段浩博，包雪鸚，胡 楊，曲極冰，李 紅，紀(jì)影實(shí)*

(1.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021；2.解放軍第208醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130062；3.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理系，吉林 長春130021)

清腦止痛膠囊對(duì)利血平致偏頭痛模型大鼠的影響

段浩博1，包雪鸚2，胡 楊3，曲極冰3，李 紅3，紀(jì)影實(shí)3*

(1.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021；2.解放軍第208醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130062；3.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理系，吉林 長春130021)

目的 研究清腦止痛膠囊(QNZTJN)對(duì)利血平致偏頭痛模型大鼠血漿和中腦組織相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)及炎性因子的影響。方法 90只健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)均分為6組：空白組，模型組，陽性藥正天丸組(ZTW，0.006 g/kg)，清腦止痛膠囊劑量低(QNZTJN-L，0.35 g/kg)、中(QNZTJN-M，0.7 g/kg)、高(QNZTJN-H，1.4 g/kg)組。皮下注射利血平(0.7 mg/kg)14 d建立偏頭痛模型，造模第4 d開始灌胃給藥11 d，觀察末次給藥后3 h內(nèi)大鼠行為學(xué)反應(yīng)；免疫組織化學(xué)法及Western blot法，檢測(cè)大鼠中腦組織核因子kappa B(NF-κB)和環(huán)氧合酶2(COX-2)表達(dá)水平；酶聯(lián)免疫法，檢測(cè)大鼠血漿和中腦組織5-羥色胺(5-HT)、前列環(huán)素E2(PGE2)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)含量水平。結(jié)果 模型組與空白組相比，大鼠撓頭次數(shù)顯著增加(P<0.01)，NF-κB、COX-2在中腦組織表達(dá)顯著增加(P<0.01)，5-HT在血漿和中腦組織含量顯著降低(P<0.01)，PGE2、TNF-α、IL-1β在血漿和中腦組織含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)。QNZTJN-M、QNZTJN-H組和ZTW組與模型組相比，大鼠撓頭次數(shù)顯著減少(P<0.05，P<0.01)，NF-κB、COX-2在中腦組織表達(dá)顯著降低(P<0.05，P<0.01)，5-HT在血漿和中腦組織含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)，PGE2、TNF-α、IL-1β在血漿和中腦組織含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論 清腦止痛膠囊可緩解利血平致大鼠偏頭痛癥狀，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)神經(jīng)源性炎癥和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)釋放有關(guān)。

清腦止痛膠囊；利血平；偏頭痛；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)；神經(jīng)源性炎癥

(ChinJLabDiagn,2017,21:1415)

偏頭痛具有顯著的反復(fù)發(fā)作搏動(dòng)性頭痛特征，對(duì)聲、光、頭部晃動(dòng)等刺激較敏感。目前仍未完全闡明其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，偏頭痛的藥物治療效果仍不理想[1]。研究表明，腦膜血管擴(kuò)張、異常炎癥反應(yīng)和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)減少是偏頭痛發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，與腫瘤壞死因子α(TNF-α)、核因子kappa B(NF-κB)、白介素1β(IL-1β)等炎癥因子及5-羥色胺(5-HT)等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)密切相關(guān)[2-4]。川芎和天麻為清腦止痛膠囊的主要成分，已有研究表明對(duì)偏頭痛有良好療效[5]。本實(shí)驗(yàn)采用注射利血平復(fù)制偏頭痛大鼠模型，觀察清腦止痛膠囊對(duì)利血平致偏頭痛大鼠血漿和中腦組織中炎癥因子及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠90只，體重190 g-210 g，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(吉)-2007-0003。

