王玉霞

(開封第二中醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南開封475004)

電化學(xué)發(fā)光免疫分析在免疫檢驗(yàn)中的應(yīng)用及結(jié)果影響因素研究

王玉霞

(開封第二中醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南開封475004)

目的研究電化學(xué)發(fā)光免疫分析在免疫檢驗(yàn)中的應(yīng)用情況，并分析其結(jié)果的主要影響因素。方法對電極形狀對電化學(xué)發(fā)光影響情況進(jìn)行了研究和分析，比較了不同形狀的電極的發(fā)光效率。結(jié)果四孔電極電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較圓片電極提升約50%至90%，采用圓片電極檢測Ru(bpy)3Cl2.6H2O極限值為1fmol/L，采用四孔圓片電極極限為1amol/L可見通過提高比表面積可實(shí)現(xiàn)發(fā)光效率的增加。結(jié)論電化學(xué)發(fā)光免疫分析是一種方便、快捷且靈敏度較高的免疫檢驗(yàn)方法，電極形狀對電化學(xué)發(fā)光效率具有較大影響，電化學(xué)發(fā)光主要集中在邊緣位置，調(diào)整比表面積可實(shí)現(xiàn)檢測范圍動(dòng)態(tài)可調(diào)整。

電化學(xué)發(fā)光；免疫檢驗(yàn)；電化學(xué)發(fā)光效率；影響因素

電化學(xué)發(fā)光免疫分析(electrochemiuminescence immunoassay，ECLIA)是免疫檢測和光化學(xué)發(fā)光結(jié)合的新型免疫分析方法[1]，與常規(guī)化學(xué)發(fā)光不同，電化學(xué)發(fā)光免疫分析的標(biāo)記物為電極表面的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)[2]，由電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)部分組成[3]。與其他免疫分析法比較，電化學(xué)發(fā)光免疫分析具有靈敏度高、檢驗(yàn)范圍廣、檢驗(yàn)速度快、無任何發(fā)射性等多種優(yōu)點(diǎn)[4]，在自動(dòng)免疫分析前沿技術(shù)中，以其較好的操控性和極強(qiáng)穩(wěn)定性的優(yōu)勢在生命科學(xué)研究中表現(xiàn)出了較好的發(fā)展前景[5，6]。為研究電化學(xué)發(fā)光免疫分析在免疫檢驗(yàn)中的應(yīng)用及結(jié)果影響因素情況，設(shè)計(jì)了圓片、四孔、螺旋絲狀三種形態(tài)電極，對其電化學(xué)發(fā)光圖像及發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行了檢測，現(xiàn)將相關(guān)情況報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 試劑及儀器試驗(yàn)選擇美國Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)的六水合二氯三聯(lián)吡啶釕、Sigma公司生產(chǎn)的三丙胺、鄭州市統(tǒng)麒化工產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的硫酸鉀等常用試劑。二維成像系統(tǒng)由ICCD、ST-130控制器、恒溫水泵、PC機(jī)組成。由ST-130控制器制冷零下40℃后，放入暗箱，通過光學(xué)透鏡在ICCD光電陰極成像[7]，由ST-130控制器進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和傳送，通過winview對圖像進(jìn)行處理。

1.2 電極選擇本次實(shí)驗(yàn)使用的三種電極均為定做電極，圓片電極直徑為1.5cm，四孔電極通過對圓片電極鉆直徑1mm的小孔獲得，螺旋絲電極通過鉑絲彎曲制作。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法將六水合二氯三聯(lián)吡啶釕溶解到0.1mol/L的硫酸鉀中，配制成1mmol/L母液，實(shí)際應(yīng)用時(shí)采用磷酸鹽稀釋到相應(yīng)濃度，將六水合二氯三聯(lián)吡啶釕和三丙胺按照2：1比例加入樣品池，兩級(jí)電壓為1.25V，采用ICCD成像，并對發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行探測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，計(jì)量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電化學(xué)發(fā)光影像圓片電極和四孔電極均有邊緣發(fā)光現(xiàn)象，四孔電極除四孔發(fā)光外，小孔也有發(fā)光現(xiàn)象，100mol/L六水合二氯三聯(lián)吡啶釕與三丙胺圖形清晰，信噪比為4，螺旋狀電極發(fā)光為螺旋狀。

