李煥，于童，馬洋洋，王華巖

西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院動物生物技術(shù)系 陜西省干細胞工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100

層粘連蛋白基因家族在豬多能干細胞中的表達譜分析

李煥，于童，馬洋洋，王華巖

西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院動物生物技術(shù)系 陜西省干細胞工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100

李煥, 于童, 馬洋洋, 等. 層粘連蛋白基因家族在豬多能干細胞中的表達譜分析. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(8): 1304–1314.

Li H, Yu T, Ma YY, et al. Expression of Laminin gene family in porcine pluripotent stem cells. Chin J Biotech, 2017, 33(8):1304–1314.

層粘連蛋白 (Laminin) 是細胞外基質(zhì)的重要成分，對細胞生長、分化、運動、組織修復(fù)和再生等發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Laminin包括有A1-5、B1-4和C1-3共12個編碼基因，以不同的表達模式發(fā)揮功能。其中Laminin A5作為可以支持多能細胞生長的重要基因，得到廣泛研究。但是，在所有豬相關(guān)數(shù)據(jù)庫中，均未能查到Laminin A5的信息。文中通過生物信息學(xué)分析，首次確認了豬Laminin A5的存在，并進行了克隆和測序驗證。為揭示Laminin基因家族在豬誘導(dǎo)多能干細胞 (iPSCs) 中的表達特性，檢測了Laminin在豬各組織、體細胞和iPS細胞中的不同表達模式。發(fā)現(xiàn)Laminin B1基因在豬多能干細胞中存在特異性可變剪接體 (LAMB1-a)，且該可變剪切體的表達量與豬多能干細胞的重編程程度呈正相關(guān)。為進一步揭示和利用Laminin作為細胞外基質(zhì)，用于豬多能干細胞的獲取和培養(yǎng)優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

豬多能干細胞，層粘連蛋白，LAMA5，表達模式分析

誘導(dǎo)多能干細胞 (Induced pluripotent stem cells，iPSCs，iPS細胞) 可以分化為體內(nèi)各種成體細胞，進而形成機體各種組織和器官[1]。因此，iPS細胞的研究不僅具有重要的理論意義，而且在組織再生、修復(fù)和疾病治療方面具有廣泛的價值。細胞外基質(zhì) (Extracellular matrix，ECM)是由細胞合成和分泌的生物大分子，具有支持和連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細胞的生理活動等功能[2-3]。有研究表明，特定 ECM 形成的微環(huán)境可以支持iPS細胞的生長，培養(yǎng)體系中添加這類ECM對iPS細胞的生長和多能性維持具有關(guān)鍵作用[4]。此外，采用無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系，可以避免飼養(yǎng)層細胞帶來的外源因素的干擾[2,5]。目前，商品化的ECM包括Matrigel、層粘連蛋白、纖粘連蛋白、膠原等已經(jīng)廣泛應(yīng)用到無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中[6]，部分已被驗證有利于人和小鼠iPS細胞的獲取和培養(yǎng)[7-8]。豬和人在生理和代謝上具有極高的相似性，是理想的可應(yīng)用于疾病和再生醫(yī)學(xué)研究的模式動物[9]，因此，獲得真正的豬iPS細胞將具有十分重要的意義。豬iPS細胞的獲取和培養(yǎng)多參考人和小鼠相關(guān)體系，但獲得的豬 iPS細胞無法達到原始態(tài)(Na?ve state)。因此，探索并發(fā)現(xiàn)適宜的培養(yǎng)體系對于獲得完全重編程的豬iPSCs有重要意義。

層粘連蛋白家族 (Laminin，LN) 是一類參與形成組織細胞基底膜的重要大分子非膠原性糖蛋白，是 ECM 的重要組成部分[10]。完整的LN蛋白由3種肽鏈 (α、β、γ) 形成十字架樣結(jié)構(gòu)的異源三聚體，其中α鏈有5種亞型，β鏈有4種亞型，γ鏈有3種亞型，分別由不同的基因編碼，發(fā)揮不同的功能。目前，通過對小鼠和人層粘連蛋白的研究已確定存在 18種不同的LN組合[11-12]。LN蛋白可以改變細胞的表型，引導(dǎo)細胞向不同的方向分化[13]，對于早期胚胎發(fā)生、各種組織的形成和功能的完善發(fā)揮重要作用[14-15]。其中，LAMA5作為在小鼠和人各組織中廣泛表達的基因，與其他亞基的特定組合，如 Laminin-511 (由 LAMA5、LAMB1和 LAMC1組成)，可以作為支持人iPS細胞生長的關(guān)鍵基質(zhì)[16-17]，并且維持其不分化狀態(tài)[18-19]。因此我們推測，恰當?shù)腖N組合也可以對豬iPS細胞的分離和建系發(fā)揮作用。然而，豬LAMA5的研究仍未見報道，甚至在 NCBI和 UCSC相關(guān)基因組數(shù)據(jù)庫中也沒有相關(guān)序列的注釋。

為明確豬iPS細胞中LN的表達情況，我們對豬組織、細胞和建系iPS細胞中的LN表達進行了檢測，展示了 LN的時空表達情況。通過生物信息學(xué)分析和同源序列比對，確認了豬 LAMA5基因的存在，克隆了豬LAMA5基因部分序列，并進行了測序鑒定。此外，我們還發(fā)現(xiàn)豬 iPS特異表達的LAMB1基因存在可變剪接體 (LAMB1-a)。本文初步揭示了豬 LN基因表達特性，為優(yōu)化豬iPS細胞培養(yǎng)體系和鑒定方法提供了新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、載體和組織樣品

