任文艷，陳前昭，周林云，邵 英，廖云鵬，王 涵，朱茄慧，何百成

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，2.重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

漢防已甲素抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與TGF-β1的關(guān)聯(lián)機(jī)制研究

任文艷1，2，陳前昭1，2，周林云1，2，邵 英1，2，廖云鵬1，2，王 涵1，2，朱茄慧1，2，何百成1，2

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，2.重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

目的研究漢防已甲素(tetrandrine, Tet)抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與TGF-β1的關(guān)系。方法利用細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)、定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)、Annexin V-EGFP染色以及 Western blot實(shí)驗(yàn)，分析Tet對(duì)HCT116細(xì)胞增殖和凋亡的影響；利用定量PCR、Western blot、細(xì)胞增殖抑制和免疫熒光實(shí)驗(yàn)，分析在結(jié)腸癌細(xì)胞中Tet抗結(jié)腸癌作用與TGF-β1的關(guān)系，以及TGF-β1介導(dǎo)Tet抗結(jié)腸癌作用可能的分子機(jī)制。結(jié)果與對(duì)照組相比，Tet抑制HCT116細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)G1阻滯和細(xì)胞凋亡；Tet增加TGF-β1在HCT116細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)水平，TGF-β1增強(qiáng)Tet抑制HCT116細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡，抑制TGF-β1明顯減弱Tet的這種作用；Tet降低Akt1/2/3的磷酸化水平，抑制PI3K增強(qiáng)Tet對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用；TGF-β1增強(qiáng)Tet對(duì)Akt1/2/3磷酸化的抑制作用，而Tet降低Akt1/2/3磷酸化水平的作用可被TGF-β1抑制劑部分逆轉(zhuǎn)；沉默PTEN促進(jìn)Akt1/2/3磷酸化，但TGF-β1能翻轉(zhuǎn)沉默PTEN對(duì)Akt1/2/3磷酸化的促進(jìn)作用。結(jié)論Tet能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡，機(jī)制可能與其通過促進(jìn)TGF-β1表達(dá)，抑制Akt1/2/3磷酸化有關(guān)。

漢防已甲素；結(jié)腸癌；HCT116細(xì)胞；TGF-β1；PI3K/Akt; PTEN

結(jié)腸癌是一種常見的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，具有較高的死亡率，僅次于肺癌和肝癌[1]。結(jié)腸癌的發(fā)病原因與多種因素有關(guān)。近年來，隨著對(duì)結(jié)腸癌發(fā)病原因的深入研究，其臨床治療效果有了較大的提高，尤其是靶向治療藥物的應(yīng)用,但結(jié)腸癌的治療效果及預(yù)后總體上仍不理想[2]。治療結(jié)腸癌目前所面臨的主要挑戰(zhàn)包括傳統(tǒng)化療藥物的嚴(yán)重毒性反應(yīng)、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和耐藥。因此，臨床仍急需開發(fā)新型有效的藥物，以提高結(jié)腸癌的治療效果。傳統(tǒng)中藥及其來源的有效單體成份是抗腫瘤藥物的重要來源之一，如喜樹堿及其衍生物等早已用于臨床治療結(jié)腸癌[3]。漢防己甲素(即漢防己堿，tetrandrine，Tet)來源于防己科植物粉防己(漢防己，StephaniatetrandraS. Moore)的干燥根，屬于二芐基異喹啉類生物堿。Tet是一種鈣通道阻滯劑，臨床可用于治療高血壓、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)及肌肉痛等[4]。近年研究表明， Tet還具有抗腫瘤作用，能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，如肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等，但介導(dǎo)這種作用的具體分子生物學(xué)機(jī)制目前尚不十分清楚[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)，Tet能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡，這種作用可能與其上調(diào)TGF-β1表達(dá)進(jìn)而抑制PI3K/Akt信號(hào)有關(guān)，但具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步分析。本研究結(jié)果有利于促進(jìn)將Tet作為抗腫瘤藥物或輔助抗腫瘤藥物用于治療結(jié)腸癌，提高結(jié)腸癌的治療效果。

