趙珍東 夏 黎 張現濤 方春生 馬建榮 汪小根

(廣東食品藥品職業(yè)學院中藥學院，廣東 廣州 510520)

銀杏葉內酯N對PC12細胞凋亡的保護作用

趙珍東 夏 黎 張現濤1方春生 馬建榮 汪小根

(廣東食品藥品職業(yè)學院中藥學院，廣東 廣州 510520)

目的 探討銀杏內酯N對過氧化氫(H2O2)誘導的PC12 細胞凋亡的保護作用。方法 用H2O2誘導PC12細胞損傷，刺激其凋亡，給予不同劑量的受試藥物干預。用MTT法檢測細胞存活率；用吖啶橙染色檢測銀杏內酯N對PC12細胞凋亡的作用；用流式細胞術檢測銀杏內酯N對PC12細胞活性氧(ROS)的影響，熒光定量RT- PCR法、Western印跡法分別檢測Bcl- 2、Bax mRNA和相應蛋白的表達。結果 銀杏內酯N可對抗H2O2誘導的PC12損傷，提高存活率和抑制凋亡，降低PC12細胞ROS水平，與模型組比較均有顯著差異(P<0.05)；Bcl- 2 蛋白及mRNA 表達量升高，而Bax mRNA和Bax蛋白及表達量降低，與模型組比較均有顯著差異(P<0.05)，且呈一定的量效關系。結論 銀杏內酯N可對抗H2O2的神經毒性，其機制與調節(jié)凋亡相關基因及蛋白的表達有關。

銀杏內酯N；PC12細胞；過氧化氫；凋亡

銀杏葉提取物具有神經保護、改善認知功能，擴張血管，改善微循環(huán)，抗血小活化因子，抗氧化，抗細胞凋亡等作用，能保護腦缺血損傷，對老年性癡呆具有防治作用〔1～4〕，其活性成分主要有黃酮類、萜內酯類等，其中萜內酯類——銀杏內酯是銀杏葉提取物中的主要活性成分之一。銀杏總內酯中目前研究較多的是銀杏內酯B(GB)，具有抗神經損傷、抗腦缺血等作用。本課題組從銀杏粗提物中分離得到新化合物銀杏內酯N(GN)，結構類似GB，水溶性優(yōu)于GB，其藥理活性可能比GB更強〔5，6〕。為了探討GN對神經細胞凋亡的保護作用，本研究擬以大鼠嗜鉻細胞瘤細胞株(PC12)為研究對象，用過氧化氫(H2O2)誘導PC12 細胞凋亡，用吖啶橙染色觀察藥物抗細胞凋亡作用，流式細胞儀測定 PC12 細胞內活性氧(ROS)濃度，熒光定量RT- PCR法及Western印跡法檢測凋亡相關基因及蛋白的表達，以探討其抗凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試藥試劑與儀器 GN(自制，純度為97%〔7〕)、GB(四川維克奇生物科技公司，批號：20140610)，用二甲基亞砜配制成10 mmol/L的貯存液，均置于-20℃保存。實驗前用1640完全培養(yǎng)基稀釋至所需不同濃度。四甲基偶氮唑藍(MTT)、吖啶橙染色試劑盒，購自北京斯百匯生物科技有限責任公司；ROS檢測試劑盒(DCFH- DA，2′，7′- 二氯熒光黃雙乙酸鹽)，購自上海碧云天生物技術研究所；熒光定量RT- PCR檢測試劑盒，購自TAKARA公司；Bcl- 2、Bax 和β- actin 抗體，購自Bioworld 公司；胎牛血清、馬血清購自杭州四季青公司；1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司；其他試劑均為分析純。多功能酶標儀(MK3型)、高速臺式冷凍離心機(CT14RD)、超凈工作臺(MSC1.2)、CO2培養(yǎng)箱(Model 311)，美國Thermo Forma公司；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡，德國萊卡公司；流式細胞儀(Epics- XL)，美國Beckman公司；熒光定量PCR儀LightCycler?480 Ⅱ，Roche公司；垂直凝膠電泳、電轉系統(tǒng)，美國Bio- Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) PC12 細胞株，半分化，引自中山大學實驗動物中心。細胞復蘇后，加入含10%的馬血清，5%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。傳3～4代待細胞生長穩(wěn)定后開始實驗。

1.2.2 實驗分組 將傳3～4代 PC12 細胞以104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，細胞貼壁過夜。實驗分為6組：正常組(完全培養(yǎng)基中正常培養(yǎng)，24 h后換培養(yǎng)液培養(yǎng))、模型組(細胞培養(yǎng)24 h后與0.2 mmol/L H2O2共培養(yǎng)24 h)、GN低、中、高劑量處理組(細胞正常培養(yǎng)24 h后分別加入終濃度為2、4、8 μmol/L的 GN 2 h后，加入0.2 mmol/L H2O2作用24 h，GB終濃度為10 μmol/L)。

