李嵐，郝洪慶，林嘉森

(嘉應(yīng)學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 梅州 514015)

羅丹明6G恒波長同步熒光猝滅法測定痕量亞硝酸根

李嵐，郝洪慶，林嘉森

(嘉應(yīng)學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 梅州 514015)

建立了恒波長同步熒光猝滅測定微量亞硝酸根的新方法。研究表明：在HCl介質(zhì)中，Δλ=25 nm，亞硝酸根對溴酸根氧化羅丹明6G具有催化作用，使羅丹明6G的同步熒光發(fā)生猝滅，且猝滅程度與亞硝酸根量形成線性關(guān)系。方法的檢出限為0.68 μg/L，線性范圍為2～36 μg/L。該方法可用于火腿腸中亞硝酸根含量的測定，能得到滿意結(jié)果。

恒波長同步熒光猝滅法；羅丹明6G；亞硝酸根；溴酸根

亞硝酸鹽是一種允許使用的食品添加劑，在食品生產(chǎn)中用作護(hù)色劑，有發(fā)色和抑菌作用，能增強(qiáng)肉質(zhì)風(fēng)味，所以被廣泛使用于食品中，但同時亞硝酸鹽毒性較強(qiáng)，攝入量大可以使血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白，使其失去輸氧能力，另外，亞硝酸鹽還可以與胺類物質(zhì)生成強(qiáng)致癌物質(zhì)亞硝胺[1]。因此，我國嚴(yán)格控制亞硝酸鹽的使用量，腌臘肉制品類如中式火腿、醬鹵肉制品亞硝酸鹽的殘留量(以亞硝酸鈉計)≤30 mg/kg[2]。因此，建立研究測定食品中痕量亞硝酸鹽的靈敏分析方法對于食品安全和人體健康具有十分重要的意義。

亞硝酸根的分析方法有很多，但各有利弊。分光光度法[3]所用的偶聯(lián)試劑毒性較大，可造成二次污染。

化學(xué)發(fā)光分析法[4,5]具有靈敏度高、操作簡單、選擇性好、儀器簡單，但發(fā)光體系單一，同時要求操作人員技術(shù)水平要高。熒光法[6,7]快速、靈敏、操作簡單、干擾少、試劑易得，但其條件不易準(zhǔn)確控制。同步熒光法[8]測定亞硝酸根的報道較少，恒波長同步熒光法具有選擇性好、靈敏度高、干擾少等特點(diǎn)。本文基于在酸性介質(zhì)中，亞硝酸根對溴酸鉀氧化羅丹明6G 具有催化作用[9-11]，且亞硝酸根的濃度與體系同步熒光強(qiáng)度猝滅程度有關(guān)，研究了測定痕量亞硝酸根的最佳實(shí)驗(yàn)條件，提出了恒波長同步熒光猝滅法測定微量亞硝酸根的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

LS-55熒光分光光度計 美國PE公司；AL-400電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；888攪拌機(jī) 櫻達(dá)生活電器公司；Z2水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠。

KBrO3、氯化鉀、七水硫酸鎂、氯化鈣(無水) 廣州化學(xué)試劑廠；羅丹明6G Aladdin Industrial Corporation；尿素、硼砂、硫酸鋅、亞硝酸鈉、氯化鈉 廣東光華化學(xué)廠有限公司；鹽酸 西隴化工股份有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為超純水。

亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液：用亞硝酸鈉配成亞硝酸根濃度為1 μg/mL的貯備液，用時稀釋至0.1 μg/mL；0.02 mol/L溴酸鉀溶液；1×10-4mol/L羅丹明B溶液。雙匯火腿腸、雙匯雞肉火腿腸：福建省力誠食品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在25 mL比色管中加入鹽酸，搖勻，加入溴酸鉀溶液、羅丹明6G溶液、亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液，加去離子水定容至刻度，搖勻，置于恒溫水浴鍋中9 min，再取出，迅速加入尿素溶液，搖勻。將溶液移入石英比色皿中，在熒光分光光度計上以波長差Δλ=25 nm測定熒光強(qiáng)度F。在相同條件下測定空白試劑F0(即不加0.1 μg/mL亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液)，計算ΔF=F0-F。

