譚小田 張志敏 趙琳

·短篇論著·

煙霧刺激通過損傷A549細(xì)胞DNA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生

譚小田1張志敏2趙琳3

細(xì)胞凋亡； 煙霧損傷； 白細(xì)胞介素-1β； 腫瘤壞死因子-α

呼吸道煙霧吸入性損傷是一種極其常見的損傷，常發(fā)生于火災(zāi)、毒氣泄漏或是吸煙等情況下[1]。煙霧吸入性損傷常常由于吸入燃燒產(chǎn)生的高溫、有毒氣體而導(dǎo)致，輕者可以出現(xiàn)呼吸道的不適反應(yīng)，重者則會影響呼吸道的通暢，導(dǎo)致患者窒息死亡。呼吸道煙霧吸入性損傷主要分為兩個(gè)方面：首先，高溫氣體的吸入可以引起呼吸道的灼傷，導(dǎo)致呼吸道黏膜損傷，出現(xiàn)滲出及水腫，嚴(yán)重的可以出現(xiàn)呼吸困難，如果治療不當(dāng)，后期還會出現(xiàn)氣管狹窄等并發(fā)癥；其次，煙霧中有毒有害氣體的吸入也會引起呼吸道的損傷以及煙霧吸入性急性呼吸窘迫綜合征[2-3]。這些損傷給患者的救治帶來了極大的困難，因此深入研究煙霧吸入導(dǎo)致呼吸道細(xì)胞損傷的機(jī)制，探索有效的救治方案至關(guān)重要。A549細(xì)胞是人來源的肺泡上皮細(xì)胞系，在受到煙霧刺激時(shí)，會出現(xiàn)皺縮、凋亡、壞死等現(xiàn)象，進(jìn)而影響肺的血?dú)馄琳习l(fā)揮正常的生理功能，導(dǎo)致肺部炎癥、水腫的產(chǎn)生[4-5]。而DNA損傷是導(dǎo)致細(xì)胞生理功能障礙、細(xì)胞周期紊亂以及凋亡產(chǎn)生的重要原因之一[6]。DNA損傷是一種明確的細(xì)胞內(nèi)部的凋亡信號，研究表明其主要通過激活依賴線粒體的凋亡信號通路實(shí)現(xiàn)的[7]。在煙霧吸入性肺損傷中，煙霧是否可以通過損傷肺泡上皮細(xì)胞的DNA，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生仍不明確[8]。本研究旨在通過實(shí)驗(yàn)明確DNA損傷在煙霧吸入性肺部損傷發(fā)生發(fā)展中所起到的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

A549細(xì)胞(ATCC，美國)，抗γ-H2A.X(phosphor S139)單克隆抗體(Abcam，美國)，抗GAPDH多克隆抗體(CST，美國)，CometAssay Silver檢測試劑盒(TREVIGEN，美國)， IL-1β、TNF-α 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(Abcam，美國)。實(shí)驗(yàn)用到的香煙煙霧提取物是將香煙連接氣體抽吸裝置，將香煙點(diǎn)燃后，吸入的煙霧經(jīng)由出口通入無血清的RIPM1640培養(yǎng)液中制備成懸液，然后用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4。最后經(jīng)微孔濾膜過濾后使用。

二、實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)分為對照組、煙霧12 h組、煙霧24 h組、煙霧48 h組和陽性對照組。

1. 各組細(xì)胞的處理： 實(shí)驗(yàn)組取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，給予香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract, CSE)刺激預(yù)定時(shí)間(12、24和48 h)；對照組為正常條件下培養(yǎng)的A549細(xì)胞；陽性對照組取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，給予100 μM濃度的H2O2刺激20 min。用CCK-8法檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞活性改變。

2. ELISA檢測： 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的含量：各組細(xì)胞按規(guī)定的處理完畢后，將細(xì)胞上清液小心吸出，在4 ℃，以離心半徑8 cm，3 000 r/min離心5 min，取上清液，參照試劑盒的說明書進(jìn)行檢測。

3. 彗星實(shí)驗(yàn)： 彗星實(shí)驗(yàn)是一種檢測細(xì)胞DNA損傷的有效方法。取對照組、煙霧刺激48 h和陽性對照組細(xì)胞，胰酶消化后離心收集細(xì)胞，PBS漂洗備用。首先將收集到的細(xì)胞與預(yù)先融化的LMAgarose混合，然后平鋪在載玻片上。待其冷卻凝固后，依次將其浸沒在裂解液和解螺旋液中。然后21V恒壓電泳30 min。最后采用DAPI標(biāo)記DNA后熒光纖維鏡下觀察。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照CometAssay Silver檢測試劑盒說明書。

4. Western-blot檢測： γ-H2A.X磷酸化情況：γ-H2A.X蛋白大量磷酸化是細(xì)胞DNA損傷時(shí)的重要的標(biāo)志之一[9]。本實(shí)驗(yàn)采用Western-blot的方法檢測其磷酸化情況的改變。取對照組、煙霧刺激48 h和陽性對照組細(xì)胞，用細(xì)胞刮刮下后，加入適量的蛋白裂解液于冰上裂解30 min，離心收集上清，加入蛋白上樣緩沖液后沸水煮10 min，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)的方式將電泳后的聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白分子轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。待10%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入抗γ-H2A.X(phosphor S139)單克隆抗體(1︰1 000稀釋)，4 ℃搖床震蕩過夜。TBST洗膜后加入山羊抗兔的二抗，室溫孵育2 h，再次TBST洗滌后顯色、照相并進(jìn)行掃描分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、A549細(xì)胞活性的改變

煙霧提取物刺激A549細(xì)胞后，細(xì)胞活性較正常組顯著降低(P<0.05)，并且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，刺激48 h細(xì)胞活性最低，僅為正常組的1/4，改變最為明顯，見圖1。

