張聰，楊強(qiáng)，樊麗博，張繼穎，張曉會

(1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心/洛陽惠中獸藥有限公司，洛陽 471000；2.貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽 550004)

HPLC-ELSD法測定五加芪粉中黃芪甲苷的含量

張聰1，楊強(qiáng)2，樊麗博1，張繼穎1，張曉會1

(1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心/洛陽惠中獸藥有限公司，洛陽 471000；2.貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽 550004)

為了建立五加芪粉中黃芪甲苷的含量測定方法，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(HPLC-ELSD)法，色譜柱為Kromasil 100-5C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水35∶65，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；采用ELSD檢測器，漂移管溫度為60 ℃，噴霧器溫度為36 ℃，氮?dú)鈮毫?5 psi。結(jié)果顯示黃芪甲苷在1.524～10.16 μg(r=0.9991)之間的對數(shù)值與峰面積的對數(shù)值呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率為99.4%，RSD=4.6%(n=6)。本方法重復(fù)性良好，能準(zhǔn)確測定五加芪粉中黃芪甲苷的含量，對其質(zhì)量進(jìn)行控制。

五加芪粉；黃芪甲苷；HPLC-ELSD法

五加芪粉具有補(bǔ)中益氣、扶正祛邪的功效，用于提高禽的機(jī)體免疫力，配合疫苗使用提高疫苗免疫效果。五加芪粉處方由黃芪和刺五加兩味藥材組成，其中黃芪為君藥。黃芪主要化學(xué)成分為多糖類[1]、皂苷類[2]及黃酮類[3]等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃芪具有顯著的免疫增強(qiáng)作用[4-5]，可提高畜禽免疫力，廣泛用于現(xiàn)代化畜禽養(yǎng)殖。黃芪甲苷做為黃芪提升免疫的主要活性成分[6]，是控制黃芪及其制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)，因此將其做為控制五加芪粉質(zhì)量的指標(biāo)。本文研究建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)測定五加芪粉中黃芪甲苷的含量，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜系統(tǒng)(Waters e2695型HPLC；2424型ELSD；Empower 2色譜工作站軟件)；Kromasil 100-5C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，瑞典AKZO NOBLE公司；AB265-S電子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；HS3120型超聲波清洗器；甲醇、正丁醇、氨水為分析純；乙腈為色譜純；水為超純水。

1.2 試藥 黃芪甲苷對照品，含量：100%，批號：110781-200613，中國食品藥品檢定研究院；五加芪粉，規(guī)格：1 g相當(dāng)于3.3 g生藥，批號：20120201、20120202、20120203，由洛陽惠中獸藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為Kromasil 100-5C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水(35∶65)；流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；ELSD檢測器：漂移管溫度為60 ℃，噴霧器溫度為36 ℃，氮?dú)鈮毫?5 psi。理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4000。

2.2 溶液配制

2.2.1 黃芪甲苷對照品溶液制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取供試品2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50 mL甲醇超聲提取30 min，抽濾，濾渣連同濾紙放回錐形瓶中，再加50 mL甲醇超聲提取30 min，抽濾，用30 mL甲醇洗滌濾渣和濾紙，合并濾液，減壓回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次約40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度、搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液制備 取制備的缺黃芪陰性樣品適量(相當(dāng)于刺五加1.2 g)，置具塞錐形瓶中，照2.2.2項下操作制備成陰性對照溶液。

2.3 測定法 分別精密吸取對照品溶液5、15 μL，供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程計算，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 照上述2.1項下色譜條件，分別精密吸取對照品溶液15 μL、供試品溶液10 μL、陰性對照溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，陰性對照溶液在黃芪甲苷對照品相應(yīng)的保留時間處無干擾，見圖1。

2.4.2 線性 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解制成濃度為0.5080 mg/mL的對照品溶液，依次精密吸取3、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，以黃芪甲苷峰面積的對數(shù)值(y)為縱坐標(biāo)、黃芪甲苷進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=1.4828x+5.312(r=0.9991)。結(jié)果表明，在1.524～10.16 μg范圍內(nèi)，黃芪甲苷峰面積對數(shù)值與進(jìn)樣量對數(shù)值線性關(guān)系良好，結(jié)果見圖2。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得黃芪甲苷峰面積RSD為0.8%，結(jié)果表明，本方法精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號的供試品(批號：20120201)2 g，按上述2.2.2項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，測得黃芪甲苷的平均含量為2.7 mg·g-1，RSD為1.6%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，測得黃芪甲苷含量的RSD為2.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品(批號：20120201)1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.5380 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液5 mL，平行操作6份，按2.2.2項下方法制備加樣回收供試品溶液，測定并計算加樣回收率，測得平均回收率為99.4%，RSD為4.6%，表明方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表1。

1.黃芪甲苷對照品 2.供試品 3.陰性對照1. Reference Substance of Astragaloside 2. Test sample 3. negative control圖1 專屬性考察色譜圖Fig 1 The chromatogram of Specific inspection

圖2 黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 The standard curve of Astragaloside

