■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

口蹄疫病毒分子生物學(xué)診斷方法研究進(jìn)展

■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

文章論述了口蹄疫病毒分子生物學(xué)診斷方法，包括基因芯片檢測(cè)方法、常規(guī)RT-PCR方法、多重RT-PCR方法、熒光定量RT-PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、核酸試紙檢測(cè)技術(shù)、賴(lài)解旋酶恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)等7種方法，對(duì)口蹄疫的診斷和防控有一定的參考價(jià)值。

口蹄疫病毒；分子生物學(xué)；診斷

口蹄疫(foot and mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，可感染豬、牛、羊等70多種動(dòng)物[1]。該病于1514年首次發(fā)現(xiàn)于意大利，目前，在非洲、亞洲、南美洲及歐洲的部分國(guó)家廣泛流行。該病傳染性強(qiáng)、傳播快、流行范圍廣，且能以氣溶膠的形式遠(yuǎn)距離傳播，一旦發(fā)生，往往造成大流行，不易控制和消滅，不僅給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還影響社會(huì)穩(wěn)定、國(guó)際貿(mào)易及國(guó)家聲譽(yù)。我國(guó)是世界上口蹄疫多發(fā)國(guó)家之一，且疫情復(fù)雜，這與我國(guó)的地理環(huán)境密切相關(guān)，鄰國(guó)如越南、緬甸、泰國(guó)等國(guó)都有口蹄疫流行。世界各國(guó)對(duì)口蹄疫的防控都十分重視，此病已成為國(guó)際重點(diǎn)檢疫對(duì)象。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將口蹄疫列在15個(gè)A類(lèi)動(dòng)物疫病之首，我國(guó)政府也將其排在一類(lèi)動(dòng)物傳染病的第一位?？谔阋咭荒晁募揪砂l(fā)病，多發(fā)于冬、春寒冷季節(jié)[2]。本文就口蹄疫病毒的分子生物學(xué)診斷方法研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為口蹄疫的快速診斷和防控提供參考。

1 分子生物學(xué)診斷

1.1 基因芯片檢測(cè)

基因芯片檢測(cè)技術(shù)是在芯片上排列著眾多一定堿基順序的DNA探針，通過(guò)與堿基互補(bǔ)序列的單鏈目標(biāo)DNA片段雜交，捕捉相應(yīng)的DNA分子。檢測(cè)系統(tǒng)再將雜交過(guò)程或結(jié)果轉(zhuǎn)化為可觀測(cè)的信號(hào)，進(jìn)入信號(hào)采集分析系統(tǒng)[3]。楊林等[4]根據(jù)FMDV基因組序列保守區(qū)，設(shè)計(jì)合成2對(duì)引物，通過(guò)RT-PCR方法篩選出特異引物，用Cy3標(biāo)記下游引物5′端，針對(duì)這個(gè)基因片段，設(shè)計(jì)合成4條寡核苷酸探針，開(kāi)展靶基因擴(kuò)增和克隆、陽(yáng)性質(zhì)粒構(gòu)建、芯片雜交與反應(yīng)條件優(yōu)化以及芯片靈敏度和特異性分析等試驗(yàn)研究，建立FMDV的基因芯片檢測(cè)方法。相磊等[5]為建立FMDV不同血清型與基因型的基因芯片檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)針對(duì)O型8個(gè)基因型、A型3個(gè)基因型和亞洲1型的特異性探針。從美國(guó)GenBank與英國(guó)世界口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室基因庫(kù)下載了O型、A型和亞洲1型FMDV的VP1基因序列547條。對(duì)每一種血清型序列用DNA Star軟件ClastalW程序進(jìn)行多重比對(duì)，做系統(tǒng)發(fā)育分析并進(jìn)行基因分型。用生物學(xué)軟件BioSun 2.0建立基因型數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)每一基因型的特異性探針。共設(shè)計(jì)出104條候選探針，通過(guò)芯片試驗(yàn)篩選出12條特異性探針。以各型特異性探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的靶序列模板做10倍系列稀釋進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交，驗(yàn)證各探針的靈敏度。對(duì)O型SEA、Euro-SA、ME-SA、WA4個(gè)基因型的各條探針的靈敏度進(jìn)行了檢驗(yàn)，結(jié)果這些探針能夠檢測(cè)到102數(shù)量級(jí)拷貝數(shù)的陽(yáng)性靶標(biāo)。

1.2 常規(guī)RT-PCR 方法

RT-PCR方法是根據(jù)目的片段序列設(shè)計(jì)引物，借助儀器和相關(guān)聚合酶體外大量擴(kuò)增部分或全部目的片段，是一種快速、簡(jiǎn)便、特異的診斷方法。張書(shū)光等[6]設(shè)計(jì)合成一套引物，通過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了一種RTPCR的方法，用于檢測(cè)O、A和亞洲I型口蹄疫病原，并用該法檢測(cè)患病豬的頜下淋巴結(jié)和扁桃體，牛、羊的食道-咽分泌物(O-P液)等樣品。結(jié)果表明，該方法可快速靈敏檢測(cè)出豬的頜下淋巴結(jié)和扁桃體，牛、羊的食道-咽分泌物中的FMDV，并具有較好的特異性和重復(fù)性。結(jié)論：建立了一種RT-PCR檢測(cè)O、A和亞洲I型口蹄疫病原的方法。

