王婷，趙宗江，張新雪，苗永輝，楊冠男

糖腎寧含藥血清對高糖刺激腎小管上皮細胞增殖作用及RhoA/ROCK信號通路影響的實驗研究＊

王婷，趙宗江＊＊，張新雪，苗永輝，楊冠男

（北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院北京100029）

目的：探討糖腎寧含藥血清對高糖刺激腎小管上皮細胞增殖作用及RhoA/ROCK信號通路的影響。方法：10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)細胞分為正常組、模型組、厄貝沙坦組和糖腎寧組，按每孔3 000個細胞接種于96孔板中。每組8個復孔，加入6%的各組含藥血清培養(yǎng)，分別于12、24、48、60 h觀察細胞形態(tài)并應用MTT法檢測細胞增殖情況；Western blotting檢測RhoA、ROCK1、α-SMA和E-Cadherin蛋白的表達。結果：正常組細胞呈扁平不規(guī)則多角形，高糖刺激下，細胞呈梭型，加入含藥血清后呈扁平不規(guī)則多角形。MTT：24、48 h，正常組與模型組比較，有極顯著性差異（P＜0.01），60 h，正常組與模型組比較，有顯著性差異（P＜0.05）；24 h，糖腎寧組與厄貝沙坦組比較，有顯著性差異（P＜0.05）；48 h，糖腎寧組與厄貝沙坦組、Y27632組比較，有極顯著性差異（P＜0.01）；60 h，糖腎寧組與厄貝沙坦組、Y27632組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。Western blotting：正常組與模型組、Y27632組比較RhoA蛋白表達減少，有極顯著性差異（P＜0.01）；糖腎寧組與模型組比較，有極顯著性差異（P＜0.01）；糖腎寧組與Y27632組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。正常組與模型組比較ROCK1蛋白表達減少，有極顯著性差異（P＜0.01）；Y27632組、各治療組和模型組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。正常組與模型組比較α-SMA蛋白表達減少，有極顯著性差異（P＜0.01）；Y27632組、各治療組和模型組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。正常組與模型組組比較E-Cadherin蛋白表達增加，有顯著性差異（P＜0.05）；Y27632組與糖腎寧組比較，有顯著性差異（P＜0.05）；模型組與Y27632組、各治療組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。結論：糖腎寧可抑制高糖培養(yǎng)腎小管上皮細胞增殖和RhoA/ROCK信號通路相關分子的表達，逆轉腎小管上皮細胞轉分化、減輕腎間質纖維化、延緩DKD進程。

糖腎寧腎痿腎小管上皮細胞株KKay小鼠細胞增殖MTT EMT RhoA/ROCK信號通路

由于人口老齡化情況加劇，飲食結構以及生活方式的不斷改變，使眾多發(fā)展中國家及部分發(fā)達國家中罹患糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）的人數急劇上升。我國在過去30年中DM發(fā)病率急劇攀升，據統(tǒng)計中國約0.92億人罹患DM[1～3]。此外，DM其微血管并發(fā)癥糖尿病腎?。―iabetic Kidney Disease，DKD）嚴重威脅著人類的生命健康。DKD已成為終末期腎?。‥nd stage renal disease,ESRD）的主要原因[4,5]?，F研究表明DKD發(fā)病機制與腎小球及腎小管的病理改變密切相關，抑制腎小管上皮細胞轉分化在延緩糖尿病腎病進程中具有重要作用。目前多應用ACEI及ARB類藥物，可降低尿蛋白水平、減少并發(fā)心血管疾病的風險及控制血壓[6]。因此如何有效防治本病的發(fā)生發(fā)展是亟需解決的重要問題。