1.2 藥品和試劑 清腦止痛膠囊，由吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；正天丸，由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)；利血平注射液，由天津金耀藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；本實(shí)驗(yàn)所需的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，均購于安迪生物科技有限公司；兔抗大鼠COX-2單克隆抗體、兔抗大鼠NF-κB單克隆抗體，由艾博抗貿(mào)易有限公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組、造模及給藥 雄性Wistar大鼠90只隨機(jī)均分為6組，即空白組，模型組，ZTW組，QNZTJN-H、QNZTJN-M、QNZTJN-L組?？瞻捉M皮下注射生理鹽水，其余各組注射利血平造模(0.7 mg/kg)，連續(xù)14 d，于造模第4 d開始灌胃給藥，連續(xù)11 d。清腦止痛膠囊高、中、低及正天丸給藥劑量分別為1.4 g/kg、0.7 g/kg、0.35 g/kg、0.006 g/kg，其余組灌胃給予適量蒸餾水。

1.3.2 行為學(xué)評(píng)分 末次給藥后，觀察各組大鼠在3 h內(nèi)的撓頭次數(shù)。

1.3.3 取材及標(biāo)本處理 腹腔注射10%水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈采血，4℃、4 000 r/min離心20 min，取上層清液檢測(cè)生化指標(biāo)。每組取10只剝離中腦，裂解組織勻漿，4℃、4 000 r/min離心20 min，取上層清液檢測(cè)生化指標(biāo)，剩余5只剝離中腦10%福爾馬林固定。

1.3.4 指標(biāo)檢測(cè) 酶聯(lián)免疫法，檢測(cè)血漿與中腦5-HT、PGE2、TNF-α和IL-1β含量；免疫組化法和Western Blot法，檢測(cè)大鼠中腦COX-2、NF-κB水平。實(shí)驗(yàn)方法按照本課題已發(fā)表文獻(xiàn)所訴進(jìn)行[6]。

2 結(jié)果

2.1 清腦止痛膠囊對(duì)偏頭痛大鼠行為的影響

末次給藥后3h內(nèi)，與空白組相比，模型組撓頭次數(shù)顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，清腦止痛膠囊組撓頭次數(shù)減少，其中高劑量組與中劑量組顯著減少(P<0.05，P<0.01)，具有一定的劑量依賴性，結(jié)果見圖1。

1：空白組；2：模型組；3-5：清腦止痛膠囊低、中、高組；6：正天丸組**P<0.01，與空白組比較；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較

2.2 清腦止痛膠囊對(duì)偏頭痛大鼠中腦組織NF-κB表達(dá)的影響

免疫組化，與空白組相比，模型組中腦NF-κB表達(dá)呈陽性的細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，清腦止痛膠囊中劑量、高劑量組中腦NF-κB表達(dá)呈陽性的細(xì)胞比例顯著減少(P<0.05，P<0.01)，且具有一定的劑量依賴性，結(jié)果見圖2。WesternBlot，與空白組相比，模型組中腦NF-κB表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，清腦止痛膠囊中劑量、高劑量組中腦NF-κB表達(dá)顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且具有一定的劑量依賴性，結(jié)果見圖3。

2.3 清腦止痛膠囊對(duì)偏頭痛大鼠中腦組織COX-2表達(dá)的影響

免疫組化，與空白組相比，模型組中腦COX-2表達(dá)呈陽性的細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，清腦止痛膠囊中劑量、高劑量組中腦COX-2表達(dá)呈陽性的細(xì)胞比例顯著減少(P<0.05，P<0.01)，且具有一定的劑量依賴性，結(jié)果見圖4。WesternBlot，與空白組相比，模型組中腦COX-2表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，清腦止痛膠囊中劑量、高劑量組中腦COX-2表達(dá)顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且具有一定的劑量依賴性，結(jié)果見圖5。

A：空白組；B：模型組；C：正天丸組；D-F：清腦止痛膠囊低、中、高組

A，B：1：空白組；2：模型組；3-5：清腦止痛膠囊高、中、低組；6：正天丸組**P<0.01，與空白組比較；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較

2.4 清腦止痛膠囊對(duì)偏頭痛大鼠血漿和中腦5-HT、PGE2、TNF-α、IL-1β含量的影響

與空白組相比，模型組血漿和中腦的5-HT含量顯著降低(P<0.01)，PGE2、TNF-α、IL-1β含量顯著增加(P<0.05，P<0.01)，；與模型組相比，清腦止痛膠囊高劑量、中劑量組血漿和中腦的5-HT含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)，PGE2、TNF-α、IL-1β含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且具有一定的劑量依賴性，結(jié)果見表1。

