石 峰 于 雁

節(jié)拍化療通過影響血管形成及免疫系統(tǒng)抑制腫瘤細(xì)胞生長的機(jī)制

石 峰 于 雁

目的 研究節(jié)拍化療方案對乳腺癌腫瘤細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制。方法 建立荷瘤小鼠模型，給予常規(guī)劑量卡培他濱化療作為常規(guī)化療組，持續(xù)低劑量卡培他濱化療作為節(jié)拍化療組，不應(yīng)用化療作為對照組。測定腫瘤血管微密度(Microvessel density，MVD)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、凝血酶敏感蛋白1(Thrombospondin 1，TSP-1)的表達(dá)情況，通過流式細(xì)胞僅檢測不同化療方案中骨髓來源抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的比例，觀察化療結(jié)束后小鼠的腫瘤大小和血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果 節(jié)拍化療組與常規(guī)化療組比較，MVD、VEGF降低，TSP-1升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。節(jié)拍化療組與常規(guī)化療組比較，MDSCs比例降低，NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。節(jié)拍化療組與常規(guī)化療組在治療結(jié)束后腫瘤體積沒有區(qū)別(P>0.05)，但節(jié)拍化療組小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于常規(guī)化療組(P<0.05)。結(jié)論 持續(xù)低劑量卡培他濱化療通過抑制新生血管形成，調(diào)整免疫細(xì)胞的比例來抑制腫瘤形成，同時(shí)降低化療引起的副反應(yīng)，提高生存質(zhì)量。

節(jié)拍化療；血管抑制；免疫系統(tǒng)；生存質(zhì)量

節(jié)拍化療是一種采用低劑量持續(xù)性或高頻率給藥的治療方案，最早由Browder等[1]在2000年提出，該方案使得患者在獲得收益的同時(shí)副反應(yīng)也能夠降低，被認(rèn)為是一種可以在常規(guī)化療耐藥后繼續(xù)起效的方法。目前一些研究證明節(jié)拍化療可以抑制腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮的增殖。上調(diào)內(nèi)源性血管生成抑制因子、下調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡或抑制增殖等均是其機(jī)制[2]。

乳腺癌對化療相對敏感，患者的生存期相對較長，傳統(tǒng)的化療方法副作用較大，不良反應(yīng)較重，部分患者在應(yīng)用常規(guī)化療方案后不能耐受其副反應(yīng)而被迫停止治療。如標(biāo)準(zhǔn)劑量的卡培他濱治療手足綜合征的發(fā)病率高達(dá)45%～68%，同時(shí)在兩個(gè)化療周期之間也存在著較長的時(shí)間間隔，可能使得部分腫瘤細(xì)胞再次生長，因而傳統(tǒng)的治療方法受到了不良反應(yīng)的限制。

目前節(jié)拍化療的機(jī)制研究主要集中在抗血管生成，近幾年逐漸關(guān)注免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)在節(jié)拍化療中的作用，部分研究證實(shí)一些藥物在節(jié)拍化療中小鼠的免疫細(xì)胞比例起到了變化[3-4]，但卡培他濱節(jié)拍化療是否能夠起到相似的作用研究較少。本研究旨在通過裸鼠抑瘤實(shí)驗(yàn)、免疫組化實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)確定卡培他濱節(jié)拍化療與傳統(tǒng)化療方案對乳腺癌腫瘤細(xì)胞的影響，明確節(jié)拍化療的作用機(jī)制，與常規(guī)化療比較其治療效果和副反應(yīng)有何不同，為乳腺癌患者提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

