李金明，黃凱，李冀，魏麗娟

(河北遠征藥業(yè)有限公司 河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，石家莊 050041)

高效液相色譜法測定二甲基半胱胺截短側(cè)耳素的研究

李金明，黃凱*，李冀，魏麗娟

(河北遠征藥業(yè)有限公司 河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，石家莊 050041)

建立了以高效液相色譜法測定鹽酸沃尼妙林關(guān)鍵中間體二甲基半胱胺截短側(cè)耳素含量的檢測方法，色譜條件為SepaxC18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3 μm)流動相為乙腈-磷酸緩沖液(pH2.5)(V/V=40∶60)， 流速為1 mL/min，檢測波長為205 nm。對該檢測方法進行了系統(tǒng)適用性、線性、精密度、重現(xiàn)性穩(wěn)定性、檢測限、定量限以及回收率的考察，結(jié)果均良好，提示該方法可以用于鹽酸沃尼妙林關(guān)鍵中間體的含量檢測。

高效液相色譜法；鹽酸沃尼妙林中間體；二甲基半胱胺截短側(cè)耳素；含量測定

鹽酸沃尼妙林(ValnemuLin Hydrochloride)屬截短側(cè)耳素類的半合成抗生素，主要用于豬支原體肺炎、豬痢疾、豬結(jié)腸炎和豬回腸炎的治療的動物專用抗生素類藥物，能夠有效的避免人畜的交叉耐藥性，且其具有廣譜、高效、低殘等優(yōu)點[1]。鹽酸沃尼妙林是第一個全歐洲批準(zhǔn)的藥用預(yù)混劑，應(yīng)用非常的廣泛。

鹽酸沃尼妙林是由二甲基半胱胺截短側(cè)耳素與D-纈氨酸鄧鹽合成得到[2]，二甲基半胱胺截短側(cè)耳素的含量以及投料量將會對產(chǎn)品的質(zhì)量造成較大的影響，而目前在國內(nèi)外未發(fā)現(xiàn)對其利用高效液相色譜法檢測的報道[3-4]。本研究旨在通過高效液相色譜法對二甲基半胱胺截短側(cè)耳素的含量進行檢測，從而進一步保證產(chǎn)品鹽酸沃尼妙林的質(zhì)量。

1 材 料

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀，SepaxC18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3 μm)。

1.2 樣品 二甲基半胱胺截短側(cè)耳素為河北遠征藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：20130902、20130910、20130918。二甲基半胱胺截短側(cè)耳素對照品：自制樣品經(jīng)精制，并經(jīng)european pharma-copoeia 對照品標(biāo)定后使用；含量：99.1%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[5-6]流動相：乙腈-磷酸緩沖液(pH2.5)(V/V=40∶60)，磷酸緩沖液(pH2.5)：取0.94 g磷酸氫二鈉和8.7 g磷酸二氫鉀溶于適量水中，并加水至1000 mL，磷酸調(diào)pH至2.5。稀釋液：乙腈-水(50∶50)檢測波長：205 nm；柱溫：45 ℃，流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

2.2 樣品制備 取二甲基半胱胺截短側(cè)耳素40 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加50 %乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1)；另取二甲基半胱胺截短側(cè)耳素對照品50 mg，同法測定(圖2)。

圖1 對照品色譜圖Fig 1 Chromatogram of reference substance

圖2 供試品色譜圖Fig 2 Chromatogram of test sample

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 在此色譜條件下，二甲基半胱胺截短側(cè)耳素峰的理論塔板數(shù)6000以上。

2.4 線性范圍考察 取二甲基半胱胺截短側(cè)耳素精制品約40 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙腈∶水(50∶50)溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取2.0、5.0、10.0 mL分別置50 mL量瓶中，加乙腈∶水(50∶50)稀釋至刻度，搖勻；再精密稱取100 mg、250 mg至50 mL量瓶中，搖勻。量取上述溶液各10 μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，由峰面積(y)對溶液濃度(x)線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：在0.03208～8.006 mg/mL濃度間，本法的線性良好。

表1 線性與范圍及相關(guān)系數(shù)測定結(jié)果Tab 1 Results of linearity and range and correlation coefficients

2.5 精密度、重現(xiàn)性及溶液穩(wěn)定性實驗

2.5.1 精密度試驗 取精制品適量，精密稱定，用流動相溶解并稀釋，制成每1 mL約含二甲基半胱胺截短側(cè)耳素0.8 mg的溶液，搖勻，作為供試溶液。每次進樣10 μL，重復(fù)6次，對應(yīng)峰面積分別是1841.8、1867.4、1824.1、1824.6、1847.2、1851.4，RSD為0.90%，表明本法精密度良好。