3 討論

偏頭痛具有復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制且臨床尚無理想的治療藥物，于中醫(yī)屬“頭痛”“頭風(fēng)”“偏正頭痛”范疇，可從風(fēng)、寒、痰、虛、火、瘀等方面入手治療[7]。清腦止痛膠囊有效成分為天麻、川芎、蒺藜、丹參等，對(duì)偏頭痛肝風(fēng)夾瘀證有良好效果[8]。

A：空白組；B：模型組；C：正天丸組；D-F：清腦止痛膠囊低、中、高組

組別5?HT血漿(ng/L)中腦(ng/mg)PGE2血漿(ng/L)中腦(ng/g)TNF?α血漿(ng/L)中腦(ng/g)IL?1β血漿(ng/L)中腦(ng/g)空白組425．43±20．125．10±0．35181．12±10．233．67±0．2754．42±6．432．12±0．1710．37±2．03206．89±17．24模型組177．95±18．03??2．85±0．30??227．87±20．56?9．43±0．85??69．18±9．62?6．37±0．58??15．40±2．18??405．16±32．21??正天丸組281．17±10．38##4．03±0．41##192．37±16．744．78±0．32##61．73±9．442．92±0．36##12．03±1．14#266．97±15．65##QNZTJN?L206．82±21．36#3．12±0．51#208．43±22．177．78±0．47#68．28±6．276．08±0．40#13．65±1．28394．36±30．14QNZTJN?Z252．59±25．57##4．02±0．59##193．27±18．355．47±0．30##60．47±3．23#4．19±0．27##12．59±2．10#346．08±18．54#QNZTJN?G351．32±20．58##4．60±0．42##188．29±15．83#4．28±0．35##55．71±4．38#3．32±0．22##11．25±1．61##270．47±19．72##

*P<0.05，**P<0.01，模型組與空白組比較；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較

A，B：1：空白組；2：模型組；3-5：清腦止痛膠囊高、中、低組；6：正天丸組**P<0.01，與空白組比較；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較

目前認(rèn)為，偏頭痛發(fā)病機(jī)制可能與三叉神經(jīng)系統(tǒng)引起的硬腦膜無菌性炎癥及中樞、外周5-HT代謝紊亂有關(guān)[1,9]。因此本實(shí)驗(yàn)從單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)源性炎癥入手，研究偏頭痛的發(fā)病機(jī)制。利血平是一種腎上腺素能阻斷劑，能消耗周圍交感神經(jīng)的去甲腎上腺素，從而使血管擴(kuò)張；同時(shí)消耗腦內(nèi)的兒茶酚胺和5-HT，從而產(chǎn)生偏頭痛樣癥狀。因此，利血平致偏頭痛大鼠模型是一種可行的模型[10]。

5-HT代謝紊亂是導(dǎo)致偏頭痛的關(guān)鍵物質(zhì)，在偏頭痛的整個(gè)病理過程中起著重要作用[11-12]。目前許多臨床治療藥物通過干預(yù)5-HT遞質(zhì)代謝，預(yù)防或改善偏頭痛癥狀。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清腦止痛膠囊能顯著提高利血平致偏頭痛大鼠中腦及血漿的5-HT含量，改善緩解偏頭痛癥狀。

NF-κB靜息狀態(tài)下存在于胞漿，激活后能迅速轉(zhuǎn)移到胞核，可調(diào)控免疫相關(guān)分子等多種基因的表達(dá)，從而參與許多炎癥因子的調(diào)控。NF-κB在胞漿中一般為p65-p50二聚體形式，與抑制因子IκB結(jié)合呈非激活狀態(tài)，一些內(nèi)外刺激因素導(dǎo)致IκB發(fā)生磷酸化解離，NF-κB激活進(jìn)入胞核，特異性調(diào)控炎癥和應(yīng)激相關(guān)基因，進(jìn)而增強(qiáng)如TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-2、IL-6等的轉(zhuǎn)錄，最終參與炎癥反應(yīng)的病理生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠偏頭痛模型中，NF-κB在三叉神經(jīng)分布的硬腦膜及三叉神經(jīng)尾核處表達(dá)顯著升高，參與炎癥反應(yīng)，從而加劇偏頭痛的癥狀[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利血平致偏頭痛大鼠中腦和血漿的NF-κB表達(dá)增加，清腦止痛膠囊可降低NF-κB的表達(dá)。

