王東亮 戚 寧 牟冠男 張?jiān)鹿?/p>

結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD39、CD73亞群及二者雙陽(yáng)性亞群的臨床意義

王東亮1戚 寧1牟冠男1張?jiān)鹿?

目的 觀察結(jié)直腸癌腫瘤組織微環(huán)境中浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的臨床意義，并探究其CD39、CD73及CD39，CD73雙陽(yáng)性亞群與腫瘤微環(huán)境中其他淋巴細(xì)胞及臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。方法 收集24例結(jié)直腸癌患者根治術(shù)后組織標(biāo)本，剪碎并分離培養(yǎng)組織內(nèi)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(Tumor infiltrating lymphocyte，TIL)，以流式細(xì)胞術(shù)觀察調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD39+、CD73+及CD39+CD73+亞群與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果 結(jié)直腸癌腫瘤組織微環(huán)境中浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD73+亞群，CD39+CD73+亞群與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度不良具有相關(guān)性，并且其機(jī)制與腫瘤相關(guān)性炎癥密切相關(guān)。結(jié)論 相比Treg中的其他亞群，CD39+CD73+陽(yáng)性的結(jié)直腸腫瘤浸潤(rùn)Treg具有更為獨(dú)特的生物學(xué)活性，本研究為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌預(yù)后提供了新思路與理論依據(jù)。

結(jié)直腸癌；腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；CD39；CD73

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是目前最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)最新數(shù)據(jù)表明，美國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率在所有惡性腫瘤中均僅次于肺癌、前列腺癌和乳腺癌，高居第三位[1]；我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率近年呈不斷升高的趨勢(shì)，年死亡例數(shù)高達(dá)19萬(wàn)[2]。結(jié)直腸癌的高發(fā)病率和高死亡率對(duì)人類(lèi)的健康及生命構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。

由于結(jié)直腸癌的治療已經(jīng)進(jìn)入瓶頸期，許多研究者開(kāi)始著重對(duì)一些結(jié)直腸癌的預(yù)后指標(biāo)進(jìn)行研究。一方面尋找有力的預(yù)后指標(biāo)，一方面驗(yàn)證這些指標(biāo)能否成為干預(yù)因素，進(jìn)而改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，從而突破當(dāng)前的治療瓶頸。經(jīng)過(guò)近些年大量研究證實(shí)，腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞(Tumor infiltrating lymphocyte，TIL)的數(shù)量及種類(lèi)可以作為指導(dǎo)腫瘤患者預(yù)后的確定因素[3]。TIL中有一種具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg)是TIL中的一種重要亞型，其在腫瘤組織中浸潤(rùn)的數(shù)量，功能導(dǎo)向與腫瘤的進(jìn)展有著顯著關(guān)聯(lián)[4]。許多研究證實(shí)，TIL中的Treg是多種腫瘤的預(yù)后不良因素[5-6]。但在對(duì)結(jié)直腸癌及頭頸部腫瘤的研究中，卻發(fā)現(xiàn)其是保護(hù)性因素之一[7-8]。由于TIL中Treg群體具有獨(dú)特的預(yù)后作用，目前已成為腫瘤免疫學(xué)研究方面的新熱點(diǎn)[9-10]。而Treg的諸多免疫抑制功能中，例如通過(guò)其功能性表面分子，如CD39、CD73等，將腫瘤微環(huán)境中的ATP降解為腺苷，從而殺傷免疫效應(yīng)細(xì)胞，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃逸免疫監(jiān)視系統(tǒng)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移是近年間的研究熱點(diǎn)[11-12]。本研究將從Treg TIL的CD39-CD73亞群進(jìn)行研究，探究其是否具有獨(dú)特的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

本研究病例取自2014年3月10日—2014年6月18日于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)結(jié)直腸癌根治術(shù)后的24例結(jié)直腸癌患者的臨床及病理資料(表1)。所有患者術(shù)前均排除自身免疫性疾病，支氣管哮喘，糖尿病，自身免疫性肝炎，肝硬化，甲狀腺疾病等，且均未行化、放療，生物及中醫(yī)治療等。所有檢測(cè)標(biāo)本術(shù)前均通過(guò)病理學(xué)診斷且證實(shí)為結(jié)直腸癌。