2 結(jié)果與討論

2.1 同步熒光光譜

羅丹明6G屬三苯甲烷堿性染料，能發(fā)出很強(qiáng)熒光。

圖1 羅丹明6G的光譜圖Fig.1 Spectrogram of rodamin 6G

注：1為激發(fā)光譜；2為發(fā)射光譜；3為同步熒光光譜(Δλ=25 nm)。

由圖1可知，羅丹明6G的激發(fā)波長為524 nm，發(fā)射波長為552 nm，Stokes位移(Δλ=λem-λex)較小，為28 nm，因此雜散光會對譜圖產(chǎn)生影響。而采用固定波長同步掃描，得到的同步熒光譜圖中半寬峰窄，強(qiáng)度比較大，這樣可減小雜散光帶來的誤差。

在鹽酸介質(zhì)中，溴酸鉀氧化羅丹明6G 得到的產(chǎn)物為無色、無熒光的物質(zhì)，而加入亞硝酸鹽對反應(yīng)起加速反應(yīng)的作用，但對體系的最佳同步波長不產(chǎn)生影響，僅使熒光強(qiáng)度降低，且降低程度與一定范圍內(nèi)加入的亞硝酸鹽的量呈良好的線性關(guān)系，見圖2。

圖2 同步熒光猝滅光譜Fig.2 Synchronous fluorescent quenching spectra

注：1為羅丹明6G+HCl+KBrO3；2為羅丹明6G+HCl+KBrO3+NO2-。

2.2 恒波長Δλ的選擇

在同步掃描過程中，選擇適當(dāng)?shù)摩う酥岛苤匾?，它直接影響測定方法的靈敏度與選擇性，為了選擇適合的Δλ值，分別實(shí)驗(yàn)了Δλ值為10，15，20，25，30 nm對樣品的同步熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果見圖3。在Δλ=25 nm時，得到同步熒光信號最強(qiáng)、半寬峰最窄的單峰同步熒光光譜。

圖3 不同Δλ時的同步熒光強(qiáng)度Fig.3 Synchronous fluorescence intensity at different Δλ

2.3 酸性介質(zhì)

選定HCl的用量為1，3，5，7，9 mL。隨著HCl用量的增大，ΔF 先增加再下降。當(dāng)HCl用量為5 mL時，ΔF有最佳實(shí)驗(yàn)效果，見圖4。故選擇HCl用量為5 mL。

圖4 HCl用量的影響Fig.4 Effect of HCl dosage

2.4 羅丹明6G的影響

選定羅丹明6G的用量為0.5，1.0，1.2，1.5，1.8 mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 羅丹明6G用量的影響Fig.5 Effect of rhodamine 6G dosage

隨著羅丹明6G用量的增大，ΔF先增加后下降。當(dāng)羅丹明6G用量為1.0 mL時，ΔF有最佳實(shí)驗(yàn)效果。羅丹明6G的用量不足時，空白同步熒光值偏低，導(dǎo)致ΔF偏小，如果羅丹明6G過量，空白熒光強(qiáng)度很強(qiáng)，加入亞硝酸根使羅丹明6G的熒光強(qiáng)度猝滅程度不高，靈敏度不高，導(dǎo)致ΔF降低。故選擇羅丹明6G用量為1.0 mL。

2.5 溴酸鉀的影響

選定溴酸鉀的用量為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 溴酸鉀用量的影響Table 1 Effect of potassium bromate dosage

隨著溴酸鉀用量的增大，ΔF一直增加。當(dāng)溴酸鉀用量大于1.0 mL時，F(xiàn)值很低，說明隨著溴酸鉀量的不斷增大，空白體系加入亞硝酸根后熒光強(qiáng)度下降過多，靈敏度太高，不穩(wěn)定，在此不做考慮，因此選取溴酸鉀用量為1.0 mL。

2.6 穩(wěn)定性探討

分別測試了尿素1，2，3 mL在1 h的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入尿素的量為3 mL時ΔF穩(wěn)定性最強(qiáng)，因而選用3 mL在1 h內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。

2.7 反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間

實(shí)驗(yàn)了溫度在25～65 ℃之間對體系ΔF的影響，在55 ℃時，ΔF達(dá)到最大值，因而選定55 ℃進(jìn)行進(jìn)一步的研究。改變時間測定ΔF，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時間為9 min時，ΔF有最大值，因此本實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)時間為9 min。