從美國模式菌種收集中心(ATCC)購入乳腺癌細(xì)胞系，放入黑龍江省腫瘤防治研究所保存。從北京維通利華公司購入BALB/c雌性小鼠，4～6周齡，體重15～20 g。從江蘇正大天晴公司購入卡培他濱原研藥粉。從北京中杉生物技術(shù)公司購入CD34、VEGF、TSP-1單克隆抗體及免疫試劑盒。Gr-1、CD16及F4/80抗體購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤小鼠的建立 將45只4～6周的BALB/c裸鼠隨機(jī)分為3組，每組15只裸鼠。在SPF級培養(yǎng)條件下培養(yǎng)裸鼠，每日觀察裸鼠的一般情況，將腫瘤細(xì)胞懸液0.2 mL注入小鼠右后腹股溝皮下，約6×106細(xì)胞/只。觀察腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤情況，每隔7天測量腫瘤大小，按公式：V=a2b/2計(jì)算腫瘤體積(a：腫瘤短徑，b：腫瘤長徑)，同時(shí)檢測小鼠靜脈血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將45只裸鼠隨機(jī)分為三組，給予常規(guī)劑量卡培他濱化療作為常規(guī)化療組(MTD)，持續(xù)低劑量卡培他濱化療作為節(jié)拍化療組(LDM)。常規(guī)化療組每日進(jìn)行一次灌胃，按照人體和小鼠等效劑量換算，小鼠卡培他濱劑量為360 mg/kg，持續(xù)14天，間歇7天。將卡培他濱劑量由低到高給小鼠灌注，檢測小鼠體內(nèi)的循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞(Circulating endothelial progenitor cells，CEPs)，當(dāng)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞最低時(shí)確定為節(jié)拍化療的藥物劑量[5]，節(jié)拍化療組每日一次灌胃，卡培他濱劑量為90 mg/kg，持續(xù)進(jìn)行不間歇。不應(yīng)用化療作為對照組，觀察三組小鼠6周后的治療情況。

1.2.3 細(xì)胞流式檢測不同免疫細(xì)胞比例 應(yīng)用藥物治療后第14天，每組取出5只小鼠，切除腫瘤細(xì)胞，用PBS漂洗，將組織剪碎、混勻，用不銹鋼過濾網(wǎng)去掉殘?jiān)?，?xì)胞懸浮在PBS液中，再用酶消化處理，離心，加入Gr-1、CD16及F4/80抗體，上流式細(xì)胞儀檢測不同實(shí)驗(yàn)組骨髓來源抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞(Macrophages)的比例。

1.2.4 免疫組化染色 6周后處死三組中剩余裸鼠，統(tǒng)計(jì)腫瘤體積數(shù)據(jù)及白細(xì)胞計(jì)數(shù)，剝離腫瘤組織，用甲醛溶液在常溫下固定，先用石蠟包埋然后切片，再進(jìn)行CD34、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、凝血酶敏感蛋白1(Thrombospondin 1，TSP-1)免疫組織化學(xué)檢測，用PBS作為空白對照。

1.2.5 結(jié)果判定 通過CD34單抗標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞觀察腫瘤微血管密度(MVD)，內(nèi)皮細(xì)胞胞漿被染成棕色，在400倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)的數(shù)目，計(jì)算所有視野內(nèi)數(shù)目的總數(shù)后取平均值。VEGF和TSP-1也呈棕黃色染色，計(jì)數(shù)隨機(jī)3個(gè)視野內(nèi)的數(shù)目，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用單因素方差分析、重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量方差分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同化療方案對腫瘤免疫細(xì)胞的影響

流式細(xì)胞結(jié)果顯示與常規(guī)化療組和對照組比較，節(jié)拍化療組骨髓來源抑制性細(xì)胞比例降低，NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 MDSCs、NK、巨噬細(xì)胞在不同化療組中的比例

2.2 不同化療方案的血管形成檢測

與常規(guī)化療組和對照組比較，節(jié)拍化療組MVD、VEGF降低，TSP-1升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 各組免疫組化表達(dá)情況

2.3 不同化療方案的抑瘤作用

接種腫瘤后第七天對照組腫瘤大小(246.7±19.1)mm3，節(jié)拍化療組腫瘤大小(256.8±23.3)mm3，常規(guī)化療組腫瘤大小(277.1±17.7)mm3，各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在應(yīng)用不同方案化療藥物后前七天各組裸鼠腫瘤體積沒有差異，治療后第14天對照組腫瘤大小(1 843.5±327.4)mm3，節(jié)拍化療組腫瘤大小(1 024.7±213.3)mm3，常規(guī)化療組腫瘤大小(977.8±192.5)mm3，對照組與化療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但常規(guī)化療組與節(jié)拍化療組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療結(jié)束后對照組腫瘤大小(3 741.3±624.6)mm3，節(jié)拍化療組腫瘤大小(2247.1±445.6)mm3，常規(guī)化療組腫瘤大小(2 128.9±437.2)mm3，對照組的腫瘤體積大于常規(guī)化療組和節(jié)拍化療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但常規(guī)化療組與節(jié)拍化療組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 裸鼠腫瘤生長曲線Figure 1 The volume of tumor in different groups