近年來，中醫(yī)藥在防治本病方面取得了一定的進展，并初步顯示出獨特優(yōu)勢。導師趙宗江教授發(fā)掘傳統(tǒng)醫(yī)學“痿癥”相關理論，并結合現代醫(yī)學對DKD的認識，提出了DKD“腎痿”假說，并在此理論指導下組方糖腎寧，前期研究表明以“腎痿”假說組方的糖腎寧具有消除水腫、降低蛋白尿等的作用；糖腎寧可通過下調腎組織TGF-β1、NF-?B蛋白表達，上調smad7蛋白的表達來改善STZ誘導DKD大鼠腎功能及氧化應激狀態(tài)，起到延緩DKD進程的重要作用，此外，應用高糖培養(yǎng)足細胞中證實糖腎寧可以下調TGF-β1、NF-?B表達，上調smad7表達[7,8]。而且糖腎寧通過調控TGF-β1-smad2/3-ILK信號通路，抑制足細胞轉分化，保護腎小球結構與功能，從而減輕DKD腎臟損害，延緩病程進展[9]。本研究擬通過給予高糖環(huán)境刺激小鼠腎小管上皮細胞，觀察糖腎寧含藥血清對高糖培養(yǎng)小鼠腎小管上皮細胞增殖及RhoA/ROCK信號通路的影響，以期闡述其對腎小管上皮細胞增殖與上皮細胞轉分化的影響，為糖尿病腎病“腎痿”科學假說提供新的實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞

小鼠近端腎小管上皮細胞株（購買自美國ATCC公司，4100-57）。

1.2 實驗藥物

糖腎寧（熟地黃6 g、山萸肉3 g、懷山藥3 g、杜仲2 g、炒白芍2 g、淫羊藿2 g、水蛭2 g、酒大黃2 g，北京中醫(yī)藥大學中藥學院制劑室制備，批號：2016019）；厄貝沙坦片（賽諾菲安博維，進口藥品注冊證號：H20140006，國藥準字J20130049）。

1.3 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco，批號：1786043）；胰蛋白酶（Amresco，批號：1554C333）；胎牛血清（HyClone，批號：NZE1145）；MTT（Amresco，批號：20120308418）；DMSO（Amresco，批號：2075C127）；青鏈霉素混合液（Solarbio，貨號：P1400）；右旋葡萄糖（D-GLU，Amresco，批號1056C459）；蛋白抽提試劑（MERCK，71009-3CN）；通用型蛋白酶抑制劑（MERCK，539134）；BCA法蛋白定量試劑盒（普利萊，批號：20151511052003）；一抗β-actin（CST，批號：0011）；RhoA（Novus Biologicals，批號：Rb0322-200308-WS）；ROCK1（Abcam，批號：GR149410-2）；α-SMA（Abcam，批號：GR32377-41）；E-Cadherin（Abcam，批號：GR216035-1）；二抗山羊抗兔（Abcam，批號：GR231489-1）；山羊抗鼠（Abcam，批號：GR215715-5）；ECL超敏發(fā)光液（Millipore，批號：1316802）。

1.4 實驗儀器

倒置顯微鏡（Olympus），超凈工作臺（北京市昌平長城空氣凈化設備公司)，B5060EK/CO2恒溫CO2培養(yǎng)箱（德國），450型自動酶標儀（MuLtiskan Aseentvl 24345-00627T）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清的制備

9只Wistar大鼠，雄性，SPF級，體重（300±20）g，按照體重隨機分層，分為正常組、厄貝沙坦組、糖腎寧組3組，每組各3只，給藥組每天灌胃給藥1次，灌胃劑量1 mL·100 g-1，正常組灌等量去離子水，依據人臨床用藥劑量，糖腎寧按人臨床用藥劑量7倍（1.05 g·kg-1）灌胃給藥；厄貝沙坦組按人臨床用藥劑量7倍（17.5 mg·kg-1）灌胃給藥，每日1次，連續(xù)灌胃7天，末次給藥2 h后，股動脈取血，離心分離血清，-20℃保存

2.2 細胞處理及分組

鏡下觀察細胞生長至80%左右時，0.25%胰蛋白酶消化2 min，10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基終止消化后離心，1 000 rpm離心2 min，棄上清；加含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基入T25細胞培養(yǎng)瓶，置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.3 實驗分組