1.2.3 細胞存活率檢測 將PC12細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設5個復孔，并設空白孔(不加細胞和藥物)。24 h后，正常組加入100 μl新完全培養(yǎng)基，模型組加入含有H2O2的RPMI1640培養(yǎng)基，GN低、中、高劑量組在H2O2加入前2 h分別加入相應濃度的GN或GB，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實驗結束后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)孵育4 h，去上清加入DMSO 150 μl/孔，水平搖床振蕩，酶標儀490 nm波長讀取各孔吸光度值，讀取OD值。根據公式：細胞存活率=(實驗組OD值-空白對照OD值)/(對照組OD-空白對照組OD值)×100%。

1.2.4 形態(tài)學觀察 將PC12細胞按4×105個接種于12孔板，培養(yǎng)24 h后，按實驗分組干預后，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.5 吖啶橙染色 將PC12細胞按4×105個接種于12孔板，培養(yǎng)24 h后，按實驗分組給以不同處理后，每孔加入10 μl 吖啶橙染色液(30 mg/L)，避光染5 min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 細胞內ROS檢測 將PC12細胞約8×105個接種于6孔培養(yǎng)板，處理同前，培養(yǎng)12 h后，胰酶消化，離心收集細胞，加入新鮮配制含有DCFH- DA(1∶1 000)的無血清培養(yǎng)基中，混勻后37℃避光孵育30 min，5 min間隔顛倒混勻，無血清培養(yǎng)基洗滌，上流式細胞儀檢測。

1.2.7 熒光定量PCR法檢查Bcl- 2、Bax mRNA的表達 實驗結束后，收集各組細胞，按照Trizol一步法抽取細胞總RNA，定量后取2 μg總RNA逆轉錄成cDNA，反轉錄反應條件：37℃15 min，85℃ 5 s。以β- actin為內參照，上下游引物由生工生物工程(上海)公司合成。Bcl- 2 上游引物：5′- CCTTGTCAGCACTTGGAATG- 3′；下游引物：5′- CTTCATTCTTCAACTTGGGCG- 3′；Bax上游引物：5′- TGCTACAGGGTTTCATCCAGG- 3′；下游引物：5′- TCTGCCGTTGAAGTTACCCAG- 3′；β- actin上游引物：5′- AGAGGGAAATCGTGCGTGAC- 3′；下游引物：5′- TGGCACTTTTCTACTGGGTC- 3′。熒光定量PCR 擴增：擴增反應條件如下，預變性：95℃ 30 s；40個循環(huán)(95℃ 5 s，60℃ 30 s)；解離：95 ℃ 15 s，60℃ 60 s；溶解曲線：65℃ 30 s。溫度設置：起始溫度為65℃，結束溫度設為95℃，溫度變化設為0.5℃，重復次數61。熒光定量PCR反應結束后，采用ΔΔCt法對結果進行統(tǒng)計分析。其中ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值，ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt，基因相對表達量=2-ΔΔCt。

1.2.8 Western印跡檢測Bcl- 2、Bax蛋白表達的變化 實驗結束后，冰浴裂解細胞，高速4℃離心20 min，收集上清。經Bio- Rad 法進行蛋白定量后，電泳，轉膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃一抗(1∶1 000)過夜。PBST洗膜3次，每次10 min。加二抗稀釋液(1∶5 000)孵育2 h，PBST 洗滌3次，每次10 min。加入ECL試劑，曝光，顯影，定影，掃描拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 GN對H2O2誘導PC12細胞損傷存活率的影響 根據預實驗的結果，選取0.2 mmol/L的H2O2濃度作為損傷濃度。0.2 mmol/L H2O2作用于PC12細胞24 h后，模型組細胞損傷明顯，存活率下降〔(52.07±2.72)%〕，與正常組相比差異顯著〔(99.91±1.0)%,P<0.01〕。給予低、中、高劑量GN干預后，細胞存活率明顯上升〔(62.86±1.95)%、(73.45±4.75)%、(80.16±3.19)%〕，與模型組有顯著差異(P<0.05或P<0.01)。這表明GN能抑制H2O2導致的細胞損傷，GN在2～8 μmol/L劑量范圍內，其保護作用呈量效關系，活性比GB〔(78.56±2.48)%〕強。

2.2 GN對H2O2誘導的PC12細胞損傷形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察，H2O2作用PC12細胞24 h后，可見細胞損傷明顯，細胞變圓，細胞間連接稀疏，少部分細胞脫落。給予不同劑量的GN后，細胞損傷減輕，與模型組相比，貼壁細胞數目增多，隨著GN劑量的增加，細胞間連接越緊密，可見具有抗損傷作用。見圖1。

圖1 GN對H2O2致PC12損傷形態(tài)的影響(×200)

2.3 GN對H2O2誘導的PC12細胞凋亡的作用 鏡下可見，細胞經吖啶橙染色后，正常組細胞形態(tài)規(guī)則，綠色均勻，細胞間連接緊密；模型組可見細胞變圓，部分細胞核染色質濃染，碎裂，脫落；給予GN不同劑量干預后，出現核濃染的細胞少，細胞形態(tài)大部分正常，細胞損傷程度比模型組明顯減輕。見圖2。