RPMI 1640購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自GIBCO/BRL公司，青/鏈霉素購(gòu)自碧云天公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自灝洋公司，乙酸佛波酯(PMA)購(gòu)自Sigma公司，離子霉素(Ionomycin)購(gòu)自Sigma公司，高爾基阻斷劑(Golgi-stop)，Cytofix/Cytoperm solution Kit，CD45，CD4，CD8，CD25，CD127，CD39，CD73，IL-17A及BD FACS Aria II均購(gòu)自BD Biosciences公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

手術(shù)切除的癌組織、癌旁組織(標(biāo)準(zhǔn)為癌邊緣算起至5 cm處)、非腫瘤正常組織(距癌邊緣算起大于5 cm以上處)各1塊。裝在無(wú)菌手術(shù)袋中在30 min內(nèi)用4℃冰盒運(yùn)至細(xì)胞間無(wú)菌室繼續(xù)分離處理。在超凈工作臺(tái)無(wú)菌條件下用手術(shù)剪把組織剪成0.5～1 cm 2小塊，其中1塊浸入4%多聚甲醛固定液中用于組織切片染色和病理分析，所有結(jié)直腸癌組織從取材到分離為單個(gè)細(xì)胞均在2 h內(nèi)，經(jīng)過(guò)流式抗體標(biāo)記后，細(xì)胞培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2濕度培養(yǎng)箱，培養(yǎng)于含10%血清的1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞抗體常溫避光孵育，孵育后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.3 檢驗(yàn)方法

術(shù)前采集患者外周血及血清，送往哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)血常規(guī)、生化及腫瘤標(biāo)志物，所有檢驗(yàn)人員操作技術(shù)熟練，持證上崗，質(zhì)控全部在控，無(wú)不良事件發(fā)生。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)，率的比較采用Fisher精確概率法，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)性應(yīng)用Pearson 分析。圖像分析運(yùn)用Sigma Plot數(shù)據(jù)分析軟件，做出組間比較條形圖。Excel軟件做出線形圖。

表1 24例結(jié)直腸癌患者臨床參數(shù)

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌腫瘤浸潤(rùn)Treg及亞群與臨床參數(shù)之間的關(guān)系

本研究分析了結(jié)直腸癌組織中CD45+、CD39+Treg、CD73+Treg、CD39+CD73+Treg中的表達(dá)情況與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，Treg上述亞群占Treg的比率高低在各臨床病理參數(shù)中并無(wú)差異(表2)。

表2 CD45+ Treg，CD39+Treg，CD73+Treg，CD39+CD73+Treg百分率與臨床參數(shù)間的關(guān)系

Note：High and Low in the table are defined by mean.

2.2 流式檢測(cè)結(jié)直腸癌腫瘤浸潤(rùn)Treg及其亞群的分布情況

本研究分析了結(jié)直腸癌(圖1A)與癌旁正常組織(圖1B)中CD4+CD25+CD127low細(xì)胞群體及其表面CD39、CD73分子的表達(dá)情況，癌旁正常組織中浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞為NIL(Normal Infiltrating Lymphocyte)。腫瘤組織制備的單細(xì)胞懸液先經(jīng)CD45確定淋巴細(xì)胞并設(shè)門(mén)后，經(jīng)CD4和CD25標(biāo)記分析的結(jié)果如圖1左側(cè)所示，提取CD4+CD25+細(xì)胞，并進(jìn)一步依據(jù)CD127的表達(dá)情況將細(xì)胞分為CD127high和CD127low兩個(gè)亞群。進(jìn)一步分析CD127low的亞群中表達(dá)有表面標(biāo)記CD39和/或CD73的細(xì)胞。

2.3 結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中Treg中CD39+、CD73+亞群的關(guān)系

相關(guān)性分析了結(jié)直腸癌中浸潤(rùn)的CD39+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與總調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.489，P<0.05)(圖2A)；CD39+Treg在TIL中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)，CD39+CD73+Treg在TIL中的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織(P<0.05)(圖2B)。

圖1 結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中Treg中 CD39+、CD73+亞群的關(guān)系Figure 1 The relationship between Treg and its CD39，CD73，CD39 CD73 subgroup in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissuesNote：A.A distribution of Tregs in TILs is reversely associated with CD39+ with CD73+ Tregs；B.A distribution of CD39+ Tregs and CD39+ with CD73+ Tregs was significant different in TIL and NIL.

圖2 結(jié)直腸癌及其癌旁正常組織中CD4+CD25+CD127low細(xì)胞群體及其表面CD39、CD73分子的表達(dá)情況Figure 2 A distribution of tumor infiltrating CD4+，CD25+ and CD127low lymphocyte in colorectal cancerNote：A.cancer-adjacent normal；B.tissue specimens.

