卓 越 梁 冬

(海南省農(nóng)墾三亞醫(yī)院，海南 三亞 572000)

肺癌患者癌旁組織中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變相關(guān)蛋白表達(dá)對(duì)其預(yù)后的影響

卓 越 梁 冬

(海南省農(nóng)墾三亞醫(yī)院，海南 三亞 572000)

目的 探討肺癌患者癌旁組織中上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)對(duì)其預(yù)后的影響。方法 采用免疫組化法檢測(cè)81例肺癌患者癌組織和配對(duì)癌旁組織中的EMT相關(guān)蛋白(E- cadherin、β- catenin和Vimentin)，觀察E- cadherin、β- catenin和Vimentin在癌組織和癌旁組織中表達(dá)差異，并比較癌旁組織中E- cadherin、β- catenin和Vimentin表達(dá)差異下患者的預(yù)后情況，以患者的病理資料和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)差異納入Cox回歸模型，預(yù)后因子采用多因素分析。結(jié)果 ①肺癌組織中E- cadherin和β- catenin陽性表達(dá)率(49.38%和14.81%)明顯低于癌旁組織(72.84%和51.85%)，而Vimentin陽性表達(dá)率(55.56%)明顯高于癌旁組織(23.46%)(均P<0.05)。②癌旁組織中E- cadherin陽性、β- catenin陽性和Vimentin陰性患者預(yù)后較E- cadherin陰性、β- catenin陰性和Vimentin陽性患者預(yù)后好(P<0.05)。③Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)臨床分期、腫瘤分期、EMT- L和腫瘤分化程度是獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后因子。結(jié)論 EMT相關(guān)蛋白在癌旁組織中的表達(dá)異常對(duì)肺癌患者的預(yù)后有一定的影響，在癌癥早期階段及癌旁組織未發(fā)生明顯組織形態(tài)學(xué)異常時(shí)，EMT相關(guān)蛋白的檢測(cè)對(duì)患者的預(yù)后情況分析具有一定的參考價(jià)值。

肺癌；癌旁組織；E- cadherin；β- catenin；Vimentin

調(diào)查顯示2008年我國(guó)肺癌發(fā)病率約為54.75/10萬，死亡率約為46.07/10萬，占全部惡性腫瘤死亡總數(shù)的24.95%〔1〕。肺癌的發(fā)病率和死亡率在全部腫瘤中增長(zhǎng)最快〔2〕，屬于高致病性疾病，并增加了醫(yī)療負(fù)擔(dān)〔3〕。目前我國(guó)主要通過影像學(xué)、CT引導(dǎo)肺穿刺活檢及支氣管鏡等診斷肺癌，但在確診時(shí)75%患者都為晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移〔4〕。近年來診治技術(shù)不斷提高，但肺癌患者的生存率卻并未得到明顯提高，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的重要原因〔5〕，了解患者的預(yù)后有及其重要的意義。上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)是指細(xì)胞由上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，以上皮標(biāo)志物E- cadlherin下降和間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin上升為主要生物學(xué)特征，是一種基本的生理病理現(xiàn)象，是多數(shù)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移早期的重要過程〔6〕。目前關(guān)于肺癌癌旁組織中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)差異對(duì)患者的預(yù)后有無影響并無明確定義。本研究探討肺癌患者癌旁組織中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況對(duì)其預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取海南省農(nóng)墾三亞醫(yī)院2012年12月年至2014年1月在腫瘤科確診的81例肺癌患者的癌組織、癌旁組織(距癌病灶距離≥5 cm)。男38例，女43例；年齡35～80(中位41)歲。TNM分期Ⅰ期25例、Ⅱ期19例、Ⅲ期23例、Ⅳ期14例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者術(shù)前未經(jīng)過放療和(或)化療；②經(jīng)過病理學(xué)確診為肺小細(xì)胞癌；③臨床資料完整；④組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋切片HE染色評(píng)估確定腫瘤細(xì)胞含量>50%；⑤標(biāo)本取材過程中RNA完整評(píng)分>6.0；⑥簽署知情同意書及獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無明確病理診斷；②沒有完整的隨訪資料；③預(yù)計(jì)生存期<6個(gè)月；④合并心、肝、腎和造血系統(tǒng)疾?。虎萑焉锲诤途窦膊』颊?。

1.2 試劑及儀器 E- cadherin兔、β- catenin鼠抗人單克隆抗體、Vimentin鼠抗人單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；RT- PCR試劑劑盒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Gibco公司)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB，北京華越洋生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS Thermo Fisher Scientific)；二甲苯(河南八方化工原料銷售有限公司)；無水乙醇(蘇州市晶協(xié)高新電子材料有限公司)；切片石蠟(廊坊乾岡塑料制品有限公司)。脫水機(jī)(泰州海鷗洗滌機(jī)械有限公司)；包埋機(jī)(湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司)；切片機(jī)(無錫雙盛石化裝備有限公司)；切片漂烘溫控箱(中科美其北京科技有限公司)；全自動(dòng)高壓鍋(日本SANYO公司)。

1.3 組織芯片制作與免疫組化染色 將81例患者癌組織和癌旁組織標(biāo)本的HE切片，按照對(duì)應(yīng)順序做好記號(hào)，將切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，以自來水沖洗1 min，清除內(nèi)源性過氧化物酶，置于高壓鍋內(nèi)高溫高壓修復(fù)抗原。滴加稀釋后的一抗，在37℃室溫下放置2～3 h，以PBS清洗，清洗后滴加二抗，37℃室溫下放置20 min后以PBS清洗。每張芯片加入100 μl的DAB顯色，用蘇木素復(fù)染，經(jīng)過梯度乙醇脫水、中性樹膠封片后鏡檢。依據(jù)EnVision試劑盒說明書按照免疫組織化學(xué)染色步驟進(jìn)行。