1 材料與方法

1.1試劑及細(xì)胞培養(yǎng)HCT116細(xì)胞購自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。漢防已甲素購自西安昊軒生物科技有限公司; 實(shí)驗(yàn)所用抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司； TGF-β1抑制劑(LY364947)購于賽力克公司(Selleck)。HCT116細(xì)胞的培養(yǎng)條件為： DMEM培養(yǎng)基(高糖，含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素以及0.1 g·L-1鏈霉素)， 5% CO2及37 ℃。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組將HCT116細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。 Tet用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，用不同濃度Tet進(jìn)行處理；對(duì)照組細(xì)胞采用體積相同的DMSO進(jìn)行處理。

1.3重組腺病毒載體構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)所用重組腺病毒采用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建[7]。用PCR擴(kuò)增目的基因編碼序列并克隆到穿梭質(zhì)粒，或?qū)⑷斯ず铣傻母蓴_RNA片段連接到穿梭質(zhì)粒。將測序正確的穿梭質(zhì)粒線性化后，與BJ5183-AdEasy細(xì)菌進(jìn)行重組，然后將重組的質(zhì)粒線性化并轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞包裝病毒，得到目的基因或干擾RNA的重組腺病毒。即GFP重組腺病毒(AdGFP)、TGF-β1重組腺病毒(Ad TGF-β1)和PTEN干擾RNA重組腺病毒(AdsiPTEN)，其中AdGFP作為空白對(duì)照。

1.4細(xì)胞增殖能力檢測采用CCK-8試劑盒(#C008-3，七海生物)檢測細(xì)胞增殖能力。將生長良好的HCT116細(xì)胞接種到96孔板中，細(xì)胞密度為3×103/孔。細(xì)胞壁貼后用不同濃度Tet或相同體積的DMSO處理，分別于24、48、72 h進(jìn)行檢測。每孔加10 μL CCK-8試劑并孵育4 h，然后用酶標(biāo)儀測定吸光度，測定波長為450 nm。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞周期分析將HCT116均勻種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后按預(yù)試結(jié)果，用不同濃度Tet(1、2、4 μmol·L-1)或相同體積DMSO處理細(xì)胞。48 h后收集細(xì)胞，用PBS(4 ℃)重懸并離心(800 r·min-1×5 min，2次)。用預(yù)冷的70%、50%以及30%乙醇進(jìn)行固定，并用PBS(4 ℃)洗滌。加入1 mL PI(20 g·L)溶液(含RNA酶，1 g·L-1)孵育30 min。最后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行周期分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6AnnexinV-EGFP檢測凋亡將生長良好的HCT116均勻種于24孔板，細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用不同濃度Tet(1、2、4 μmol·L-1)或相同體積DMSO處理細(xì)胞。24 h后將細(xì)胞清洗2次，然后每孔加入500 μL緩沖液和2 μL Annexin V-EGFP融合蛋白，室溫下孵育5 min，然后丟棄緩沖液，并用PBS(4 ℃)清洗細(xì)胞2次。最后利用熒光顯微鏡攝像。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7RNA提取及real-timePCR實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞種于T25培養(yǎng)瓶中，貼壁后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)的處理因素。采用異硫氰酸胍-酚-氯仿法提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(reverse transcription, RT)制備cDNA，然后通過real-time PCR檢測目的基因表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)所用PCR引物如下：GAPDH上游引物5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3′, 下游引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′；TGF-β1上游引物5′-CCCACAACGAAATCTATGACAA-3′, 下游引物5′-AAGATAACCACTCTGGCGAGTC-3′；PCNA上游引物5′-GGCTCTAGCCTGACAAATGC-3′, 下游引物5′-GCCTCCAACACCTTCTTGAG-3′。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8Westernblot實(shí)驗(yàn)將生長良好的HCT116細(xì)胞種于6孔板，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將細(xì)胞用不同濃度Tet(1、2、4 μmol·L-1)或相同體積DMSO處理。于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)提取總蛋白，采用BCA法測定樣品總蛋白濃度。然后按常規(guī)Western blot實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后利用化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影并采集圖像。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9免疫熒光實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞均勻種于24孔板中，貼壁后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用不同重組腺病毒處理細(xì)胞。48 h后，將細(xì)胞用4%甲醛固定，PBS清洗后，用0.3%的Triton X-100處理10 min。PBS清洗后用山羊血清封閉20 min，然后用一抗(p-Akt1/2/3) 孵育過夜(4 ℃)。PBS清洗后，再孵二抗(FITC標(biāo)記)。用PBS清洗后加DAPI(100 μg·L-1)孵育10 min。PBS清洗后封片，熒光顯微鏡下采集圖像。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1Tet對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響CCK-8測試結(jié)果顯示，Tet呈濃度和時(shí)間依賴性抑制HCT116細(xì)胞增殖(Fig 1A)。定量PCR分析結(jié)果顯示，Tet明顯呈濃度依賴性抑制PCNA表達(dá)(Fig 1B)。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，Tet明顯增加G1期細(xì)胞比例而降低S期細(xì)胞比例，表明Tet能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯(Fig 1C)。結(jié)果提示，Tet對(duì)HCT116細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用。

