劉悅,王曉雨,曲春安,胡飛,胡亞暖,唐勝建

(濰坊醫(yī)學(xué)院,山東濰坊261041)

MiRNA-520e對HeLa細(xì)胞FOXL2基因的靶向調(diào)控作用及細(xì)胞遷移增殖的影響

劉悅,王曉雨,曲春安,胡飛,胡亞暖,唐勝建

(濰坊醫(yī)學(xué)院,山東濰坊261041)

目的 探討miRNA-520e對人宮頸癌HeLa細(xì)胞FOXL2基因的調(diào)控作用及對細(xì)胞遷移、增殖的影響。方法 應(yīng)用生物信息學(xué)分析軟件(Target Scan Human 7.1)預(yù)測miRNA-520e可能結(jié)合于FOXL2 mRNA 3′UTR端，以HeLa細(xì)胞作為試驗(yàn)研究對象，將細(xì)胞隨機(jī)分為陰性對照組(加入無關(guān)序列NC Fam mimics)、正常對照組(不加任何干預(yù))、miRNA-520e組(加入miRNA-520e mimics)。運(yùn)用脂質(zhì)體法通過Lipofectamine 3000 Reagent將各miRNA mimics轉(zhuǎn)染各組HeLa細(xì)胞，48 h后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting法檢測FOXL2 mRNA及蛋白表達(dá)；轉(zhuǎn)染24 h后采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力，使用ACEA xCELLigence RTCA DP細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞增殖能力。結(jié)果 miRNA-520e組HeLa細(xì)胞FOXL2 mRNA和蛋白的表達(dá)量較正常對照組及陰性對照組降低，且miRNA-520e組細(xì)胞的遷移和增殖能力較正常對照組及陰性對照組增強(qiáng)(P均<0.05)。結(jié)論 miRNA-520e可抑制HeLa細(xì)胞FOXL2 mRNA和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖。

宮頸癌;HeLa細(xì)胞;微小RNA-520e；FOXL2基因；細(xì)胞遷移；細(xì)胞增殖

FOXL2 基因是一種2.7 kb 大小的單外顯子翼狀螺旋/叉頭轉(zhuǎn)錄因子[1]，定位于3q23區(qū)域[2]。FOXL2因其編碼蛋白包含有一個(gè)特殊的forkhaed DNA結(jié)合區(qū)而命名，主要特異性表達(dá)于發(fā)育的眼瞼，顯著表達(dá)于胎兒的顆粒細(xì)胞及成人的卵巢[3,4]，在卵巢顆粒細(xì)胞分化和卵巢發(fā)育、功能維持方面起至關(guān)重要作用[5,6]。研究證明，F(xiàn)OXL2發(fā)生胚系突變是導(dǎo)致瞼裂狹小、倒轉(zhuǎn)型內(nèi)毗贅皮和上瞼下垂綜合征(BPES)的主要致病基因[7]。另一方面，F(xiàn)OXL2體細(xì)胞突變(402C→G)是成人卵巢顆粒細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵性因素[8,9]。檢測突變的FOXL2可用于及時(shí)確診及長期隨訪成人卵巢顆粒細(xì)胞瘤患者。微小RNA(MiRNA)是一類高度保守的內(nèi)源性、非編碼小RNA，長度在22個(gè)核苷酸左右[10]，特異性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化及凋亡等多種生物學(xué)活動中發(fā)揮重要調(diào)控作用。miRNA異常表達(dá)可導(dǎo)致多種疾病[11,12]，廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等過程。2016年6月～2017年3月，本研究就miRNA-520e對人宮頸癌HeLa細(xì)胞FOXL2基因的靶向調(diào)控作用及對細(xì)胞遷移增殖的影響進(jìn)行了探討?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 HeLa細(xì)胞株由濰坊醫(yī)學(xué)院整形外科研究所保存，L-DMEM培養(yǎng)液、新生胎牛血清、Lipofectamine 3000 Reagent及Opti-MEM Reduced Serum Medium均購自美國GIBCO(Invrotrigen)公司，0.05% Trypsin-EDTA購于華美生物工程公司,RIPA裂解液購于普利萊基因技術(shù)有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購于Thermo公司。RT-PCR相關(guān)試劑購自日本Takara公司，miRNA-520e mimics購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，Western blotting 試驗(yàn)所用抗體、內(nèi)參均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，E-Plate 16檢測板購自艾森生物(杭州)有限公司。

