多重PCR技術(shù)用于食源性金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)

金黃色葡萄球菌是造成食物中毒、化膿性疾病的常見(jiàn)菌種，在土壤、空氣、水源中均有廣泛分布，由于污染食物的概率大，因此成為一項(xiàng)公共衛(wèi)生問(wèn)題。就目前而言，已知的腸毒素種類包括19種，由于缺少特異檢測(cè)手段，尚且不能明確食物中毒的機(jī)制?；诖?，本文選取145株金黃色葡萄球菌進(jìn)行研究，探討了多重PCR檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用效果。

材料與方法

菌株來(lái)源 145株金黃色葡萄球菌從食物檢測(cè)樣本中提取，其中食源性致病菌檢測(cè)樣本110株，包括熟肉、速凍制品、涼拌菜、沙拉、果汁等；食物中毒樣本35株，從患者剩余食物、糞便、肛拭子中獲得。

儀器試劑 Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基、血平板、亞碲酸鉀卵黃增菌液，均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；溶菌酶、基因組提取試劑盒、PCR引物，由上海生工生物工程公司提供；細(xì)菌培養(yǎng)箱是由德國(guó)賓德公司提供；基因擴(kuò)增儀、毛細(xì)管電泳儀、微量分光光度計(jì)等，是由美國(guó)IBM公司提供。

方法 菌株復(fù)蘇:在菌株磁珠凍存管中，用接種環(huán)挑取1顆磁珠，放于營(yíng)養(yǎng)瓊脂肉湯中，在37℃溫度下培養(yǎng)24小時(shí)，并觀察其渾濁度?；蛱崛?取混濁菌液1ml放在1.5ml的EP管內(nèi)，10000rpm離心3min。除去上層清液，向沉淀物加入200μl溶菌酶溶液（濃度為50mg/ml），混合均勻后，在37℃條件下靜置1小時(shí)。然后按照DNA提取試劑盒上的說(shuō)明提取DNA，用微量分光光度計(jì)，測(cè)定提取DNA的濃度，加純水直至濃度達(dá)到10ng/μl，并保存在-20℃的環(huán)境中。引物設(shè)計(jì)和片段測(cè)序:參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)、應(yīng)用Primer remier分析軟件，分別對(duì)9種腸毒素基因的PCR引物進(jìn)行篩選和設(shè)計(jì)，見(jiàn)下表1。

表1 目的基因的片段長(zhǎng)度和引物序列

目的基因片段長(zhǎng)度引物序列SEK 273 5’-TTCGTTAGTAGCTGTGACTCCACCA-3’5’-AGTGCCAGCGCTCAAGGTGAT-3’SEL 572 5’-GCTTTCTGGAAGACCGTATCCTGTG-3’5’-ACGGCGATGTAGGTCCAGGAA-3’SEM 268 5’-TCACCTGCTAATGTAACTCCACCGT-3’5’-TCGCAACCGCTGATGTCGGA-3’SEN 524 5’-ACTCTGCTCCCACTGAACCT-3’5’-AACGTGGCAATTAGACGAGTCA-3’SEQ 331 5’-CTCTGCTTGACCAGTTCCGGTGT-3’5’-TGGCGGAATTACGTTGGCGAAT-3’SEU 229 5’-GGCGGTGTGACCGAGCATGA-3’5’-AGCCAGACTCATAAGGCGAACT-3’

單重PCR反應(yīng)體系:Multiplex PCR Mix2 25μl，上游引物、下游引物均為0.5μl；Multiplex PCR Mix1 0.25μl，模板4μl，加入純水直至50μl。擴(kuò)增條件：94℃條件下預(yù)熱2min，94℃30s、54℃60s、72℃80s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8min。經(jīng)毛細(xì)管電泳處理后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。多重PCR反應(yīng)體系:對(duì)退火溫度、引物濃度等進(jìn)行調(diào)節(jié)，優(yōu)化單重PCR反應(yīng)體系如下：Multiplex PCR Mix2 25μl，上游引物、下游引物均為0.4μl；Multiplex PCR Mix1 0.25μl，模板4μl，加入純水直至50μl。擴(kuò)增條件設(shè)置如下：94℃條件下預(yù)熱2min；然后分別94℃30s、50℃60s、72℃80s，經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)；最后72℃條件下延伸8min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳處理，觀察結(jié)果。

結(jié)果

引物特征性驗(yàn)證結(jié)果。采用盲篩法，選擇9株毛細(xì)管電泳結(jié)果出現(xiàn)的目的片段菌株，對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序后，和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示產(chǎn)物片段相似度高，滿足研究需求。見(jiàn)表2。

表2 金黃色葡萄球菌腸毒素基因產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)結(jié)果

目的基因菌株編號(hào)GenBank登錄號(hào)相似度SEL S-114 NC_003923.1 99% SEM S-005 NC_002758.2 99% SEN S-042 NC_002745.2 99% SEQ S-138 NC_017331.1 99% SEU S-072 NC_009782.1 99%

多重PCR檢測(cè)結(jié)果。利用多重PCR體系，對(duì)145株金黃色葡萄球菌的腸毒素基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示97株(66.9%)至少含有1種腸毒素基因，48株(33.1%)含有2種及以上腸毒素基因。其中，9種腸毒素基因的檢出率從高到低依次為：SEU37株(25.5%)、SEG32株(22.1%)、SEM30株(20.7%)、SEK29株(20.0%)、SEQ26株(17.9%)、SEH23株(15.8%)、SEN15株(10.3%)、SEJ12株(8.3%)、SEL6株(4.1%)。金黃色葡萄球菌屬于葡萄球菌的一種，是造成食物中毒的重要原因之一，美國(guó)疾控中心的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，該菌株造成的食物中毒占比約為33%，僅次于大腸埃希氏菌，位居第二。對(duì)金葡的研究發(fā)現(xiàn)，其包含多種致病因子，例如腸毒素、殺白細(xì)胞素、溶血素、血漿凝固酶等，其中腸毒素的作用最為明顯。腸毒素是低分子蛋白和多肽，具有較強(qiáng)的耐熱性，即使在70-80℃條件下，30min以內(nèi)蛋白不會(huì)完全破壞，而且也不會(huì)被胰蛋白酶降解。針對(duì)已知的腸毒素種類，采用有效的、特異檢測(cè)手段，能明確食物中毒的發(fā)生機(jī)制，為臨床診療提供依據(jù)。

本次研究中，以SEG、SHE、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEQ、SEU 9種腸毒素為研究對(duì)象，建立了多重PCR檢測(cè)體系，具有操作簡(jiǎn)單、通量高、特異性高的優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果顯示，9種腸毒素均有檢出，以SEU、SEG、SEM、SEK的檢出率高。另外，相關(guān)研究指出，SEK和SEQ之間，SEM和SEN之間，SEG和SEU之間，均存在連鎖關(guān)系。以SEK和SEQ為例，兩者位于同一株金葡菌上，可能會(huì)對(duì)金葡菌的毒性力度產(chǎn)生影響，有待進(jìn)一步研究。

綜上，多重PCR技術(shù)用于食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因檢測(cè)，準(zhǔn)確性和特異性高，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

□ 高利海 精益和泰質(zhì)量檢測(cè)股份有限公司