實驗分為正常組、模型組、抑制劑（Y27632）組、厄貝沙坦組、糖腎寧組。正常組：6%正常大鼠血清-RPMI 1640；模型組：6%正常大鼠血清-RPMI 1640+DGLU（30 mmol/L）；Y27632組：6%FBS-RPMI 1640+DGLU（終濃度30 mmol/L）+Y27632（10 umol/L）；厄貝沙坦組：6%厄貝沙坦含藥血清-RPMI 1640+D-GLU（30 mmol/L）；糖腎寧組：6%糖腎寧含藥血清-RPMI 1640+D-GLU（30mmol/L）；

2.4 倒置相差顯微鏡下觀察小鼠腎小管上皮細胞形態(tài)的改變

選擇合適亮度及瞳距，先以目鏡為10×，物鏡為4×觀察，粗微調焦后使鏡下腎小管上皮細胞清晰，切換到10×物鏡統(tǒng)一選取培養(yǎng)瓶中央拍照。

圖1 各組小鼠腎小管上皮細胞形態(tài)及增殖情況（×100）

2.5 MTT法檢測細胞增殖

細胞生長至80%左右，0.25%的胰酶1 mL消化，等體積6%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基終止消化；按每孔300 0個細胞種植于96孔培養(yǎng)板上，每組設8個復孔，置培養(yǎng)箱中孵育24 h，無血清RPMI 1640液每孔200 μL培養(yǎng)，細胞同步24 h，使細胞靜止于Go期；吸棄舊的培養(yǎng)基，加入相應組別含藥血清；繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、60h甩去96孔板內培養(yǎng)基，各孔加入10 μL終濃度為5 mg·ml-1的MTT溶液及190 μL無血清1640培養(yǎng)基；37℃、CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h；甩去各孔培養(yǎng)基，室溫避光條件下加入200 μL DMSO（二甲基亞砜，Dimethylsulfoxide），置于搖床上輕輕震蕩10 min，450型自動酶標儀檢測并記錄各孔吸收波OD值（波長492 nm）。

2.6 Western blotting檢測各組腎小管上皮細胞中RhoA、ROCK1、α-SMA、E-Cadherin蛋白的表達

取小鼠腎組織勻漿后加1 mL預冷的RIPA裂解液，取上清液。BCA法測蛋白濃度，加上樣緩沖液沸水浴5 min進行蛋白變性，制備SDS-PAGE膠、蛋白上樣，凝膠電泳80 V，30 min左右，藍色指示劑到達濃縮膠下緣時，調節(jié)電壓為120 V繼續(xù)電泳1.5 h左右終止電泳。恒壓轉膜60 V 2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBS（TBS-T）沖洗，分別加β-actin（1∶200 0）、RhoA（1∶500）、ROCK1（1∶500）、α-SMA（1∶200 0）、E-Cadherin（1∶100 0），4℃過夜。加二抗（稀釋1∶200 0），置于搖床室溫反應1小時，ECL化學發(fā)光液顯影，應用BIO-RAD曝光成像系統(tǒng)拍照，Image J圖像分析進行圖像分析；各靶蛋白均與內參β-actin蛋白對照，計算靶蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為靶蛋白表達的相對水平。

2.7 統(tǒng)計學方法

用SPSS22.0系統(tǒng)進行數據統(tǒng)計分析，數據用（xˉ±s）表示，組間比較用One-Way ANOVA，P＜0.05有統(tǒng)計學差異，P＜0.01有顯著統(tǒng)計學差異。

3 結果

3.1 腎小管上皮細胞形態(tài)

正常培養(yǎng)下小鼠腎小管上皮細胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央圓形核，細胞融合呈鵝卵石狀；高糖刺激后，細胞呈梭形，生長時呈放射狀；相應含藥血清干預后，胞體由拉長的梭形向扁平不規(guī)則多角形發(fā)展，見圖1。

3.2 糖腎寧對小鼠腎小管上皮細胞增殖的影響

如表1所示，24、48 h時，正常組與模型組比較，有極顯著性差異（P＜0.01），60 h，正常組與模型組比較，有顯著性差異（P＜0.05）；24 h，糖腎寧組與厄貝沙坦組比較，有顯著性差異（P＜0.05）；48 h，糖腎寧組與厄貝沙坦組、Y27632組比較，有極顯著性差異（P＜0.01）；糖腎寧組與厄貝沙坦組、Y27632組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。