2.4 Th17及Tc17在結(jié)直腸癌TIL中的分布情況及其與CD39+CD73+Treg的關(guān)系

如圖3所示，Th17(圖3A)及Tc17(CD8+IL-17+)在TIL的分布情況。如圖3C所示，CD39+CD73+Treg與Th17顯著相關(guān)(r=0.517，P<0.05)。初步提示CD39+CD73+Treg與腫瘤局部Th17介導(dǎo)的炎癥直接相關(guān)。

圖3 Th17及Tc17在結(jié)直腸癌中TIL中的分布情況，及其與CD39+CD73+Treg的關(guān)系Figure 3 The distribution of Th17 and Tc17 in TIL of colorectal cancer and its relationship with CD39+ with CD73+ TregNote：A distribution shows the tumor infiltrating Th17(A)and Tc17(B)lymphocyte in colon cancer tissue specimens.The percentage of CD39+ and CD73+ Treg is linearly association in Th17 cells(r=0.517，P<0.05).

3 討論

本文分析了結(jié)直腸癌腫瘤浸潤(rùn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以CD39+CD73+為標(biāo)記的腺苷通路的作用：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腫瘤中的數(shù)量要高于其在相近的癌旁正常組織中的數(shù)量，CD39+CD73+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)數(shù)量顯著低于其在癌旁正常組織中的數(shù)量；并且調(diào)節(jié)性T細(xì)胞總的數(shù)量與CD39+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)性相關(guān)(r=-0.489)，腫瘤浸潤(rùn)的CD39+CD73+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量與腫瘤中浸潤(rùn)的Th17數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.517)，初步提示了CD39+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生物學(xué)行為——腫瘤中浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量較多，但其CD39+CD73+比率較低，且二者有負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，代表著CD39+CD73+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群體與其之外的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群體有著顯著不同的生物學(xué)特性，本研究推測(cè)CD39+CD73+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能抑制效應(yīng)性T細(xì)胞，遏制其對(duì)腫瘤的攻擊作用，并促進(jìn)了Th17細(xì)胞的招募、聚集，分泌VEGF及IL6等分子，促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移；而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中非CD39+CD73+亞群，其功能可能與抑制腫瘤微環(huán)境中的炎性細(xì)胞為主，可能會(huì)對(duì)患者的預(yù)后起到保護(hù)作用。并且，本研究將腫瘤中浸潤(rùn)的CD39+CD73+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與臨床參數(shù)之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中低分化及更低的患者術(shù)前中性粒細(xì)胞絕對(duì)值與淋巴細(xì)胞絕對(duì)值的比值存在顯著關(guān)聯(lián)，更加印證了我們之前對(duì)其生物學(xué)行為的推測(cè)。

既往多項(xiàng)研究都認(rèn)定結(jié)直腸腫瘤中浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在結(jié)直腸癌中有著較為確定的保護(hù)性預(yù)后意義，但其具體機(jī)制僅存在假說(shuō)支持，我們既往研究數(shù)據(jù)已證實(shí)此假說(shuō)可能成立[13]。在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞諸多抑制功能中，CD39-CD73-腺苷通路的相關(guān)研究報(bào)道尚少，我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)觀察到了結(jié)直腸癌腫瘤浸潤(rùn)的CD39+CD73+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群存在著強(qiáng)烈的潛在預(yù)后不良趨勢(shì)，提示我們不可僅僅將結(jié)直腸癌腫瘤中浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞加以保護(hù)，依賴(lài)其對(duì)腫瘤局部破潰的表面發(fā)揮抗炎作用，而需要對(duì)其中的CD39+CD73+群體進(jìn)行特異性抑制，方有可能遏制結(jié)直腸癌的局部進(jìn)展及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

本文以腫瘤免疫為切入點(diǎn)，探究腫瘤微環(huán)境中淋巴細(xì)胞亞群對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的指導(dǎo)意義及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)作為間接證據(jù)，寄希望于為當(dāng)前的TNM指導(dǎo)預(yù)后方式進(jìn)化為T(mén)NM結(jié)合腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞多個(gè)亞群數(shù)量及比例的綜合評(píng)分模式，即TNM-Immunology，提供數(shù)據(jù)支持及理論依據(jù)。本文寄希望于一方面可以為結(jié)直腸癌的預(yù)后提供腫瘤免疫學(xué)證據(jù)，另一方面可能為結(jié)直腸癌從基礎(chǔ)研究、臨床轉(zhuǎn)化研究到臨床研究提供可干預(yù)靶點(diǎn)，突破現(xiàn)有的化學(xué)藥品及靶向藥物的治療瓶頸。

1 Siegel RL，Miller KD，F(xiàn)edewa SA，et al.Colorectal cancer statistics，2017[J].CA Cancer J Clin，2017，67(3)：177-193.

2 Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015[J].CA Cancer J Clin，2016，66(2)：115-132.