1.3 多重RT-PCR方法

多重RT-PCR具有快速、靈敏度高、高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是在同一反應(yīng)體系中，加入多種引物，同時(shí)檢測(cè)2種或2種以上的病毒RNA，目前已廣泛應(yīng)用于臨床疾病的快速診斷。張彥婷等[7]根據(jù)口蹄疫病毒VP1基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)4條特異性引物，通過(guò)對(duì)退火溫度等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立能夠同時(shí)擴(kuò)增出O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒的多重RT-PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明，建立的方法最低可以檢測(cè)出約含1pg/μL的病毒樣品，該方法對(duì)豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒等其他相關(guān)病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，特異性良好。秦敏等[8]針對(duì)藍(lán)舌病病毒(BTV)NS3基因、FMDV 3D基因、小反芻獸疫病毒(PPRV)N基因和水皰性口炎病毒(VSV)N基因序列設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件，建立了一種同時(shí)檢測(cè)4種病毒的多重PCR方法。對(duì)建立的多重PCR檢測(cè)方法的特異性及敏感性進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明建立的多重PCR檢測(cè)方法敏感性強(qiáng)、特異性良好，對(duì)4種病毒的最低檢出限分別為PPRV 103copies/μL、BTV 103copies/μL、VSV 103copies/ μL和FMDV 102copies/μL。

1.4 熒光定量RT-PCR方法

熒光定量RT-PCR技術(shù)是指采用SYBR GreenⅠ熒光染料或熒光探針通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，不需要分離擴(kuò)增產(chǎn)物，即能準(zhǔn)確定量起始模板數(shù)[9]。李金海等[10]根據(jù)FMDV聚合酶3D基因序列比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)特異性引物和MGB探針，建立檢測(cè)FMDV的一步法熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該法能特異性檢測(cè)A型、O型、Asia1型FMDV，而對(duì)豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬狂犬病毒、豬乙型腦炎病毒等檢測(cè)結(jié)果均為陰性，構(gòu)建的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與模板濃度呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)質(zhì)粒的敏感性可達(dá)83.4copies/ μL，檢測(cè)病毒RNA的敏感性可達(dá)7.1fg/μL，比多重RT-PCR敏感性高10倍，對(duì)4份樣品進(jìn)行5次批內(nèi)和批間重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)均小于2%。王乃福等[11]根據(jù)口蹄疫病毒3D蛋白編碼基因、水皰性口炎病毒N蛋白編碼基因和豬水泡病病毒VP1蛋白編碼基因的高保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和探針，對(duì)3種動(dòng)物病毒進(jìn)行多重?zé)晒舛縍T-PCR擴(kuò)增。結(jié)果經(jīng)過(guò)擴(kuò)增，可以同時(shí)檢測(cè)口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒和豬水皰病病毒，而其他參試病原均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，顯示其良好的特異性。對(duì)口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、豬水皰病病毒的最低檢測(cè)限分別達(dá)到101、102、102個(gè)質(zhì)粒拷貝濃度。宋爽等[12]根據(jù)高度保守的牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的5'UTR基因、牛傳染性支氣管炎病毒(IBRV)的gB基因和FMDV的3D基因，分別設(shè)計(jì)了3對(duì)對(duì)應(yīng)的特異性引物和3種不同發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記的TaqMan探針，建立了同時(shí)檢測(cè)這3種病毒的多重?zé)晒舛縋CR的方法。并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，該多重?zé)晒舛縋CR方法能夠特異性檢測(cè)出BVDV、IBRV和FMDV，而對(duì)BTV等檢測(cè)結(jié)果均為陰性，對(duì)BVDV、IBRV、FMDV的最低檢測(cè)量分別為194copies/μL、208copies/μL和150copies/μL。而且組內(nèi)和組間變異系數(shù)均低于0.85%。

1.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是在等溫條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。基因的擴(kuò)增和產(chǎn)物的檢測(cè)可一步完成，擴(kuò)增效率和特異性高，可在15～60min擴(kuò)增109～1010倍，可只通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)來(lái)判別。秦智鋒等[13]設(shè)計(jì)了6條針對(duì)FMDV 3D基因的8個(gè)位點(diǎn)的特異性引物，建立了口蹄疫病毒RTLAMP檢測(cè)方法的。所建立的檢測(cè)方法靈敏度高，與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR靈敏度相當(dāng)，且具有特異性，對(duì)其他水皰性疾病病原體檢測(cè)均為陰性，而且簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的儀器，常規(guī)水浴鍋在63.5℃即可進(jìn)行，肉眼可直接觀察檢測(cè)結(jié)果。李健等[14]利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)，建立了口蹄疫病毒快速檢測(cè)方法，同時(shí)評(píng)價(jià)了該方法的靈敏性和特異性。結(jié)果表明，根據(jù)蹄疫病毒多聚蛋白基因保守區(qū)段設(shè)計(jì)的LAMP引物能夠在65℃下，1h內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸區(qū)段的大量擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果可直接用肉眼判斷。該檢測(cè)體系具有極高的特異性，只能檢測(cè)到目標(biāo)病毒，與其他類(lèi)似病毒如豬水皰病病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒等無(wú)交叉反應(yīng)，可檢測(cè)到10-5稀釋度的目標(biāo)病毒核酸量，比普通RTPCR的靈敏性高100倍，比熒光PCR高10倍。