圖2 GN對H2O2誘導PC12凋亡的影響(吖啶橙熒光染色，×200)

2.4 GN對H2O2誘導PC12細胞ROS升高的影響 正常組平均熒光強度值為(0.85±0.20)，模型組平均熒光強度值為(5.05±0.47)，與正常組比較，具有顯著差異(P<0.01)，顯示細胞內ROS水平升高顯著；給予低、中、高劑量的GN處理后，其平均熒光強度值則分別為(4.06±0.18)、(3.18±0.20)和(2.13±0.25)，與模型組比較，均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。而10 μmol/L的GB組ROS熒光強度值為(2.09±0.16)，表明GN可拮抗H2O2刺激的PC12損傷時ROS水平的升高。

2.5 GN對H2O2刺激PC12細胞Bcl- 2、Bax mRNA表達的影響 H2O2誘導PC12細胞Bcl- 2 mRNA表達降低(P<0.01)，Bax mRNA表達升高(P<0.01)，給予不同劑量的GN后，可逆轉上述基因的表達?？梢姡珿N可拮抗H2O2誘導的PC12細胞凋亡。見表1。

2.6 GN對H2O2刺激PCl2細胞Bcl- 2、Bax蛋白表達的影響 H2O2作用PC12細胞24 h后，細胞Bcl- 2表達下降(P<0.01)，而Bax蛋白表達增加(P<0.01)。給予不同劑量的GN干預后，可逆轉上述蛋白的表達(P<0.05或P<0.01)。這表明GN可抑制H2O2誘導的PC12細胞的凋亡。見圖3，表2。

表1 GN對H2O2刺激PC12細胞Bcl- 2、Bax mRNA表達的影響

與模型組比較：1)P<0.05,2)P<0.01，下表同

1～6：正常組、模型組、低劑量GN組、中劑量GN組、高劑量GN組、GB組圖3 GN對H2O2刺激PC12細胞Bcl- 2和Bax蛋白表達的影響

組別Bcl-2/β-actinBax/β-actin正常組1.289±0.0642)1.037±0.0652)模型組0.808±0.0771.319±0.091低劑量GN組1.139±0.0942)1.143±0.0361)中劑量GN組1.065±0.0582)1.066±0.0612)高劑量GN組1.114±0.0982)1.078±0.0842)GB組0.96±0.0601)1.012±0.0792)

3 討 論

PC12 細胞來源于腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系，具有神經細胞的一般特征，可傳代，有利于量化評估藥效，因此常用作神經生理和神經藥理學研究，是比較理想的細胞模型〔8〕。H2O2作為機體自由基產生的重要環(huán)節(jié)，在細胞培養(yǎng)體系中，可進一步分解為羥自由基和氧自由基，而自由基可直接攻擊細胞膜結構，導致細胞能量代謝出現障礙、損傷膜的離子依賴性 ATP 酶及谷氨酸載體，導致細胞凋亡〔9〕。研究證實，ROS包括超氧離子、羥自由基等，是細胞內氧化應激的重要因素之一。ROS 可通過氧化損傷，導致DNA、膜脂和蛋白質等多種生物分子損傷，細胞功能障礙，甚至誘導細胞凋亡或壞死〔10，11〕。H2O2參與了神經退行性疾病的發(fā)病過程，能使細胞內活性氧成分堆積，引起神經細胞凋亡。檢測 ROS 的生成水平，可直接反映細胞內氧化應激的水平〔12〕。細胞凋亡過程中，Bcl 家族是體內重要的凋亡調控基因，包括抗凋亡基因和促凋亡基因兩大類。其中抗凋亡基因Bcl- 2是目前最受關注的凋亡相關基因之一，通過編碼 Bcl- 2 蛋白而發(fā)揮抗凋亡作用。促凋亡基因如 Bax，通過與 Bcl- 2 形成異源二聚體來阻斷 Bcl- 2 的抗凋亡作用，從而啟動細胞凋亡程序。此外，Bcl- 2 還具有神經保護功能，可以保護神經細胞免受氧自由基以及脂質過氧化產物的損傷〔13，14〕。

本實驗顯示不同劑量的GN能抑制H2O2誘導的PC12細胞損傷和凋亡，從基因、蛋白水平上調Bcl- 2，下調 Bax表達水平，從而增高Bcl- 2/Bax兩蛋白之間的比值，抑制細胞凋亡，可能是GN 對抗因H2O2誘導的PC12細胞損傷的機制之一。

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〔2016- 06- 19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

廣東省中醫(yī)藥局項目(No.20121106)；廣東食品藥品職業(yè)學院院級項目(No.2011YZ001)

汪小根(1970- )，男，博士，教授，主要從事中藥制劑及藥物作用機制研究。

趙珍東(1976- )，男，博士，副教授，主要從事中藥抗神經損傷、抗腫瘤作用及機制研究。

R285

A

1005- 9202(2017)15- 3656- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.007

1 廣東省中藥研究所