1.2 靶基因預(yù)測 應(yīng)用Target Scan Human 7.1生物信息學(xué)軟件在線預(yù)測以FOXL2為靶基因的miRNA，對比預(yù)測結(jié)果，最終選取miRNA-520e為本試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)miRNA。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞接種于10%胎牛血清L-DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48小時(shí)(細(xì)胞生長約達(dá)到90%融合)應(yīng)用0.05%Trypsin-EDTA消化傳代1次。本試驗(yàn)選取傳代次數(shù)<15次且處于指數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分為陰性對照組、正常對照組、miRNA-520e組，陰性對照組加入無關(guān)序列NC Fam mimics，正常對照組不加任何干預(yù)，miRNA-520e組加入miRNA-520e mimics。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)前，預(yù)先將miRNA-520e mimics及NC FAM mimics凍干粉離心，以無RNase水溶解(配比遵產(chǎn)品說明書)。轉(zhuǎn)染前24 h將處于指數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，接種細(xì)胞濃度為3×105/mL。運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine 3000 Reagent按照說明書操作轉(zhuǎn)染各組HeLa細(xì)胞，整個(gè)試驗(yàn)操作需快速、輕柔完成，以防m(xù)iRNA受損影響后續(xù)試驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞放入37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12小時(shí)取出6孔板于熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.4 HeLa細(xì)胞FOXL2 mRNA的檢測 采用熒光定量RT-PCR法。根據(jù)FOXL2基因信息，使用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物：FOXL2 上游序列:5′-AAG AAGCTCACGCTGTCCG-3′；FOXL2下游序列:5′-CTCGTTGAGGCTGAGGTTGTG-3′；內(nèi)參基因?yàn)棣? actin，反應(yīng)體系為25 μL。收集成功轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞，TRIzol法分別提取各組HeLa細(xì)胞的總RNA，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)檢測RNA完整度。使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser嚴(yán)格按照說明書操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在德國Eppendorf實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上應(yīng)用SYBR Green Mix 進(jìn)行擴(kuò)增與熒光檢測。2-ΔΔCt法計(jì)算各組FOXL2 mRNA相對表達(dá)量。

1.5 HeLa細(xì)胞FOXL2 蛋白的檢測 采用Western blotting法。成功轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，應(yīng)用蛋白裂解液RIPA提取各組HeLa細(xì)胞總蛋白，取各組樣本利用BCA蛋白定量試劑盒測得蛋白濃度，其余蛋白及時(shí)煮沸變性并調(diào)整至統(tǒng)一濃度，之后進(jìn)行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白(10%分離膠每孔上樣量為30 μg)，電泳結(jié)束后將分離出的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，利用含5%脫脂牛奶封閉液封閉PVDF膜4 h，加入Rabbit Anti-FOXL2 置于4 ℃孵育過夜(一抗稀釋比例1∶1 000)，TBST漂洗PVDF膜3次，每次15 min，再以含 HRP標(biāo)記的二抗封閉液(稀釋比例1∶5 000)室溫輕搖孵育1 h，TBST漂洗二抗3次，每次15 min。最后利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒于暗室中進(jìn)行化學(xué)發(fā)光及顯影、定影，膠片清水沖洗晾干，獲得試驗(yàn)結(jié)果。運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行灰度分析，目的蛋白灰度=目的蛋白累積光密度(IOD)值/內(nèi)參IOD值。本實(shí)驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參。