2.2 發(fā)光強(qiáng)度比較使用濃度從1amo/lL到1nmo/ lL的六水合二氯三聯(lián)吡啶釕和三丙胺，分別測試圓片和四孔電極的發(fā)光體系的ECL強(qiáng)度，測試結(jié)果如表1。

表1可見，四孔電極電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較圓片電極提升約為50%至90%的，采用圓片電極檢測Ru(bpy)3Cl2.6H2O極限值為1fmol/L，采用四孔圓片電極極限為1amol/L，可見通過提高比表面積可實(shí)現(xiàn)發(fā)光效率的增加。

3 討論

抗原-抗體特異性結(jié)合是當(dāng)前免疫學(xué)最關(guān)心的核心問題，而電化學(xué)發(fā)光免疫分析恰恰是較好的利用這種生物特異性實(shí)現(xiàn)了對復(fù)雜生物體系的分析選擇[8，9]。

在現(xiàn)有電化學(xué)發(fā)光技術(shù)中，廣泛采用的工作電極都是表面光滑的圓片狀電極[10，11]。所以根據(jù)“邊緣效應(yīng)”，電荷在電極表面分布不均，使得發(fā)光主要集中在工作電極的邊緣，而電極中間的部分區(qū)倒職寸發(fā)光來說幾乎是無效的，這導(dǎo)致了發(fā)光效率低，探測靈敏度低，使得探測極限只育影左到皮摩爾或納摩爾量級(jí)[12，13]。有研究者[14，15]采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析對人絨毛膜促性腺激素、前列腺特異性抗原、游離甲狀腺素的測定情況。有研究者采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析證實(shí)了黃疸和溶血對測試結(jié)果無影響。有研究者[18]利用電化學(xué)發(fā)光免疫分析對前列腺特異性抗原測試情況應(yīng)用于前列腺患者臨床診斷分析，使電化學(xué)發(fā)光免疫分析蛋白質(zhì)及激素分析應(yīng)用到了臨床當(dāng)中。有研究者[19]對電化學(xué)發(fā)光免疫分析進(jìn)行條件優(yōu)化后，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度細(xì)菌濃度測定，完成了鼠疫抗原、沙門菌、O-157病毒的食品環(huán)境測定，為電化學(xué)發(fā)光免疫分析在食品環(huán)境中的應(yīng)用開辟了道路[12]。有研究者對黑素瘤中酪氨酸脫脂核糖核酸進(jìn)行擴(kuò)增后，采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析對其產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，將電化學(xué)發(fā)光免疫分析應(yīng)用到了核酸雜交分析當(dāng)中[20]。

表1 圓片和四孔電極上的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度比較情況

作為一種前沿免疫標(biāo)記技術(shù)，電化學(xué)發(fā)光免疫分析給臨床診斷及生命科學(xué)研究提供了一種有效的非同位素檢測手段，已經(jīng)成為免疫分析和DNA分析的前沿方法，相關(guān)理論研究及芯片開發(fā)工作均取得了長足發(fā)展[21]。本研究以電化學(xué)發(fā)光免疫分析中應(yīng)用及結(jié)果影響因素為切入點(diǎn)，通過不同形狀電極對其發(fā)光情況的研究分析，發(fā)現(xiàn)圓片電極和四孔電極均有邊緣發(fā)光現(xiàn)象，四孔電極除四孔發(fā)光外，小孔也有發(fā)光現(xiàn)象，100mol/L六水合二氯三聯(lián)吡啶釕與三丙胺圖形清晰，信噪比為4，螺旋狀電極發(fā)光為螺旋狀。四孔電極電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較圓片電極提升約為50%~90%，采用圓片電極檢測Ru(bpy)3Cl2.6H2O極限值為1fmolL/，采用四孔圓片電極極限為1amo/lL，考慮如果使用篩網(wǎng)狀電極可達(dá)1μmolL/。我們認(rèn)為通過提高比表面積可實(shí)現(xiàn)發(fā)光效率的增加。

總之，電化學(xué)發(fā)光免疫分析是一種方便、快捷且靈敏度較高的免疫檢驗(yàn)方法[18，19]，電極形狀對電化學(xué)發(fā)光效率具有較大影響[20，21]，電化學(xué)發(fā)光主要集中在邊緣位置，調(diào)整比表面積可實(shí)現(xiàn)檢測范圍動(dòng)態(tài)可調(diào)整。

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