3 Donnem T，Kilvaer TK，Andersen S，et al.Strategies for clinical implementation of TNM-Immunoscore in resected nonsmall-cell lung cancer[J].Ann Oncol，2016，27(2)：225-232.

4 Takeuchi Y，Nishikawa H.Roles of regulatory T cells in cancer immunity[J].Int Immunol，2016，28(8)：401-409.

5 Ibrahim EM，Al-Foheidi ME，Al-Mansour MM，The prognostic value of tumor-infiltrating lymphocytes in triple-negative breast cancer：a meta-analysis[J].Breast Cancer Res Treat，2014，148(3)：467-476.

6 Singh M，Loftus T，Webb E，et al.Minireview：Regulatory T cells and ovarian cancer[J].Immunol Invest，2016，45(8)：712-720.

7 Zhuo C，Xu Y，Ying M，et al.FOXP3+Tregs：heterogeneous phenotypes and conflicting impacts on survival outcomes in patients with colorectal cancer[J].Immunol Res，2015，61(3)：338-347.

8 Shang B，Liu Y，Jiang SJ，et al.Prognostic value of tumor-infiltrating FoxP3+ regulatory T cells in cancers：a systematic review and meta-analysis[J].Sci Rep，2015，14(5)：15179.

9 Renner K，Singer K，Koehl GE，et al.Metabolic hallmarks of tumor and immune cells in the tumor microenvironment[J].Front Immunol，2017，8(8)：248.

10 Solinas C，Pusole G，Demurtas L，et al.Tumor infiltrating lymphocytes in gastrointestinal tumors：Controversies and future clinical implications[J].Crit Rev Oncol Hematol，2017，110：106-116.

11 Allard B，Longhi MS，Robson SC，et al.The ectonucleotidases CD39 and CD73：Novel checkpoint inhibitor targets[J].Immunol Rev，2017，276(1)：121-144.

12 de Oliveira Bravo M，Carvalho JL，Saldanha-Araujo F.Adenosine production：a common path for mesenchymal stem-cell and regulatory T-cell-mediated immunosuppression[J].Purinergic Signal，2016，12(4)：595-609.

13 Wang DL，Liu YY，Gu YL，et al.Increased number of forkhead box P3+ tumor-infiltrating lymphocytes correlates with high preoperative albumin level and better survival in patients with stage Ⅱ or Ⅲ colorectal cancer[J].Tumour Biol，2015，36(7)：5407-5414.

(收稿：2017-01-09)

Clinical significance of CD39 CD73 subsets and both of them positive subgroups of regulatory T cells in the microenvironment of colorectal cancer

WANGDongliang1，QINing1，MUGuannan2，ZHANGYuegui2

1.Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China；2.Harbin Medical University Cancer Institute

Objective The objectives of this study were to investigate the clinical significance of CD39，CD73，double positive subgroups for CD39 and CD73，and other lymphocytes with clinicopathological parameters in the microenvironment of colorectal cancer.Methods Tumor infiltrating lymphocyte(TIL)was collected from 24 patients with colorectal cancer after radical resection.The expression of CD39+，CD73+or CD39+with CD73+in T cells were measured by flow cytometry.The association between these subgroups and clinicopathologic parameters was analyzed.Results The CD73+and CD39+with CD73+subgroups were associated with lymph node metastasis and poor degree of differentiation，and this mechanism was closely related to tumor-associated inflammation.Conclusion CD39+with CD73+colorectal tumor infiltration Treg has a more unique biological activity than other Treg group.This study provides a new idea and theoretical basis for predicting the prognosis of colorectal cancer.

Colon cancer；Tumor-infiltrating lymphocyte；Regulatory T lymphocyte ；CD39；CD73

(收稿：2017-02-08)

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究(面上)項(xiàng)目計(jì)劃(12541485)

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(哈爾濱 150081)；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所

王東亮，男，(1981-)，博士，主治醫(yī)師，從事惡性腫瘤的免疫治療及綜合治療的研究。

王東亮，E-mail：drwangdl@139.com

R574.62

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.04.008