1.6 細(xì)胞遷移能力檢測 采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)。試驗(yàn)前需預(yù)先用標(biāo)記筆在6孔板每個(gè)孔的背后橫穿孔心均勻、筆直地畫橫線。按上述步驟接種、轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，待轉(zhuǎn)染24 h后(HeLa細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%)，利用無菌200 μL槍頭垂直于預(yù)先畫好的橫線劃劃痕以制作HeLa細(xì)胞傷口模型。PBS小心漂洗細(xì)胞3次后將6孔板重新放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0、6、12、24 h于倒置顯微鏡下觀察HeLa細(xì)胞遷移情況，并拍照保存試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0軟件測繪細(xì)胞遷移平均距離，遷移平均距離=24 h平均寬度-0 h平均寬度。

1.7 細(xì)胞增殖能力檢測 采用ACEA xCELLigence RTCA DP細(xì)胞分析儀檢測轉(zhuǎn)染后各組HeLa細(xì)胞增殖能力。轉(zhuǎn)染24 h后，收集各組HeLa細(xì)胞，分別接種于E-Plate 16檢測板中，細(xì)胞接種濃度為3×105/mL，將E-Plate 16檢測板放入細(xì)胞分析儀中，啟動檢測程序，設(shè)置每12小時(shí)檢測一次細(xì)胞指數(shù)(CI)，CI反映細(xì)胞增殖率，共檢測72 h。

2 結(jié)果

2.1 三組FOXL2 mRNA及蛋白表達(dá)比較 正常對照組、陰性對照組、miRNA-520e組FOXL2 mRNA相對表達(dá)量分別為1.000 0±0.030 0、0.910 1±0.042 0、0.198 6±0.023 2，F(xiàn)OXL2 蛋白相對表達(dá)量分別為0.969 7±0.054 1、0.924 7±0.024 0、0.248 3±0.027 5。與正常對照組、陰性對照組比較，miRNA-520e組FOXL2 mRNA及蛋白表達(dá)降低(P均<0.05)。

2.2 三組細(xì)胞遷移能力比較 正常對照組、陰性對照組、miRNA-520e組24 h細(xì)胞遷移距離分別為(12.255 7±1.487 9)、(13.349 6±1.163 9)、(31.795 2±3.409 5)pixel。miRNA-520e組24 h細(xì)胞遷移距離均長于正常對照組及陰性對照組(P均<0.05)。

2.3 三組不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力比較 見表1。miRNA-520e組細(xì)胞增殖能力高于正常對照組及陰性對照組(P均<0.05)。

表1 各組不同時(shí)間細(xì)胞CI值比較±s)

注：與陰性對照組、正常對照組比較，*P<0.05。

3 討論

20世紀(jì)90年代末，Ambros等最先在研究秀麗隱桿線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)了miRNA的存在。如今在miRBase注冊的miRNA近30 000個(gè)。miRNA是一類長度在20～23個(gè)核苷酸之間，由約70個(gè)核苷酸的前體miRNA經(jīng)Dicer酶識別、剪切得來的高保守非編碼單鏈RNA。miRNA廣泛存在于真核生物基因中，通過特異性地與靶mRNA 3′UTR結(jié)合而發(fā)揮翻譯抑制或?qū)ο掠伟谢蜇?fù)性調(diào)控作用，影響細(xì)胞增殖、分化及凋亡過程。

研究表明，在腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中異常的細(xì)胞增殖及凋亡往往伴隨miRNA表達(dá)異常，由此推測miRNA的過表達(dá)可能參與腫瘤的形成，作用機(jī)理可能是miRNA調(diào)控各類癌基因或抑癌基因的異常表達(dá)。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，miRNA-520e在肝癌、乳腺癌等疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)控作用[13,14]。在過往的研究中，miRNA-520e可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力并抑制凋亡，在肝癌細(xì)胞系中低表達(dá)，可通過其靶基因NIK抑制肝癌的增殖。但亦有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-520e在乳腺癌組織中較癌旁組織中升高，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力并抑制凋亡。另有學(xué)者通過Microarray芯片技術(shù)方法得出miRNA-520e在卵巢功能減退患者卵巢顆粒細(xì)胞及血清中較正常人表達(dá)下調(diào)。