1.6 核酸試紙檢測(cè)技術(shù)

核酸試紙檢測(cè)技術(shù)是將核酸探針標(biāo)記與試紙條相結(jié)合進(jìn)行生物學(xué)檢測(cè)，是核酸檢測(cè)的新領(lǐng)域。龔真莉等[15]用RT-PCR方法獲得FMDV3D核苷酸片段，在引物中設(shè)計(jì)了靈敏度高、特異性好的核酸探針-生物素和地高辛，使擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合探針。利用膠體金的放大原理將鏈霉親和素與金顆粒形成膠體金混合物，從而與RT-PCR產(chǎn)物中的生物素探針結(jié)合。硝酸纖維素膜上端標(biāo)記生物素化山羊抗兔IgG作為指控條帶，下端標(biāo)記抗地高辛抗體以捕獲RT-PCR產(chǎn)物中的地高辛探針。組裝金標(biāo)試紙條，檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物，結(jié)果表明該核酸試紙條可以檢測(cè)到0.3×10-3～3×10-3μg/μL，敏感性高于瓊脂糖凝膠電泳，兩種方法的符合率高。

1.7 賴(lài)解旋酶恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)

賴(lài)解旋酶恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)(HDA)是一種新興、簡(jiǎn)單、有效的基因擴(kuò)增技術(shù)，其擴(kuò)增原理是先用解旋酶解開(kāi)雙鏈DNA，再依靠單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)與模板單鏈結(jié)合，使模板單鏈處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)它的完整性，引物與模板雜交，然后在DNA聚合酶催化下擴(kuò)增。新生成的dsDNA產(chǎn)物作為底物進(jìn)入下一輪擴(kuò)增[16]。金靜維等[17]針對(duì)FMDV編碼3D蛋白(RNA聚合酶)的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了FMDV逆轉(zhuǎn)錄解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-HDA)快速檢測(cè)方法。該方法可在65℃下，120min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)口蹄疫病毒保守序列的大量擴(kuò)增。該方法可檢測(cè)到0.2ng的FMDV核酸量，比普通RT-PCR高10倍，具有極高的特異性，除了能對(duì)FMDV核酸進(jìn)行擴(kuò)增外，對(duì)其他臨床癥狀與口蹄疫類(lèi)似的病毒，如水皰病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒和水皰性口炎病毒的核酸，則不能擴(kuò)增出目的片段。

2 小結(jié)

口蹄疫防控工作是一項(xiàng)涉及畜牧業(yè)安全生產(chǎn)的大事，也是保障人們食品安全和國(guó)家聲譽(yù)的重要問(wèn)題。目前，我國(guó)是疫區(qū)國(guó)家，國(guó)內(nèi)及周邊疫情都很復(fù)雜，口蹄疫的防控形勢(shì)仍比較嚴(yán)峻，口蹄疫的正確診斷是進(jìn)行防控的前提和基礎(chǔ)，因此，建立早期、快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)方法從而采取相應(yīng)的防控措施才能控制口蹄疫的流行。目前已經(jīng)建立了FMDV多種分子生物診斷方法，但這些方法各有利弊，如基因芯片檢測(cè)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是一次可檢測(cè)大量樣品和大量疾病，檢測(cè)速度快、靈敏度高，缺點(diǎn)是一次性需要大量的資金投入，費(fèi)用高，不適合基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，且特異性不高，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。常規(guī)RT-PCR方法雖然檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)，但不能準(zhǔn)確定量，且敏感性有限。熒光定量RT-PCR方法雖然克服了常規(guī)RT-PCR的缺陷，但儀器和探針的合成價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本比較高，不適合大面積推廣應(yīng)用。LAMP方法雖然簡(jiǎn)單、方便，適合基層進(jìn)行推廣應(yīng)用，但靈敏度太高，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。文中提到的核酸試紙檢測(cè)技術(shù)，需要對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，且需要對(duì)樣品進(jìn)行純化，對(duì)技術(shù)要求較高，基層部門(mén)不易掌握。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，筆者認(rèn)為恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)與試紙檢測(cè)技術(shù)結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)是未來(lái)分子檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的新方向，目前對(duì)其他疾病的檢測(cè)方面已經(jīng)研制出了基因試紙卡檢測(cè)盒，是將LAMP檢測(cè)與試紙檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)，兼具二者的優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單，全程時(shí)間短，又能避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)，不需要冷凍保存，易保存和運(yùn)輸，適合基層獸醫(yī)部門(mén)應(yīng)用，基因試紙卡及其配套適合攜帶的簡(jiǎn)易核酸制備設(shè)備是未來(lái)口蹄疫檢測(cè)試劑的研究方向?！?/p>

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