2.2Tet對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是大多數(shù)抗腫瘤藥物的一個(gè)重要特點(diǎn)。本研究就Tet影響 HCT116細(xì)胞凋亡的情況進(jìn)行分析。Annexin V-EGFP染色結(jié)果顯示，Tet在2 μmol·L-1時(shí)已能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Fig 2A)。 Western blot分析結(jié)果顯示，Tet明顯呈濃度依賴性增加HCT116細(xì)胞中Bad的蛋白水平，下調(diào)Bcl-2的蛋白水平(Fig 2B)。結(jié)果提示, Tet能促進(jìn)HCT116細(xì)胞凋亡。2.3Tet對(duì)HCT116細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)水平的影響TGF-β對(duì)細(xì)胞增殖與分化具有重要調(diào)節(jié)作用。文獻(xiàn)報(bào)道[8]，TGF-β1與結(jié)腸癌關(guān)系密切。Tet能明顯抑制HCT116細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡，但這種作用是否與TGF-β1有關(guān)，尚不清楚。定量PCR分析結(jié)果顯示，Tet在HCT116細(xì)胞中能明顯促進(jìn)TGF-β1的mRNA表達(dá)(Fig 3A)。Western blot分析結(jié)果顯示，Tet能明顯增加HCT116細(xì)胞中TGF-β1的蛋白水平(Fig 3B)，并且TGF-β1在幾種結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于FHC細(xì)胞(Fig 3C)。結(jié)果提示, Tet在結(jié)腸癌細(xì)胞中能促進(jìn)TGF-β1表達(dá)，并且可能與Tet抗結(jié)腸癌作用有關(guān)。

2.4TGF-β1對(duì)Tet抑制HCT116細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡作用的影響為明確TGF-β1對(duì)Tet抑制HCT116細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡作用的影響，本研究利重組腺病毒介導(dǎo)的TGF-β1外源性表達(dá)和TGF-β1抑制劑進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，外源性過表達(dá)TGF-β1抑制HCT116細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)Tet對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖抑制作用；TGF-β1抑制劑對(duì)HCT116細(xì)胞增殖無明顯影響，但可明顯減弱Tet對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用(Fig 4A)。Western blot分析結(jié)果顯示，外源性高表達(dá)的TGF-β1雖對(duì)Tet誘導(dǎo)Bad蛋白水平增加的作用無明顯影響，但能明顯降低Bcl-2的蛋白水平(Fig 4B)；抑制TGF-β1能減弱Tet對(duì)Bad表達(dá)的促進(jìn)作用，并部分逆轉(zhuǎn)Tet對(duì)Bcl-2表達(dá)的抑制作用(Fig 4C)。結(jié)果提示，Tet抑制HCT116細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能部分通過其促進(jìn)TGF-β1表達(dá)介導(dǎo)，但TGF-β1抑制HCT116細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不清楚。

Fig 1 Effects of Tet on proliferation of HCT116 cells

A:CCK-8 assay results showed the effect of Tet on proliferation of HCT116 cells; B:Real-time PCR analysis result showed the effect of Tet on the mRNA level of PCNA in HCT116 cells;C:Flow cytometery analysis results showed the effect of Tet on cell cycle in HCT116 cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

Fig 2 Effects of Tet on apoptosis in HCT116 cells

A:Annexin V-EGFP staining results showed the effect of Tet on apoptosis in HCT116 cells;B:Western blot assay results showed the effect of Tet on the protein level of Bad and Bcl-2 in HCT116 cells

Fig 3 Effects of Tet on expression of TGF-β1 in HCT116 cells

A:Real-time PCR analysis results showed the effect of Tet on the mRNA expression of TGF-β1 in HCT116 cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;B:Western blot analysis results showed the effect of Tet on the protein level of TGF-β1 in HCT116 cells;C:Western blot analysis results showed the endogenous protein level of TGF-β1 in FHC and the commerical available colon cancer cell lines.