2.4 不同化療方案的毒副反應(yīng)

化療開始前對照組白細(xì)胞數(shù)(8.91±1.12)×109/L，常規(guī)化療組白細(xì)胞數(shù)(8.73±1.24)×109/L，節(jié)拍化療組白細(xì)胞數(shù)(9.17±1.16)×109/L，各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?；熼_始后常規(guī)化療組白細(xì)胞數(shù)在治療開始第14天后出現(xiàn)降低，隨著治療的進(jìn)行白細(xì)胞數(shù)繼續(xù)降低。節(jié)拍化療組白細(xì)胞數(shù)在治療開始第14天后出現(xiàn)輕度降低。治療結(jié)束后對照組白細(xì)胞數(shù)(9.1±1.31)×109/L，常規(guī)化療組白細(xì)胞數(shù)(4.45±1.25)×109/L，節(jié)拍化療組白細(xì)胞數(shù)(7.27±1.08)×109/L，節(jié)拍化療組白細(xì)胞數(shù)低于對照組，但明顯高于常規(guī)化療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同組裸鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)Figure 2 The number of white blood cell in different groups

3 討論

傳統(tǒng)的化療方案除了藥物的細(xì)胞毒性起到了殺傷腫瘤細(xì)胞的作用以外，這樣的化療模式同時(shí)也對腫瘤再生長、腫瘤新生血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移起到了作用[6-8]，因而這些年節(jié)拍化療成為了研究熱點(diǎn)。節(jié)拍化療目前主要研究的作用機(jī)制是抑制腫瘤的新生血管形成，通過抑制VEGF，提高TSP-1發(fā)揮抗腫瘤作用。其中TSP-1是一種內(nèi)源性血管內(nèi)皮抑制因子，可以與CD36受體結(jié)合，從而阻止內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，而CD36陰性的細(xì)胞不會(huì)被TSP-1所抑制，因而節(jié)拍化療可以特異性的作用于腫瘤細(xì)胞的血管生成，而不影響正常造血系統(tǒng)功能。同時(shí)，節(jié)拍化療也可以抑制由循環(huán)前體內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來的血管內(nèi)皮細(xì)胞，這些內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后會(huì)在新生血管處轉(zhuǎn)化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞。有一些研究證明持續(xù)低劑量節(jié)拍化療可以降低荷瘤裸鼠血中CEPs含量，從而抑制腫瘤血管形成，產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。

除了抑制腫瘤新生血管生成外，近幾年人們逐漸認(rèn)識(shí)到免疫系統(tǒng)在節(jié)拍化療中起到的作用，部分研究證實(shí)應(yīng)用環(huán)磷酰胺和紫杉醇節(jié)拍化療方案，較常規(guī)的化療方案其T細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞的百分比均有變化，證實(shí)了免疫系統(tǒng)起到的作用[3-4]，一些臨床實(shí)驗(yàn)應(yīng)用環(huán)磷酰胺節(jié)拍化療發(fā)現(xiàn)對于腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤侵襲節(jié)拍化療較常規(guī)化療有著更多的優(yōu)勢[9-10]。

卡培他濱是乳腺癌治療的重要藥物，在臨床中應(yīng)用范圍較廣，但由于常規(guī)化療引起的毒副作用及耐藥嚴(yán)重影響了化療效果，晚期患者及老年患者耐受性更差，無法耐受常規(guī)化療，缺乏有效的治療手段。在節(jié)拍化療得到研究之后，發(fā)現(xiàn)節(jié)拍化療可以通過抑制腫瘤組織中活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓來源的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞、抑制促腫瘤血管生成因子來實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的作用，同時(shí)節(jié)拍化療副反應(yīng)輕，耐受性好，為晚期患者及耐藥患者提供了新的治療方法[11-12]。

