李仕亮 徐 雷 邵國(guó)安 孫紛紛 孫林庸 薛 軍

TRa1基因轉(zhuǎn)錄后小片段P28、P43在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及臨床意義

李仕亮1徐 雷2邵國(guó)安2孫紛紛3孫林庸4薛 軍5

目的 分析TRa1基因轉(zhuǎn)錄后小片段P28、P43在甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)組織中的表達(dá)水平及其與臨床病理的關(guān)系。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RT-PCR)和凝膠電泳法分別擴(kuò)增目的片段和分離不同片段的條帶，再利用紫外透射分析儀掃描各條帶的光密度來(lái)檢測(cè)31例PTC組織及癌旁組織中Mt-P28、Mt-P43的表達(dá)情況。結(jié)果 甲狀腺癌組Mt-P28平均灰度值(0.77±0.34)明顯高于癌旁組(0.31±0.18)；Mt-P43平均灰度值(0.85±0.21)明顯高于癌旁組(0.34±0.15)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Mt-P28表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期無(wú)關(guān)(P>0.05)；Mt-P43表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)而與臨床分期有關(guān)(P<0.05)。Mt-P28與Mt-P43兩者表達(dá)水平不具有相關(guān)性(r=0.266，P=0.071)。結(jié)論 Mt-P28、Mt-P43表達(dá)水平的升高傾向于病變惡性程度更高，對(duì)預(yù)測(cè)PTC不良預(yù)后有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，兩種因子對(duì)于PTC的預(yù)防和治療有指導(dǎo)意義。

甲狀腺乳頭狀癌；Mt-P28；Mt-P43；RT-PCR

近年流行病學(xué)調(diào)查顯示甲狀腺癌發(fā)病率越來(lái)越高[1]，據(jù)加拿大癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示自2002年以來(lái)加拿大女性中，甲狀腺癌以每年7%的速度穩(wěn)定增長(zhǎng)[2]。2012年中國(guó)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)報(bào)告[3]顯示我國(guó)甲狀腺癌發(fā)病率已上升至女性惡性腫瘤的第三位。文獻(xiàn)報(bào)道[4]甲狀腺激素受體(Thyroid hormone receptors，TR)在甲狀腺良惡性腫瘤中表達(dá)不同，TR有TRɑ(c-erbAɑ)和TRβ(c-erbAβ)兩種亞型，這兩種亞型又可分為多種異形體，TRɑ1是甲狀腺激素受體TR的一種主要的異形體。前期研究[4]發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)就存在甲狀腺激素受體(Mitochondrial thyroid hormone receptor，Mt-TR)，包括P28及P43，甲狀腺激素是通過(guò)Mt-TR對(duì)線粒體具有直接調(diào)節(jié)作用。Mt-P28及Mt-P43由TRɑ1轉(zhuǎn)錄后生成，Mt-P28存在于線粒體內(nèi)膜上，在甲狀腺激素作用下可直接激活線粒體的有氧呼吸。Mt-P43存在于線粒體基質(zhì)中，線粒體過(guò)氧化物酶增殖體激活受體和線粒體維甲酸X受體作為輔助蛋白可分別與P43形成異二聚體，與線粒體三碘甲狀腺原氨酸(T3)反應(yīng)元件結(jié)合，參與甲狀腺激素對(duì)線粒體的基因轉(zhuǎn)錄和線粒體生成等的調(diào)節(jié)[6]。為此研究人類甲狀腺癌中Mt-P28和Mt-P43的表達(dá)情況及其臨床病理的關(guān)系對(duì)于預(yù)防及治療甲狀腺惡性腫瘤具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取31例甲狀腺乳頭狀癌的新鮮組織標(biāo)本，手術(shù)標(biāo)本取自于新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院2013—2015年間手術(shù)切除并經(jīng)常規(guī)病理診斷證實(shí)的甲狀腺乳頭狀癌及其癌旁組織(距癌組織>10 mm)。所有臨床資料均完整，其中男性9例，女性22例，年齡22～69歲，平均45.7歲。本研究通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)及所有標(biāo)本均獲得患者的知情同意。

1.2 材料

凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一生產(chǎn)廠)、TRNzoI Universal Reagent、瓊脂糖生物試劑、GOIdenViewTM、6×DNA loading Buffer、Marker I均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)均購(gòu)自德國(guó)羅氏生物有限公司；Mt-P28 mRNA及Mt-P43 mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)均采用新鮮標(biāo)本，RT-PCR檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)(表1)。