編號No.樣品稱量/gAmountofsample對照加入量/mgAmountofreferencesubstance測得總量/mgAmountofmesured回收率/%Recovery平均值/%meanRSD/%11.01042.695.2695.7320.97092.695.1495.2530.96722.695.1395.1541.04962.695.60104.4551.02642.695.47101.7861.01982.695.51104.1799.44.6

2.4.7 樣品測定 取3批供試品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液并測定，計算黃芪甲苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果Tab 2 The results of sample content determination

3 討 論

3.1 黃芪甲苷含量測定方法的選擇 文獻(xiàn)報道的黃芪甲苷含量測定方法有熒光分光光度法[7]、薄層色譜掃描法[8]、高效液相色譜法[9]等，其中高效液相色譜法準(zhǔn)確、快速、靈敏度高，且使用蒸發(fā)光散射檢測器可解決黃芪甲苷紫外吸收弱的缺點，是黃芪甲苷含量測定的常用方法。

3.2 提取溶劑和提取方法的選擇 五加芪粉為黃芪和刺五加經(jīng)水提、純化、噴霧干燥制成的粉劑，含有較多的多糖類成分，為了充分提取其中的黃芪甲苷，參考同類制劑的供試品溶液制備方法[10-11]，選擇甲醇作為提取溶劑，分別對熱回流法和超聲提取法進(jìn)行對比，結(jié)果表明兩種方法提取效果相當(dāng)，考慮超聲提取較為簡便，因此選擇超聲提取法。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，超聲提取1次不能將黃芪甲苷提取完全，提取2次和提取3次結(jié)果差別不大，因此選擇超聲提取2次，并且最后用甲醇洗滌殘渣，以保證黃芪甲苷充分轉(zhuǎn)移。

3.3 萃取次數(shù)的選擇 參考黃芪藥材中黃芪甲苷的含量測定方法[9]，對正丁醇萃取次數(shù)進(jìn)行了考察，分別進(jìn)行3次、4次、5次萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)萃取4次之后，黃芪甲苷基本完全轉(zhuǎn)移，因此確定采用正丁醇萃取4次。試驗發(fā)現(xiàn)，正丁醇萃取液蒸干后再通過D101型大孔吸附樹脂柱純化，黃芪甲苷的回收率相對較低，而且未經(jīng)大孔吸附樹脂柱純化的樣品在含量測定過程中不受其他雜質(zhì)的影響，因此，確定正丁醇后不再通過大孔吸附樹脂柱純化，直接用甲醇溶解測定。

3.4 色譜條件的考察 參考黃芪藥材中黃芪甲苷的含量測定色譜條件[9]，分別對流動相的比例、柱溫、流速、柱子型號進(jìn)行考察，結(jié)果表明黃芪甲苷的色譜行為受流動相比例影響較大，其他條件對其影響相對較小，綜合系統(tǒng)適用性各指標(biāo)，確定流動相的比例為乙腈-水(35∶65)，此時黃芪甲苷保留時間約7 min，更加適合該產(chǎn)品的檢測。此外，對蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度進(jìn)行了考察，60 ℃、70 ℃、80 ℃條件下黃芪甲苷峰各項指標(biāo)差別不大，因此設(shè)定漂移管溫度為60 ℃。

本研究建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定五加芪粉中黃芪甲苷的含量，在該色譜條件下，黃芪甲苷分離度良好，保留時間適宜，方法學(xué)考察表明該方法專屬性、精密度、重復(fù)性良好，可準(zhǔn)確測定黃芪甲苷的含量，從而有效控制五加芪粉的質(zhì)量。

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(編輯：陳希)

Determination of Astragaloside in Wujiaqi Powder by HPLC-ELSD

ZHANG Cong1, YANG Qiang2, FAN Li-bo1, ZHANG Ji-ying1, ZHANG Xiao-hui1

(1. National Research Center for Veterinary Medicine/Luoyang Huizhong Veterinary Medicine Co., Ltd, Luoyang 471000, China;2. Guizhou Province Institute of Veterinary Drug and Feedstuff, Guiyang 550004, China)

To establish the method for determining of astragaloside in Wujiaqi powder by HPLC-ELSD, C18 column (Kromasil 100-5C18, 150 mm×4.6 mm, 5μm)was used with the mobile phase consisted of acetonitrile-water (35∶65), the flow rate was 1.0 mL/min, column temperature was 30 ℃, Evaporative light scattering detection condition: drift tube temperature was 60 ℃, spray tube temperature was 36 ℃, the nitrogen pressure was 25 psi. The calibration curve was linear at a range of 1.524～10.16 μg for astragaloside (r=0.9991), the average recovery was 99.4% andRSDwas 4.6%(n=6). The method was accurate with a good reproducibility and can be used as a quantitative analysis of astragloside in Wujiaqi powder.

Wujiaqi powder; astragaloside; HPLC-ELSD

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.11

張聰，碩士，從事新獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。E-mail: zhangcong301@163.com

2017-03-29

A

1002-1280 (2017) 08-0062-05

S853.7