COX-2被稱為“炎癥反應(yīng)基因”，正常生理狀態(tài)表達(dá)量較少，受到相關(guān)刺激后迅速合成，與炎癥病理生理過程密切相關(guān)。研究表明，NF-κB能誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)參與慢性疼痛過程[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利血平致偏頭痛大鼠中腦和血漿中COX-2表達(dá)增加，清腦止痛膠囊可降低COX-2表達(dá)。此外，PGE2是COX-2的催化產(chǎn)物之一，參與炎癥介導(dǎo)，能促進(jìn)炎癥相關(guān)反應(yīng)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛癥狀患者的唾液和血液中PGE2含量顯著升高[15]。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，利血平致偏頭痛大鼠中腦和血漿PGE2表達(dá)增加，清腦止痛膠囊可降低PGE2表達(dá)。

細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α是體內(nèi)重要的炎性介質(zhì)，腦內(nèi)由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞合成分泌，且兩者均能增強(qiáng)機(jī)體痛覺敏感性，從而參與神經(jīng)源性疼痛。研究表明，偏頭痛患者腦脊液和血漿IL-1β、TNF-α水平均升高[16-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利血平致偏頭痛大鼠中腦及血漿IL-1β、TNF-α表達(dá)增加，清腦止痛膠囊可降低IL-1β、TNF-α表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，清腦止痛膠囊能使利血平致偏頭痛模型大鼠中腦或血漿中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT等水平升高，使神經(jīng)源性炎癥相關(guān)炎癥因子NF-κB、COX-2、PGE2、IL-1β、TNF-α等水平降低，從而對(duì)偏頭痛起到預(yù)防治療作用。

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Effects of QNZTJN on migraine rats induced by reserpine

DUANHao-bo,BAOXue-ying,HUYang,etal.

(CollegeofClinicalMedicine,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To detection the effects of QNZTJN on migraine rat model induced by reserpine.Methods Totally 90 Wistar rats (males) were randomly divided into normal group，model group，ZTW positive group (0.006 g/kg)，QNZTJN high dose group (1.4 g/kg)，QNZTJN medium dose group (0.75 g/kg)，QNZTJN low dose group (0.35 g/kg).The migraine model rats were induced by subcutaneous injection 0.7mg/kg reserpine to observe the forelimb scratching frequency and the effects of different concentrations of QNZTJN on the level of NF-κB，COX-2，5-HT，PGE2，TNF-α and IL-1β in the midbrain tissue and plasma.Results Compared with the normal group，the forelimb scratching frequency were increased significantly in model group (P<0.01).The contents of COX-2 and NF-κB in midbrain tissue were increased significantly (P<0.01).The contents of PGE2，TNF-α and IL-1β were increased，on the contrary the contents of 5-HT was decreased in both midbrain tissue and plasma (P<0.05，P<0.01).Compared with model group，QNZTJN medium and high dose significantly decreased the forelimb scratching frequency of rats (P<0.05，P<0.01).The contents of COX-2 and NF-κB in midbrain tissue were decreased significantly (P<0.05，P<0.01).The contents of PGE2，TNF-α and IL-1β were decreased，while the contents of 5-HT was increased in both midbrain tissue and plasma (P<0.05，P<0.01).Conclusion The QNZTJN can relieve migraine attacks induced by reserpine，which may be related to regulating the release of monoamine neurotransmitters and neurogenic inflammation.

QNZTJN; reserpine; migraine; monoamine neurotransmitters; neurogenic inflammation

吉林省科技廳項(xiàng)目基金支持(20140310001YY)

1007-4287(2017)08-1415-05

R742

A

段浩博(1995-)，男，在讀醫(yī)學(xué)本科生，主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥理學(xué)研究。

2016-04-10)

*通訊作者