1.4 免疫組化結(jié)果判斷 染色強(qiáng)度：細(xì)胞中無著色計(jì)為1分，淡棕色為2分，棕黃色為3分，深棕色為4分；陽性細(xì)胞比例評(píng)分：陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)≤10%計(jì)1分，11%～25%計(jì)2分，26%～50%計(jì)3分，≥51%計(jì)4分。將染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例積分相乘，≤2分者為陰性，>2分者為陽性。

1.5 隨訪 出院患者以電話或門診方式隨訪。隨訪5～36個(gè)月。中位隨訪時(shí)間為24個(gè)月。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)，Log- rank檢驗(yàn)，Cox回歸模型分析。

2 結(jié) 果

2.1 EMT相關(guān)蛋白在癌旁組織和癌組織中的表達(dá) E- cadherin與β- catenin蛋白陽性表達(dá)在細(xì)胞膜，Vimentin蛋白陽性表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)。肺癌組織標(biāo)本中E- cadherin和β- catenin陽性表達(dá)為40例(49.38%)和12例(14.81%)，較癌旁組織表達(dá)明顯減少〔59例(72.84%)，42例(51.85%)，χ2=9.377,P=0.002;χ2=25.000,P=0.000〕；Vimentin在癌組織和癌旁組織中陽性表達(dá)分別為45例(55.56%)、19例(23.46%)，癌組織中陽性表達(dá)多于癌旁組織(χ2=12.393,P=0.000)。見圖1。

2.2 EMT相關(guān)蛋白在癌旁組織中表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 81例患者平均生存時(shí)間為24個(gè)月。根據(jù)Kaplan- Meier生存分析結(jié)果顯示：在癌旁組織中E- cadherin陽性、β- catenin陽性和Vimentin陰性患者預(yù)后較E- cadherin陰性、β- catenin陰性和Vimentin陽性患者預(yù)后好(P=0.000、P=0.001和P=0.041)。見圖2。

2.3 預(yù)后影響因素分析 以癌旁組織中E- cadherin、β- catenin和Vimentin復(fù)合體的表達(dá)進(jìn)行分類，EMT- L1為1～2種表達(dá)異常，EMT- L2為3種表達(dá)異常。按照患者的年齡、性別、腫瘤直徑、臨床分期、腫瘤分化程度和EMT蛋白表達(dá)進(jìn)行Cox回歸多元素分析。結(jié)果顯示：臨床分期、腫瘤分期、EMT- L和腫瘤分化程度是獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后因子，見表1。

圖1 EMT相關(guān)蛋白在癌旁組織及癌組織中的表達(dá)(DAB，×400)

圖2 E- cadherin、β- catenin及Vimentin表達(dá)差異患者的生存情況對(duì)比

病理學(xué)因素βSEWaldχ2值P值Exp(B)95.0%CI臨床分期0.7750.2757.9410.0052.1701.266～3.720腫瘤分期0.7430.2807.0330.0082.1021.214～3.639EMT-L1.5670.5258.9180.0034.7931.714～13.405腫瘤分化程度0.9300.4075.2340.0222.5351.143～5.623

3 討 論

EMT是由上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，以E- cadherin下降和Vimentin上升為生物學(xué)特征〔7〕。EMT發(fā)生與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力相關(guān)〔8〕，是細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要內(nèi)在機(jī)制〔9～11〕。癌旁組織是指距離癌癥病灶2 cm的周圍組織，其組織在顯微鏡下細(xì)胞類型及形態(tài)呈現(xiàn)正常狀態(tài)。但目前關(guān)于癌旁組織的定義并不明確，多數(shù)癌組織周圍1～2 cm為癌組織定于較廣，但食道癌和頭頸癌中，癌癥組織外7 cm處也可檢測(cè)到分子水平的異常，因此在檢測(cè)癌組織中相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)同時(shí)，對(duì)癌旁組織的檢測(cè)也同樣具有重要的意義。目前關(guān)于EMT研究都是針對(duì)癌細(xì)胞較多，晚期腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)研究也有了一定的發(fā)展，而關(guān)于癌癥早期階段及癌旁組織未發(fā)生明顯組織形態(tài)學(xué)異常時(shí)，EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)的差異及意義并未出現(xiàn)相關(guān)研究。本研究顯示肺癌組織標(biāo)本中E- cadherin、β- catenin陽性表達(dá)率低于癌旁組織，而Vimentin在癌組織中表達(dá)多于癌旁組織。且與相關(guān)研究〔12〕相似，EMT相關(guān)蛋白E- cadherin、β- catenin和Vimentin在癌旁組織中的異常表達(dá)對(duì)患者的預(yù)后也有重要的影響，臨床分期、腫瘤分期、EMT- L和腫瘤分化程度是獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后因子。由此可見，臨床上針對(duì)肺癌患者的預(yù)后在注意臨床分期、腫瘤分期和分化程度外，癌旁組織中的EMT相關(guān)蛋白表達(dá)異常也值得引起重視。但由于本次研究存在樣本量較少、隨訪期較短的不足，且相關(guān)學(xué)者〔13〕認(rèn)為腫瘤的預(yù)后與遺傳學(xué)和腫瘤微環(huán)境相關(guān)，主張EMT并非腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過程之一，因此具體的作用機(jī)制及預(yù)后價(jià)值還需進(jìn)行大量的研究論證。

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〔2016- 05- 08修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

2014年海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.814387)

梁 冬(1973- )，女，主任醫(yī)師，博士后，碩士生導(dǎo)師，主要從事呼吸內(nèi)科及肺癌臨床研究。

卓 越(1979- )，男，主治醫(yī)師，主要從事肺癌的臨床研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3685- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.018