2.8 線性范圍及檢出限

在選定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，改變亞硝酸根加入量，測定亞硝酸根濃度與ΔF的關(guān)系，見圖6。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)亞硝酸根在2～36μg/L范圍內(nèi)與ΔF有良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為ΔF=19.018-17.164(R2=0.9986)，對10份空白溶液進(jìn)行平行測定，得到方法的檢出限CL=3S0/K，CNO2-為0.68μg/L。

2.9 共存離子

考察了6種離子對5 mL 0.1 μg/mL亞硝酸根的影響。當(dāng)測量相對誤差<±5%時，160倍的Cl-，150倍的SO42-，100倍的Ca2+，Na+，K+，50倍的Mg2+，在本實(shí)驗(yàn)條件下不會對實(shí)驗(yàn)造成干擾。

3 樣品分析

香腸按文獻(xiàn)[12]進(jìn)行處理，取濾液2.00 mL，按實(shí)驗(yàn)方法測定并同時做空白試驗(yàn)，并做標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2和表3。

表2 火腿腸中亞硝酸根的測定Table 2 Determination of nitrite in sausage

表3 回收率的測定(n=3)Table 3 Determination of recoveries(n=3)

本文采用恒波長同步熒光猝滅法測定食品中亞硝酸根的含量，該方法重現(xiàn)性和選擇性較高，簡單快捷，用于測定食品中亞硝酸根的含量，能得到滿意的結(jié)果。

[1]Sindelar J J, Milkowsk A L. Human safety controversies surrounding nitrate and nitrite in the diet[J]. Nitric Oxide,2012,26(4):259-266.

[2]GB 2760-2007，食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

[3]國家環(huán)保局《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法(第三版)[M].北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社,1998：260-263.

[4]唐宏武,羅慶堯.鐵氰化鉀-NO2-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系測定痕量亞硝酸鹽的研究[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報,1994,25(11):1626-1628.

[5]竇憲民,高歧,石焱.偶合化學(xué)發(fā)光法測定環(huán)境水樣中的痕量亞硝酸根[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2000,21(3):43-45.

[6]馮素玲,唐安娜,樊靜.熒光分析法測定痕量亞硝酸根[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2001,20(2):41-43.

[7]曹連城,鄧泳南.催化熒光光度法測定痕量亞硝酸根[J].武漢化工學(xué)院學(xué)報,2001,23(4):19-20.

[8]李嵐,劉金燕.恒波長同步熒光猝滅法測定痕量亞硝酸根[J].中國食品添加劑,2016(2):146-149.

[9]馮素玲,程定璽,張桂恩.催化熒光法測定痕量亞硝酸根[J].河南師范大學(xué)學(xué)報,1997(1):51-55.

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[11]楊利,潘可亮,李樹偉,等.恒波長同步熒光猝滅法測定飲用水中微量溴酸根[J].分析試驗(yàn)室,2010(7):46-48.

[12]梁宇,李睿,樊靜.食品中亞硝酸根的熒光動力學(xué)分析法[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2013,41(4):77-80.

Determination of Trace Nitrite by Constant-wavelength SynchronousFluorescent Quenching Method

LI Lan, HAO Hong-qing, LIN Jia-sen

(School of Chemistry and Environment, Jiaying University, Meizhou 514015, China)

The constant-wavelength synchronous fluorescent quenching method is established for determination of trace nitrite. In HCl media (Δλ=25 nm), constant-wavelength synchronous fluorescence of rhodamine 6G can be quenched because nitrite is used as catalyst for the oxidation of rhodamine 6G with bromate ion, and the linear relationship is developed between the extent of quenching and the content of nitrite. The detection limit for nitrite is 0.68 μg/L with the linear range of 2～36 μg/L. The method can be used to determine trace NO2-in sausage with satisfactory results.

constant-wavelength synchronous fluorescent quenching method；rhodamine 6G；nitrite；bromate ion

2017-02-19

廣東省高校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃項(xiàng)目(102B0102)；嘉應(yīng)學(xué)院育苗工程(314E22)

李嵐(1983- )，女，廣東梅州人，碩士，研究方向：分子熒光分析。

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.08.026

1000-9973(2017)08-0120-03