2.5PI3K/Akt對(duì)Tet抑制HCT116細(xì)胞增殖作用的影響PI3K/Akt信號(hào)是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活與抗凋亡的重要信號(hào)，也是多種抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)之一。因此，本研究對(duì)Tet抑制HCT116細(xì)胞增殖與促進(jìn)凋亡是否與該信號(hào)有關(guān)進(jìn)行分析。Western blot分析結(jié)果顯示，Tet對(duì)Akt1/2的總蛋白水平無明顯影響，但能明顯降低Akt1/2/3的磷酸化水平(Fig 5A)。CCK-8測試結(jié)果顯示，抑制PI3K/Akt信號(hào)，明顯增強(qiáng)Tet對(duì)HCT116增殖的抑制作用(Fig 5B)。結(jié)果提示，Tet對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖抑制作用可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)有關(guān)。

2.6TGF-β1和Tet對(duì)HCT116細(xì)胞中Akt1/2/3磷酸化的影響Tet能抑制PI3K/Akt信號(hào)并促進(jìn)TGF-β1表達(dá)，但Tet對(duì)PI3K/Akt信號(hào)的抑制作用是否與其促進(jìn)TGF-β1表達(dá)有關(guān)尚不清楚。Western blot結(jié)果顯示，外源性過表達(dá)TGF-β1能明顯增強(qiáng)Tet對(duì)Akt1/2/3磷酸化的抑制作用(Fig 6A)，而抑制TGF-β1則部分逆轉(zhuǎn)Tet抑制Akt1/2/3磷酸化(Fig 6B)。免疫熒光分析結(jié)果顯示，外源性過表達(dá)TGF-β1降低Akt1/2/3的磷酸化水平，沉默PTEN明顯促進(jìn)Akt1/2/3的磷酸化；但沉默PTEN對(duì)Akt1/2/3磷酸化的促進(jìn)作用能明顯被外源性過表達(dá)TGF-β1取消(Fig 6C)。結(jié)果提示，TGF-β1介導(dǎo)Tet抑制HCT116細(xì)胞的增殖和促進(jìn)凋亡作用可能與其抑制PI3K/Akt信號(hào)有關(guān)。

3 討論

結(jié)腸癌是臨床中常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和致死率，僅次于肝癌、肺癌和胃癌，每年全球約有近60萬患者因結(jié)腸癌而死亡[1]。雖然目前對(duì)結(jié)腸癌的診斷和治療都已有明顯改善，但其預(yù)后仍不理想。因此，臨床仍需開發(fā)高效而低毒性的抗腫瘤藥物用于治療結(jié)腸癌。本研究表明，Tet能明顯抑制人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，這種作用可能與Tet促進(jìn)TGF-β1表達(dá)，進(jìn)而抑制PI3K/Akt信號(hào)活化有關(guān)；但Tet促進(jìn)TGF-β1表達(dá)的具體分子機(jī)制尚不清楚。