3.3 糖腎寧對高糖培養(yǎng)腎小管上皮細胞RhoA、

ROCK1、E-cadherin、α-SMA蛋白表達的影響

3.3.1 RhoA、ROCK1表達

正常組與模型組、Y27632組比較RhoA蛋白表達減少，有極顯著性差異（P＜0.01）；糖腎寧組與模型組比較，有極顯著性差異（P＜0.01）；糖腎寧組與Y27632組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。正常組與模型組比較ROCK1蛋白表達減少，有極顯著性差異（P＜0.01）；Y27632組、各治療組和模型組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 糖腎寧對高糖刺激腎小管上皮細胞增殖的影響（xˉ±s，n=7，OD值）

表2 糖腎寧對高糖刺激小鼠腎小管上皮細胞RhoA/ROCK通路蛋白表達的影響（xˉ±s，n=3）

3.3.2 α-SMA、E-Cadherin表達

正常組與模型組比較α-SMA蛋白表達減少，有極顯著性差異（P＜0.01）；Y27632組、各治療組和模型組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。正常組與模型組比較E-Cadherin蛋白表達增加，有顯著性差異（P＜0.05）；Y27632組與糖腎寧組比較，有顯著性差異（P＜0.05）；模型組與Y27632組、各治療組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。見表2，圖2。

4 討論

圖2 糖腎寧對高糖刺激小鼠腎小管上皮細胞RhoA、ROCK1、α-SMA、E-CAD蛋白表達的影響

DKD是糖尿病常見的嚴重微血管并發(fā)癥，其發(fā)病機制與血流動力學異常、糖代謝紊亂和遺傳等因素有關，其病理改變主要包括腎小球硬化和腎間質纖維化[10,11]。腎小管上皮細胞作為形成腎小管-間質結構的主要細胞之一，其表型轉化在腎小管-間質纖維化進展過程中起重要作用。腎小管上皮細胞EMT是 DKD功能喪失的關鍵因素，糖尿病腎病時，高糖刺激下會加重腎小管間質的損傷。糖尿病腎病時發(fā)生腎小管上皮細胞損傷，機體通過細胞增殖起到保護作用，也可以在增殖后進一步轉分化為成纖維細胞，分泌致纖維化生長因子加重DKD腎纖維化的進程[6]。因此，通過抑制細胞增殖可以在一定程度上抑制腎小管上皮細胞轉分化。研究高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細胞增殖與轉分化之間的關系變得尤為重要。

中醫(yī)學中將糖尿病腎病歸屬于“水腫”、“消渴腎病”、“腎風”等范疇。導師趙宗江教授在整理古代文獻的基礎上，結合臨床實踐，提出糖尿病腎病“腎痿”假說：DKD的發(fā)生發(fā)展，實質上是DM遷延不愈，傷陰耗氣，痰郁熱瘀互相膠結，積聚于腎臟，損傷“腎體”，結構是功能的基礎，導致“腎用”發(fā)生改變，腎臟痿廢不用，發(fā)為“腎痿”[7]。在“腎痿”假說指導下組方的糖腎寧，其藥物組成有熟地黃、山萸肉、懷山藥、杜仲、炒白芍、淫羊藿、水蛭、酒大黃，其中熟地黃、山萸肉、懷山藥滋腎陰補血；淫羊藿、杜仲溫腎助陽；炒白芍健脾補虛柔肝；水蛭、酒軍活血化瘀解毒，諸藥合用可溫腎健脾，化瘀解毒，適用于陰陽兩虛證、瘀毒內阻證，對DKD具有良好的效果[8]。

