459154)；深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金課題(CXZZ20140414170821163)；深圳市科技計劃基礎(chǔ)研究課題(JCYJ20160425103015129)。

劉仁斌 E-mail: liur@vip.163.com