表1 引物Mt-P28、Mt-P43、β-actin的堿基序列

1.3 方法

方法按照Roche公司使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書進(jìn)行總RNA反轉(zhuǎn)錄，步驟如下：(1)dT，1 μL；(2)Reaction Buffer，4 μL；(3)Rnase Inhibitor，0.5 μL；(4)dNTP，2 μL；(5)RT，0.5 μL；(6)Total RNA，500 ng。加ddH2O補(bǔ)到總體積為20 μL，輕輕混勻，離心15 s，置于PCR儀中，反應(yīng)條件如下：(1)55℃ 30 min，1個(gè)循環(huán)；(2)85℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；(3)反應(yīng)后產(chǎn)物置于﹣20℃保存。使用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)進(jìn)行RT-PCR；置于實(shí)時(shí)PCR儀中，將收集純化后的DNA樣品進(jìn)行定量，按照8倍梯度稀釋的方法，稀釋成8支管，每管各取2 μL DNA作為模板，以Mt-P28、Mt-P43及β-actin為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：(1)2×Taq PCR MasterMix，6 μL；(2)上游引物，1 μL；(3)下游引物，1 μL；(4)cDNA模板，2 μL。將以上物質(zhì)輕輕混勻后加入ddH2O補(bǔ)到20 μL后放入200 μL PCR管中，離心20 s，置于普通PCR儀器中，反應(yīng)條件為：(1)95℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；(2)60℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)；(3)反應(yīng)后產(chǎn)物置于4℃保存。

1.4 結(jié)果判定

采用紫外透射分析儀掃描各條帶的光密度，以Mt-P28及Mt-P43的光密度值與β-actin基因的光密度值之比為相互間進(jìn)行比較的參數(shù)。以癌旁正常組織參數(shù)的平均值為標(biāo)準(zhǔn)，≥平均范圍為此基因表達(dá)升高，<正常范圍為基因表達(dá)下降，未出現(xiàn)條帶為基因缺失。用去離子水做為陰性對(duì)照。使用Quantity-One軟件，計(jì)算各個(gè)樣本Mt-P28及Mt-P43表達(dá)水平，表達(dá)量的相對(duì)值=目的擴(kuò)增條帶的灰度值/β-actin基因擴(kuò)增條帶的灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)所整理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)情況對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)；對(duì)臨床病理因素間的關(guān)系進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn)；對(duì)兩因子采用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 31例甲狀腺癌Mt-P28、Mt-P43在甲狀腺癌組和癌旁組的表達(dá)情況

采用Image J軟件對(duì)各條帶進(jìn)行灰度檢測(cè)，31

例甲狀腺癌組Mt-P28平均灰度值(0.77±0.34)明顯高于癌旁組(0.31±0.18)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Mt-P43平均灰度值(0.85±0.21)明顯高于癌旁組(0.34±0.15)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 Mt-P28、Mt-P43凝膠電泳圖Figure 1 Electrophoresis of Mt-P28 and Mt-P43Note：lane 1 is the Maker；A.Thyroid tissue adjacent to carcinoma；B.Thyroid carcinoma tissue.

2.2 Mt-P28表達(dá)水平與臨床病理間的關(guān)系

Mt-P28表達(dá)水平與甲狀腺癌的性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期無(wú)關(guān)(P>0.05)(表2)。

表2 Mt-P28表達(dá)水平與臨床病理間的關(guān)系

2.3 Mt-P43表達(dá)水平與臨床病理間的關(guān)系

Mt-P43表達(dá)水平與甲狀腺癌的性別、年齡、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)；與甲狀腺癌的臨床病理分期有關(guān)(P<0.05)(表3)。

表3 Mt-P43表達(dá)水平與臨床病理間的關(guān)系

2.4 31例甲狀腺癌中Mt-P28與Mt-P43的Spearman分析

使用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，對(duì)PTC組織中Mt-P28與Mt-P43表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)Mt-P28與Mt-P43表達(dá)水平兩者不相關(guān)(r=0.266，P=0.071)(表4)。

表4 31例甲狀腺癌組織中Mt-P28與Mt-P43的線性關(guān)系

3 討論

近年來(lái)甲狀腺疾病呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，文獻(xiàn)顯示[7]全球超過(guò)十分之一的人口可能因甲狀腺結(jié)節(jié)(Thyroid nodule，TN)受到不同程度的困擾。在所有的TN中約4.5%～5.0%為惡性TN[8]，因此甲狀腺癌患者基數(shù)龐大，為此尋找治療甲狀腺癌的臨床治療靶點(diǎn)尤為重要。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[9]人體各組織中不同亞型的TR均有廣泛表達(dá)，但不同的亞型在不同的組織中存在差異。TRɑ的主要功能是調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育及新陳代謝，并維持甲狀腺功能的正常。其中TRα1起主要作用。1995年Wrutniak等[10]研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素受體TRα1轉(zhuǎn)錄后的兩個(gè)小截?cái)嗥嬖谟诰€粒體中，其分子量分別為43 KDa(P43)和28 KDa(P28)，統(tǒng)稱為線粒體甲狀腺激素受體。