糖腎寧不僅在臨床上取得了較好的療效，本課題組前期實驗研究也肯定了糖腎寧的療效[8,9]。前期研究表明糖腎寧可通過提高Smad7、抑制TGF-β1和NF-κB表達來改善DN大鼠糖尿病腎病癥狀，同時，糖腎寧可通過調控TGF-β1-smad2/3-ILK信號通路抑制足細胞轉分化，保障腎小球濾過屏障功能，延緩DKD進程。本次細胞實驗是在前期研究基礎上，探討糖腎寧對高糖培養(yǎng)腎小管上皮細胞增殖及轉分化的影響，結果表明糖腎寧可以抑制高糖培養(yǎng)下的腎小管上皮細胞的增殖與轉分化，降低RhoA、ROCK1和α-SMA蛋白表達水平，升高E-Cadherin蛋白表達水平，逆轉腎小管上皮細胞轉分化，抑制DKD腎間質纖維化，延緩疾病進程，其具體作用機制有待進一步研究。

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Effect of Compound Tangshenning on Proliferation and RhoA/ROCK Signaling Pathway of High Glucose-induced Epithelial Cells of Renal Tubules

Wang Ting,Zhao Zongjiang,Zhang Xinxue,Miao Yonghui,Yang Guannan
(College of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029)

Objective:To study the effect of the prescription Tangshenning on the proliferation of the high glucoseinduced cells of near-end kidney tubules.Method:To prepare durg-contained serum from mice to enter into in vitor reaction system，the cells were randomly divided into 4 groups:the normal group,the model group,the,the irbesartan group,the tangshenning group and then detect the effects of all serum sections on the proliferation of high glucose-induced epithelial cells of kidney tubules by the MTT colorimetric method,and the expression of RhoA,ROCK1,E-cadherin and α-SMA in each group were detected by Western blotting.Result:The high glucose group of renal tubular epithelial cells form from the flat irregular polygon into long fusiform;After adding the drug-containing serum corresponding intervention into the cells into a flat in irregular polygon.The high glucose group of renal tubular epithelial cells show obvious proliferation condition,In the condition of 24 h,48 h,The high glucose group proliferation is better than the normal group(P＜0.01),in 60 h,The high glucose group proliferation is better than the normal group(P＜0.05);In 24 h,compared with the irbesartan,Tangshenning has better effect of inhibiting the cell proliferation(P＜0.05); In 48 h,Tangshenning has the better effect than irbesartan and Y27632(P＜0.01);In 60 h,Tangshenning has the better effect than irbesartan and Y27632(P＜0.05);Western blotting:Western blotting analysis showed that compared with the normal group,the expression of RhoA protein in high glucose group and Y27632 decreased(P＜0.01);The high glucose group and Tangshenning have significant difference(P＜0.01);Y27632 and Tangshenning have difference(P＜0.05). compared with the normal group,the expression of ROCK1 protein in high glucose group decreased(P＜0.01);The high glucose group,Tangshenning,the irbesartan and Y27632 have difference(P＜0.05).Compared with the normal group,the expression of α-SMA protein in high glucose group decreased(P＜0.01);The high glucose group,Tangshenning,the irbesartan and Y27632 have difference(P＜0.05).Compared with the normal group,the expression of E-Cadherin protein in high glucose group increased(P＜0.05).Y27632 and Tangshenning have difference(P＜0.05).The high glucose group, Tangshenning,the irbesartan and Y27632 have difference(P＜0.05).Conclusion:The prescription Tangshenning is able to inhibit the proliferation of high glucose-induced epithelial cells of kidney tubules and and can reverse renal tubularepithelial cell transdifferentiation via regulating RhoA/ROCK signaling pathway,and restrain renal interstitial fibrosis, thereby delaying the pathogenesis of diabetic kidney disease.

Tangshenning;consumptive kidney disease;Renal Tubular Epithelial Cell Line;KKAy Mouse;Cell Proliferation;MTT;EMT;RhoA/ROCK signaling pathway

10.11842/wst.2017.06.028

000

A

2017-04-28

修回日期：2017-06-18

＊國家自然科學基金委面上項目（81373831）：基于“腎痿”組方的糖腎平干預糖尿病腎病腎小管上皮細胞轉分化的分子機制研究，負責人：趙宗江。

＊＊趙宗江，教授，博士生導師，主要研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病腎病的機制研究。