本研究通過在體外應(yīng)用卡培他濱節(jié)拍化療方案作用于乳腺癌細(xì)胞，證明卡培他濱能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖活性，能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力，明確了卡培他濱對惡性腫瘤生長的抑制作用。同時(shí)節(jié)拍化療組與常規(guī)化療組比較，對乳腺癌腫瘤生長的影響沒有區(qū)別，可以起到同樣的抗腫瘤作用。但根據(jù)血液白細(xì)胞的檢測發(fā)現(xiàn)，節(jié)拍化療組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于常規(guī)化療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在起到同樣化療作用的時(shí)候，節(jié)拍化療組的安全性更好，更適用于臨床當(dāng)中身體狀態(tài)差，不能耐受常規(guī)化療的患者，為他們的繼續(xù)治療提供一個(gè)良好的化療方案。在研究中節(jié)拍化療組MVD及VEGF較常規(guī)化療組和對照組降低，TSP-1較常規(guī)化療組和對照組升高，證明了節(jié)拍化療方案對腫瘤血管生成具有抑制作用。同時(shí)還通過流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究了免疫系統(tǒng)在節(jié)拍化療中起到的作用，NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞在節(jié)拍化療組高于常規(guī)化療組，MDSCs細(xì)胞低于常規(guī)化療組，說明了免疫細(xì)胞比例的改變也是節(jié)拍化療方案能夠起到抗腫瘤作用的機(jī)制之一。

綜上所述，卡培他濱節(jié)拍化療可以起到抗乳腺癌腫瘤的作用，這對于內(nèi)分泌治療無效，赫賽汀治療無效，既往已經(jīng)應(yīng)用了常規(guī)化療，但出現(xiàn)了嚴(yán)重不良反應(yīng)的患者提供了一種新的治療方案。目前許多研究已經(jīng)證實(shí)了節(jié)拍化療的有效性和可靠性，在以后的乳腺癌臨床治療中，卡培他濱節(jié)拍化療有望成為一種新的常規(guī)治療模式。

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(收稿：2017-03-24)

Rhythmic chemotherapy affects the growth of tumor cells by influencing the formation of blood vessels and the immune system

SHIFeng，YUYan

Department of 6th Internal Medicine，Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China

Objective The objective of this study was to determine the effect of curative chemotherapy regimen on breast cancer cells and its mechanism.Methods A tumor-bearing mouse model was established and routine dose of capecitabine was given as a conventional chemotherapy group.Continuous low-dose capecitabine chemotherapy was used as a radiotherapy group and no chemotherapy was used as a control group.The expression of microvessel density(MVD)，vascular endothelial growth factor(VEGF)and thrombospondin 1(TSP-1)were measured by flow cytometry.The percentage of myeloid-derived suppressor cells(MDSCs)，NK cells and macrophages in the program was observed.The tumor size and blood leukocyte count were measured after chemotherapy.Results MVD and VEGF in the radiotherapy group were significantly decreased and TSP-1 was significantly increased in comparison with the conventional chemotherapy group(P<0.05).The proportion of MDSCs in the radiotherapy group was significantly decreased，the proportion of NK cells and macrophages were significantly increased when compared to the conventional chemotherapy group(P<0.05).The tumor volume was no difference between the control and chemotherapy groups(P>0.05).However，the white blood cell count in the radiotherapy group was significantly higher than that in the conventional chemotherapy group(P<0.05).Conclusion Capecitabine chemotherapy at continuous low-dose inhibits neovascularization and adjusts the proportion of immune cells to suppress tumor formation.Thus，this chemotherapy could reduce side effects caused by chemotherapy and improve the quality of life.

Metronomic chemotherapise；Antiangiogenesis；Immunological system；Quality of life

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)六科(哈爾濱 150081)

石峰，男，(1988-)，碩士，住院醫(yī)師，從事節(jié)拍化療作用與機(jī)制的研究。

于雁，E-mail：yuyan@ems.hrbmu.edu.cn

R737.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.04.006