圖1 A549細(xì)胞活性的改變；注：*P<0.05vs. 正常組

二、煙霧提取物對于A549細(xì)胞釋放IL-1β和TNF-α的影響

煙霧提取物的刺激24 h和48 h可以引起IL-1β和TNF-α釋放的增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-1β和TNF-α水平均明顯增高(P<0.05)，其濃度變化隨刺激時(shí)間的延長而增加，以煙霧提取物刺激48 h變化最為顯著，見圖2。

圖2 A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-1β和TNF-α檢測結(jié)果；注：*P<0.05vs. 正常組

三、煙霧提取物對于A549細(xì)胞DNA雙鏈完整性的影響

為檢測煙霧提取物對于A549細(xì)胞DNA雙鏈完整性的影響，進(jìn)行了彗星實(shí)驗(yàn)。在單細(xì)胞電泳時(shí)受損DNA 向正極遷移形成“彗星”狀圖像，而未受損傷的DNA部分保持球形，DNA受損越嚴(yán)重，產(chǎn)生的斷鏈和斷片越多，長度也越大[10]。煙霧提取物刺激組細(xì)胞DNA呈明顯的彗星樣改變，而正常組細(xì)胞DNA呈球形，提示煙霧提取物的刺激可以引起A549細(xì)胞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的損傷，見圖3。

圖3 煙霧提取物對A549細(xì)胞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的影響

四、Western-blot檢測γ-H2A.X磷酸化情況

γ-H2A.X蛋白大量磷酸化是細(xì)胞DNA損傷時(shí)的重要的標(biāo)志之一[11]。本實(shí)驗(yàn)檢測了其磷酸化水平的變化。煙霧提取物刺激組的γ-H2A.X磷酸化程度明顯高于對照組，從另一方面證實(shí)了煙霧提取物的刺激具有DNA毒性，可以破壞DNA的完整性，見圖4。

圖4 γ-H2A.X磷酸化改變；注：*P<0.05vs. 正常組

討 論

實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)煙霧可以對肺臟產(chǎn)生明顯的損傷作用，引起肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征。現(xiàn)階段對于有毒氣體吸入性損傷的研究主要為火災(zāi)導(dǎo)致的嚴(yán)重的燒傷以及一些常見建筑材料燃燒釋放的有毒氣體吸入引起的呼吸道及肺急性損傷。常見的表現(xiàn)為呼吸道的灼傷、呼吸道黏膜水腫、氣管狹窄以及急性呼吸窘迫綜合征[2, 12]。臨床的治療以消炎、預(yù)防感染、保持呼吸道通暢以及抗休克等一般維持治療為主，并沒有針對性的有效治療藥物或治療方案[1]。燒傷早期治療的一個(gè)重要組成部分就是維持呼吸道的通暢和治療吸入性損傷[3]。吸入燃燒產(chǎn)生的具有毒性的氣體所引起的死亡占到了火災(zāi)相關(guān)死亡中的很大一部分。產(chǎn)生的這些種類繁多的化合物可以通過協(xié)同作用，增加患者的病死率。近期研究表明20%～30%以上的嚴(yán)重?zé)齻己喜⒂袩熿F吸入性損傷，如果不能得到有效治療，其中20%～50%的患者將因此而喪命[13]。煙霧吸入性損傷主要包括五種常見的臨床表現(xiàn)：急性上呼吸道阻塞、支氣管痙攣、小氣道阻塞、肺部感染和呼吸衰竭[14-15]。上呼吸道的損傷主要是繼發(fā)于煙霧直接的熱損傷和化學(xué)刺激；而下呼吸道損傷主要是由于有毒氣體向遠(yuǎn)端的彌散以及全身或局部炎癥反應(yīng)的激活[2]。

對于煙霧引起肺臟損傷的原因及機(jī)制的研究依然不足。通過本實(shí)驗(yàn)證實(shí)香煙煙霧提取物可以對A549細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用，引起細(xì)胞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的破壞。DNA受損是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要信號之一，DNA損傷可以引起細(xì)胞核內(nèi)蛋白分子與損傷處DNA的結(jié)合，并引發(fā)一系列信號級聯(lián)反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡與凋亡執(zhí)行相關(guān)分子的活動。DNA損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡絕大部分是通過依賴線粒體的信號通路來實(shí)現(xiàn)的。

煙霧提取物如何引起A549細(xì)胞DNA損傷方面的研究依然缺乏，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的研究。推測其與煙霧刺激下細(xì)胞線粒體功能的紊亂有密切的關(guān)系。有研究顯示煙霧刺激可以導(dǎo)致A549細(xì)胞線粒體功能紊亂，膜電位降低，線粒體中的細(xì)胞色素C大量的釋放到細(xì)胞質(zhì)中，引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生。除此之外細(xì)胞中的死亡受體通路也會被異常激活，共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[16]。線粒體功能的紊亂除了可以引起凋亡通路的激活以外，還會導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species, ROS)的大量產(chǎn)生，而ROS是一類已經(jīng)被明確證實(shí)具有強(qiáng)烈的致DNA損傷的物質(zhì)。因此我們推測煙霧提取物引起DNA損傷是通過線粒體-ROS途徑產(chǎn)生作用的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過研究香煙煙霧提取物對于A549細(xì)胞的損傷作用，重點(diǎn)探索了A549細(xì)胞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的完整性，證實(shí)了煙霧提取物可以引起A549細(xì)胞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的破壞。

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(本文編輯：黃紅稷)

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10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.04.021

710054 西安，解放軍第四五一醫(yī)院1710000 西安，唐都醫(yī)院2721004 寶雞，解放軍第三醫(yī)院3

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2016-10-20)