2.5.2 重現(xiàn)性考察 取本品，分別精密稱定6份，用流動相溶解并稀釋，制成每1 mL約含二甲基半胱胺截短側(cè)耳素0.8 mg的溶液，搖勻，作為供試溶液。每次進樣10 μL，對應(yīng)含量分別為94.2%、94.4%、94.1%、94.5%、95.0%、94.3%，RSD值為0.34%。結(jié)果表明，本法重現(xiàn)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性考察 分別取二甲基半胱胺截短側(cè)耳素于日內(nèi)(0、2、4、6、8、12 h)測定，考察溶液的穩(wěn)定性，對應(yīng)峰面積分別是1839.8、1850.3、1857.3、1848.8、1811.6、1829.1，RSD為0.91%。結(jié)果表明，二甲基半胱胺截短側(cè)耳素常溫下放置穩(wěn)定，室溫放置12 h，鹽酸沃尼妙林含量幾乎無變化。

2.6 檢測限和定量限的測定 取空白基線一段，測量其噪音峰高，再將供試品溶液稀釋成適當(dāng)濃度，量取10 μL進樣，以信噪比(S/N)為3時的濃度作為最低檢測限濃度，并計算其最低檢測限，經(jīng)檢測，其最低檢出量為0.15 μg/mL。

取空白基線一段，測量其噪音峰高，再將供試品溶液稀釋成適當(dāng)濃度，量取10 μL進樣，以信噪比(S/N)為10時的濃度作為定量測定的最低濃度，經(jīng)檢測，其定量限為0.25 μg/mL。

2.7 回收率試驗 分別精密稱取二甲基半胱胺截短側(cè)耳素對照品，置50 mL量瓶中，用50 %乙腈水溶液稀釋至刻度，搖勻，配成高(960 μg/mL)、中(800 μg/mL)、低(640 μg/mL)三個濃度，按含量測定法進樣，測定結(jié)果依次為31.56、31.89、31.80、41.76、42.30、41.96、47.68、47.86、47.75 mg，計算得二甲基半胱胺截短側(cè)耳素的回收率為99.58%，RSD為0.55%(n=9)。結(jié)果表明，本法回收率效果良好。

3 討論與結(jié)論

在對鹽酸沃尼妙林的關(guān)鍵中間體二甲基半胱胺截短側(cè)耳素的檢測中運用了高效液相色譜法進行檢測，并對其進行了系統(tǒng)適用性實驗、線性范圍、精密度、重現(xiàn)性、檢測限等項目進行了考察，發(fā)現(xiàn)該方法適用性、準(zhǔn)確性、重復(fù)性都能夠滿足質(zhì)量控制的要求，且利用高效液相色譜能夠更加直觀、靈敏度高、適用性廣泛。

通過本方法，對本公司生產(chǎn)的20130409、20130418、20130424三批中試二甲基半胱胺截短側(cè)耳素進行了含量測定，其含量(以無水物計%)分別為98.38%、98.64%、98.12%。

綜上所述，運用該色譜條件對鹽酸沃尼妙林的關(guān)鍵中間體二甲基半胱胺截短側(cè)耳素進行檢測，能夠簡單有效且直觀的測定其含量，從而為合成鹽酸沃尼妙林提供準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù)，進一步保證產(chǎn)品鹽酸沃尼妙林的質(zhì)量。

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(編輯：李文平)

Determination of Dimethyl Cysteaminyl Pleuromulin by HPLC

LI Jin-ming, HUANG Kai*, LI Ji, WEI Li-juan

(HeBei Yuanzheng Pharmaceutical Co., LTD，Hebei Engineering Research Center of Veterinary Drugs, Shijiazhuang 050041, China)

HUANG Kai, E-mail: 634601790@qq.com

An HPLC method for the determination of dimethyl cysteaminyl pleuromulin, a key intermediate of valnemulin hydrochloride, was established. The mobile phase consisted of acetonitrile-phosphate buffer (pH2.5) (V/V=40∶60) with a flow rate of 1 mL/min and a detection wavelength of 205 nm. The chromatographic conditions were SepaxC18 (150 mm×4.6 mm, 3 μm). The linearity, precision, reproducibility, detection limit, quantitation limit and recovery rate of the method were tested. The results were reproducible and could be applied to the content control of the key intermediates of valnemulin hydrochloride.

HPLC; intermediates of valnemulin hydrochloride; dimethyl cysteaminyl pleuromulin; content determination

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.10

李金明，高級工程師，從事獸藥研發(fā)工作。

黃凱。E-mail:634601790@qq.com

2016-12-17

A

1002-1280 (2017) 08-0059-03

S859.79