FOXL2參與顱面和女性生殖系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)展，在性別分化、卵巢顆粒細(xì)胞分化和卵巢發(fā)育、功能維持方面起著不可替代的作用。宮頸癌作為婦科三大常見腫瘤，其病死率位居女性生殖道惡性腫瘤之首。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2在宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸炎及宮頸腺癌中不表達(dá)，在宮頸鱗癌組織中高表達(dá)。并進(jìn)一步通過相關(guān)功能試驗(yàn)得出FOXL2可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲并促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡的結(jié)論。說明FOXL2在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起抑癌基因的作用[15]。以往對FOXL2基因的研究大多集中在FOXL2的功能研究，針對FOXL2基因的調(diào)控則鮮有報(bào)道。因已有學(xué)者通過試驗(yàn)說明宮頸腺癌HeLa細(xì)胞可轉(zhuǎn)錄FOXL2的mRNA,本試驗(yàn)直接選取HeLa細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。為了進(jìn)一步研究抑癌基因FOXL2的上游調(diào)控機(jī)制及其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們通過生物信息學(xué)軟件分析了FOXL2基因mRNA的3′UTR端，發(fā)現(xiàn)了潛在的miRNA-520e的結(jié)合位點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miRNA-520e可靶向抑制FOXL2基因表達(dá)，使FOXL2 mRNA和蛋白表達(dá)量下降；細(xì)胞遷移試驗(yàn)及細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miRNA-520e可通過靶向抑制FOXL2促進(jìn)HeLa細(xì)胞的遷移與增殖。

綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果表明，在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)miRNA-520e能抑制FOXL2 mRNA及蛋白的表達(dá)，且促進(jìn)HeLa細(xì)胞的遷移與增殖。miRNA-520e靶向調(diào)控宮頸癌HeLa細(xì)胞FOXL2基因?yàn)閷m頸癌的基因治療和干預(yù)指出了新的研究方向，并提供了理論基礎(chǔ)。需要指出的是，miRNA-520e靶向FOXL2促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖與遷移的具體作用機(jī)制仍需更深入的探索，miRNA-520e是否對于FOXL2基因缺陷病——BPES具有調(diào)控作用尚需后續(xù)試驗(yàn)來驗(yàn)證。

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MicroRNA-520e promotes migration and proliferation of HeLa cells by targeting FOXL2 gene

LIUYue,WANGXiaoyu,QUChun'an,HUYanuan,TANGShengjian

(WeifangMedicalCollege,Weifang261041,China)

Objective To investigate the regulative effects of microRNA-520e on FOXL2 gene of HeLa cells and its influence on the migration and proliferation of HeLa cells. Methods Using bioinformatics (Target Scan Human 7.1) to predict that miRNA-520e may bind to FOXL2 mRNA 3'UTR. HeLa cells were randomly divided into the negative control group (added with NC Fam mimics), control group (no treatment), and miRNA-520e group(added with miRNA-520e mimics). We transfected miRNA mimics into HeLa cells in each group by using Lipofectamine 3000 Reagent. At 48 h after transfection, the FOXL2 mRNA and protein expression was detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting, respectively. Besides, at 24 h, we used Scratch test to detect the cell migration ability, and the ACEA xCELLigence RTCA DP cell analyzer to detect the cell proliferation.Results The expression of FOXL2 mRNA and protein in the miRNA-520e group was lower than that in the control group and negative control group, and the migration and proliferation abilities of the miRNA-520e group were stronger than those of the control group and negative control group (allP<0.05).Conclusion miRNA-520e could inhibit the expression of FOXL2 mRNA and protein in HeLa cells, and promote the migration and proliferation of HeLa cells by targeting FOXL2.

cervical carcinoma; HeLa cells; microRNA-520e; FOXL2 gene; cell migration; cell proliferation

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272122)。

劉悅(1991-)，女，在讀碩士，主要研究方向?yàn)檎瓮饪?。E-mail:farah0607@qq.com

唐勝建(1950-)，男，教授，主要研究方向?yàn)檎瓮饪?。E-mail:tsj3676@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.003

R73

A

1002-266X(2017)29-0008-04

2017-06-08)