Mt-P28與T3核受體TRα1相比分子鏈稍短[11]，是因?yàn)镻28是從mRNA鏈上第442個(gè)核苷酸開始翻譯的，因此與TRα1相比，P28缺少A/B區(qū)和DNA結(jié)合域，但其對(duì)核受體T3的親和力卻更強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Mt-P28 mRNA在甲狀腺癌任何組織中均有表達(dá)，但在癌組織中表達(dá)水平明顯升高。并與甲狀腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期關(guān)系密切。但目前對(duì)于Mt-P28在甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展中的具體功能尚不清楚。多數(shù)研究[12-14]只是初步印證Mt-P28在人類多種腫瘤中亦呈高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)程度與患者臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，盡管我們的實(shí)驗(yàn)未能與前期研究結(jié)果保持高度一致，但考慮到本實(shí)驗(yàn)研究樣本量太少，結(jié)果出現(xiàn)一定偏差也在合理范圍內(nèi)，有待后續(xù)加大樣本量來(lái)進(jìn)行深入研究。

Mt-P43也是一種廣泛表達(dá)的線粒體T3受體[4]，但其在核內(nèi)未被檢出，其與T3的結(jié)合力不亞于核受體TRα1，但要弱于Mt-P28。原因在于Mt-P43有DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域，與TRα1相比只缺乏A/B區(qū)。Chocron等[15]研究發(fā)現(xiàn)線粒體甲狀腺素受體(Mt-P43)能調(diào)高線粒體轉(zhuǎn)錄和線粒體生物合成。Casas等[16]報(bào)道Mt-P43是一個(gè)強(qiáng)有力的T3依賴性線粒體基因轉(zhuǎn)錄因子，其在T3存在下可迅速激活線粒體RNA多聚酶，進(jìn)而激活線粒體基因的早期轉(zhuǎn)錄，使線粒體RNAs水平增加，線粒體相應(yīng)蛋白合成增加，從而促進(jìn)線粒體生成。本研究也表明Mt-P43在甲狀腺癌組織中比癌旁組織表達(dá)水平明顯升高，且與甲狀腺癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能揭示MT-P43表達(dá)增強(qiáng)的組織代謝相對(duì)活躍，導(dǎo)致生物學(xué)惡性度增高。

本研究在對(duì)Mt-P28和Mt-P43做進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間并不具有相關(guān)性，但考慮到目前對(duì)兩者在甲狀腺癌發(fā)生中的具體功能機(jī)制并不清楚，所以并不能排除兩者之間沒有任何關(guān)聯(lián)。由于本研究樣本總數(shù)較少，對(duì)于兩者之間的相互關(guān)系還需大樣本研究進(jìn)行深入探討。

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(收稿：2016-12-10)

Expression and clinical significance of small fragments of P28 and P43 in papillary thyroid carcinoma after TRa1 gene transcription

LIShiliang1，XULei2，SHAOGuoan2，SUNFenfen3，SUNLinyong4，XUEJun5

1.Department of Thyroid and Breast Surgery，The Panzhihua General Hospital of Panzhihua Iron and Steel Group，Panzhihua 617000，China；2.Department of Thyroid and Breast Surgery，The Fifth Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University；3.Department of Kidney Internal Medicine，The Panzhihua General Hospital of Panzhihua Iron and Steel Group；4.Department of Pathology，The West China Hospital；5.Department of Pathology，The Linfen people′s Hospital

Objective The objective of this study was to investigate the expression of P28 and P43 in papillary thyroid carcinoma(PTC)and its relationship with clinicopathological features after TRa1 gene transcription.Methods Real-time fluorescence quantitative PCR(RT-PCR)and gel electrophoresis were used to determine the target fragments and to isolate the bands of different fragments.The optical density of each band was scanned by UV transmittance analyzer to detect 31 cases of PTC tissue and expression levels of P28 and P43 in para-cancerous tissues.Results The average gray value of P28 in thyroid carcinoma group was 0.77±0.34，which was significantly higher than that in para-cancer group(0.31±0.18).The average gray value of P43(0.85+0.21)in thyroid carcinoma group was significantly higher than that in para-cancer group(0.34±0.15)(P<0.05).The expression levels of P28 were not correlated with gender，age，tumor size，lymph node metastasis and clinical pathologic stage(P>0.05)，The expression levels of P43 were not correlated with gender，age，tumor size and lymph node metastasis.(P>0.05)but they were related to clinical pathologic stage(P<0.05).There was no correlation between expression levels of P28 and P43(r=0.266，P=0.071).Conclusion The increased expression of P28 and P43 may have a high degree of malignancy and a certain clinical value in predicting the adverse prognosis of PTC.Both factors are helpful for the prevention and treatment of PTC.

Papillary thyroid carcinoma；P28；P43；RT-PCR

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012221A050)

1.攀枝花攀鋼集團(tuán)總醫(yī)院甲狀腺乳腺外科(攀枝花 617000)；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科； 3.攀枝花攀鋼集團(tuán)總醫(yī)院腎內(nèi)科；4.華西醫(yī)院病理科；5.臨汾市人民醫(yī)院病理科

李仕亮，男，(1987-)，碩士，住院醫(yī)師，從事腫瘤基礎(chǔ)與臨床的研究。

李仕亮，E-mail：1002679824@qq.com

R736.1

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.04.002