Fig 4 Effects of TGF-β1 on anti-proliferation potential of Tet in HCT116 cells

Tet屬于二芐基異喹啉類生物堿，主要從防己科植物粉防己的干燥根中提取。Tet具有多種藥理活性，臨床可用于治療高血壓、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)痛、肌肉痛等相關(guān)疾病。研究表明， Tet還具有明顯的抗腫瘤作用，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抗增殖和促進(jìn)凋亡作用，如肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等，這種作用可能與Wnt/β-catenin 及p53信號(hào)等有關(guān)[5-6,9-10]。課題組前期研究結(jié)果也證明，Tet對(duì)結(jié)腸癌具有明顯抑制作用，但具體分子生物學(xué)機(jī)制尚不十分清楚。結(jié)腸癌發(fā)生與生活方式以及基因突變等因素有關(guān)，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常是其發(fā)生的重要原因之一[11]。除此之外，其他與結(jié)腸癌發(fā)生有關(guān)的突變包括PTEN、BRAF和KRAS等[11-12]。TGF-β超家簇包括一系列分泌性蛋白， 如TGF-β、骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)、活化素(activins)以及Nodal等。 這些因子與相應(yīng)受體結(jié)合后，通過Smads與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)。研究表明，TGF-β功能異常也與結(jié)腸癌的發(fā)生關(guān)系密切。TGF-β有3種亞型，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。這些異構(gòu)體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中均有表達(dá)，且對(duì)腫瘤具有雙向作用，既可促進(jìn)腫瘤生長，也可抑制腫瘤生長[13]。出現(xiàn)這種情況的原因可能與腫瘤微環(huán)境、細(xì)胞種類以及細(xì)胞的分化階段有關(guān)。TGF-β1在結(jié)腸癌表達(dá)水平較高，可通過上調(diào)Criptol-1而促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展[14]。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(FHC)。提示，TGF-β1在結(jié)腸癌中具有重要調(diào)節(jié)作用，但這種表達(dá)增高對(duì)結(jié)腸癌的具體影響還不十分清楚。

Fig 5 Effects of PI3K/Akt on anti-proliferation effect of Tet in HCT116 cells

文獻(xiàn)報(bào)道[15]，Tet在除草醚誘導(dǎo)的先天性膈疝中能抑制TGF-β1 mRNA表達(dá)，但具體機(jī)制不詳。提示，Tet可能會(huì)影響TGF-β1在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。本研究顯示，Tet在結(jié)腸癌細(xì)胞中對(duì)TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)均有促進(jìn)作用。由于Tet本身具有明顯的抗腫瘤作用，課題組推測Tet的抗腫瘤作用可能與其上調(diào)TGF-β1表達(dá)有關(guān)。增殖抑制和凋亡檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，外源性表達(dá)TGF-β1能增強(qiáng)Tet的抗腫瘤作用，而抑制TGF-β1則明顯減弱Tet的這種抗腫瘤作用。因此，Tet對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用可能部分通過上調(diào)TGF-β1介導(dǎo)，但具體作用機(jī)制不清楚。

TGF-β信號(hào)主要通過經(jīng)典的TGF-β通路(TGF-β/Smads)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖與分化等重要生理過程的調(diào)控。除此之外，TGF-β還可通過非經(jīng)典TGF-β通路參與細(xì)胞生理功能的調(diào)節(jié)，如TGF-β可通過激活PI3K/Akt信號(hào)來促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲[16]。本研究預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Tet在結(jié)腸癌細(xì)胞中不僅未增加Smad2/3的磷酸化水平，反而抑制其磷酸化。提示，TGF-β1可能通過非經(jīng)典的TGF-β信號(hào)影響Tet的抗結(jié)腸癌作用。PI3K/Akt信號(hào)與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示，Tet能明顯降低Akt1/2/3的磷酸化水平，但對(duì)Akt1/2的總蛋白水平無明顯影響；抑制PI3K/Akt信號(hào)明顯增強(qiáng)Tet抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用。因此，Tet對(duì)Akt1/2/3磷酸化的抑制作用可能與TGF-β1過表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，外源性過表達(dá)TGF-β1明顯增強(qiáng)Tet對(duì)Akt1/2/3磷酸化的抑制作用，而TGF-β1抑制劑則能部分逆轉(zhuǎn)Tet對(duì)Akt1/2/3磷酸化的抑制作用。PTEN是PI3K/Akt信號(hào)的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子，沉默PTEN能明顯增加結(jié)腸癌細(xì)胞中Akt1/2/3的磷酸化水平，但外源性過表達(dá)TGF-β1能取消沉默PTEN對(duì)Akt1/2/3磷酸化的促進(jìn)作用。結(jié)果提示，TGF-β1表達(dá)水平增加可能通過抑制PI3K/Akt信號(hào)而介導(dǎo)Tet對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用。

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，Tet具有明顯的抗結(jié)腸癌作用，這種作用可能與其促進(jìn)TGF-β1表達(dá)，進(jìn)而抑制PI3K/Akt信號(hào)有關(guān)。TGF-β1可能是治療結(jié)腸癌藥物潛在的有效靶點(diǎn)之一，但Tet促進(jìn)TGF-β1表達(dá)的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究并在其他結(jié)腸癌細(xì)胞中進(jìn)行確證。

Fig 6 Effects of TGF-β1 and/or Tet on phosphorylation of Akt1/2/3 in HCT116 cells

A:Western blot analysis results showed the effect of Tet and/or TGF-β1 on the protein level of Akt1/2 and the phosphorylation of Akt1/2/3 in HCT116 cells;B:Western blot analysis results showed the effect of Tet and/or TGF-β1 inhibitor on the protein level of Akt1/2 and the phosphorylation of Akt1/2/3 in HCT116 cells(LY364947: TGF-β1 inhibitor);C:Immunofluorescent staining results showed the effect of TGF-β1 and/or PTEN knockdown on the phosphorylation of Akt1/2/3 in HCT116 cells

[致謝:本研究工作在重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。感謝芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心何通川教授(T.C. He)為本研究饋贈(zèng)所需的重組腺病毒。]

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Relationshipbetweenanti-proliferationeffectoftetrandrineandTGF-β1inhumancoloncancercells

REN Wen-yan1，2,CHEN Qian-zhao1，2,ZHOU Lin-yun1，2, SHAO Ying1，2,LIAO Yun-peng1，2,WANG Han1，2,ZHU Jia-hui1，2,HE Bai-cheng1，2
(1.DeptofPharmacology,SchoolofPharmacy,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 2.ChongqingKeyLabrotoryofBiochemistryandMolecularPharmacology,Chongqing400016,China)

AimTo study the relationship between the anti-proliferation effect of tetrandrine(Tet) and TGF-β1 in human colon cancer cells.MethodsCell viability assay, Western blot, flow cytometry and Annexin Ⅴ-EGFP staining were introduced to analyze the anti-cancer effect of Tet on HCT116 cells. Real-time PCR, Western blot，cell viability and immunofluorescent were employed to determine the relationship between the anti-cancer effect of Tet and TGF-β1 in HCT116 cells, the relationship between the anti-cancer effect of Tet and PI3K/Akt on HCT116 cells, and how TGF-β1 mediated the anti-cancer effect of Tet on HCT116 cells.ResultsCompared with the control groups, Tet apparently inhibited the proliferation, and induced cell cycle arrest at G1phase and apoptosis in HCT116 cells. Tet greatly up-regulated the expression of TGF-β1 either the mRNA or protein level, and exogenous expression of TGF-β1 potentiated the anti-cancer effect of Tet in HCT116 cells, while TGF-β1 inhibitor attenuated it notably. Tet decreased the phosphorylation of Akt1/2/3, but no apparent effect was observed on total protein level of Akt1/2; PI3K inhibitor enhanced the anti-cancer effect of Tet in HCT116 substantially. Exogenous expression of TGF-β1 enhanced the Tet-induced decrease phorphorylation of Akt1/2/3, which was partly reversed by TGF-β1 inhibitor in HCT116 cells. Meanwhile, knockdown of PTEN elevated the level of phorphorylated Akt1/2/3, which was abolished by the exogenous expression of TGF-β1 in HCT116 cells.ConclusionTet may be a potent candidate drug for colon cancer treatment, and the anti-cancer effect of Tet may be partly mediated by up-regulating TGF-β1 to inactivate PI3K/Akt signal.

tetrandrine; colon cancer; HCT116 cells; TGF-β1; PI3K/Akt; PTEN

時(shí)間：2017-8-20 16:47 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170820.1647.020.html

2017-04-19,

2017-05-19

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81572226)

任文艷(1993-)，女，碩士生，研究方向：分子藥理學(xué)，E-mail:2550118046@qq.com; 何百成(1972-)，男，博士，教授，研究方向：分子藥理學(xué)和干細(xì)胞生物學(xué)，通訊作者，E-mail: 100869@cqmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.09.009

A

：1001-1978(2017)09-1227-08

R-332；R284.1；R329.24；R735.350.22；R977.6