大腸桿菌 Stellar感受態(tài)細胞由陜西省干細胞工程技術(shù)研究中心保存。pGEM-T Easy載體購自 Promega公司。豬各組織樣品采自動物試驗站飼養(yǎng)的八眉黑豬30日齡保育豬。

1.2 試劑和耗材

限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4 DNA連接酶、2×Taq MasterMix (Dye) 購自CWBIO公司；總RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA marker購自天根公司 (北京)；細胞培養(yǎng)基 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)、非必需氨基酸、谷氨酰胺購自Invitrogen (美國)；胎牛血清 (FBS) 購自Hyclone；PCR引物 (表1)由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.3 反轉(zhuǎn)錄 PCR檢測豬組織和細胞中 Laminin的表達

引物設(shè)計利用Primer Blast在線軟件進行，以已知豬Laminin的RNA參考序列為模板 (表1)，進行全轉(zhuǎn)錄組比對后得到的目標基因特異性引物序列。為方便擴增，引物的設(shè)計盡量使 Tm值在60 ℃左右，引物序列長度設(shè)定為20 bp，最終通過試驗篩選確認各基因引物。從成年豬睪丸、腦、肝、胃、心、肺組織、卵巢顆粒細胞，以及原代分離的脂肪細胞、肝臟細胞、成纖維細胞、豬iPS細胞和不同培養(yǎng)條件下的DOX-iPS細胞中提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR方法 (94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min ；35 個循環(huán)) 檢測LN的表達情況。

1.4 數(shù)據(jù)庫搜索和生物信息學(xué)分析

豬iPS細胞系piPS-g和豬胎兒成纖維細胞PEF的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均來自本實驗室[20]，豬早期胚胎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自韓建永課題組之前發(fā)表的文章[21]。數(shù)據(jù)使用 RPKM+1，并利用 Excel制作柱狀圖呈現(xiàn)。為了確定豬LAMA5基因，選取人、牛和羊的已知LAMA5基因組序列作為預(yù)測模板，通過分析LAMA5上下游基因的排列順序，將豬LAMA5基因定位于RPS21與CABLES2之間的序列區(qū)域。最終，通過GeneWise基因在線預(yù)測工具 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/genewise/) 利用已知的人和牛的蛋白序列與豬 RPS21和CABLES2基因之間的DNA序列進行逆向比對，從而對豬 RPS21和 CABLES2之間是否存在LAMA5基因進行預(yù)測。

1.5 豬LAMA5和LAMB1基因的克隆和鑒定

根據(jù)預(yù)測到的兩種豬LAMA5蛋白序列進行差異比對，跨差異區(qū)域進行豬LAMA5基因的引物設(shè)計，并分別命名為 pc-LAMA5-1和 pc-LAMA5-2(表1)。隨后，以豬iPS細胞總RNA制備的cDNA為模板，利用引物pc-LAMA5-1、pc-LAMA5-2和pc-LAMB1進行 RT-PCR擴增。將獲得的目的片段克隆到 pGME-T Easy載體并經(jīng)酶切鑒定，確認酶切產(chǎn)物片段大小符合預(yù)期后，將質(zhì)粒送往西安擎科生物技術(shù)有限公司測序。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.6 細胞的獲取和培養(yǎng)

豬成纖維細胞 (PEF) 來源于新生仔豬耳部組織，用高糖 DMEM培養(yǎng)基添加 15% FBS進行培養(yǎng)；豬脂肪細胞來源于仔豬皮下脂肪組織，用DME/F12培養(yǎng)基添加10% FBS培養(yǎng)；豬肝臟細胞來源于仔豬肝臟組織，用高糖DMEM培養(yǎng)基添加10% FBS培養(yǎng)。豬iPS細胞系DOX-iPS細胞由本室誘導(dǎo)獲得[22]，使用高糖DMEM添加15% FBS培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10 ng/mL bFGF、10 ng/mL LIF、10 ng/mL BMP4、3 μmol 的CHIR99021、2 μmol的 SB431542、0.1 mmol/L NEAA、2 mmol/L 谷氨酰胺、0.1 mmol/L β-巰基乙醇，每天換液后以 4 μg/mL添加新鮮配制的Doxycycline，3-4 d后進行胰酶消化傳代。DOX-iPS分化細胞和二代DOX-iPS細胞的獲得見之前研究[22]。豬多能干細胞系piPS (PS11) 由本實驗室誘導(dǎo)獲得[23]，使用 KnockOut-DMEM添加 20% FBS、10 ng/mL bFGF、10 ng/mL LIF、0.1 mmol/L NEAA、2 mmol/L谷氨酰胺、0.1 mmol/L β-巰基乙醇，每天換液，每隔2-3 d胰酶消化傳代。

圖1 豬LN基因在iPS細胞和早期胚胎的表達譜 (A：豬LN基因在PEF和iPS細胞中的表達；B：LN基因在胚胎不同時期的表達)Fig. 1 Porcine LN gene expression in the iPS cells and early embryos. (A) Porcine LN gene expression in PEF and piPS. (B) LN gene expression in different stages of embryos.

2 結(jié)果與分析

2.1 LN基因在豬iPS細胞和早期胚胎中的轉(zhuǎn)錄情況

通過分析豬iPS和PEF細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[1]，我們發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果中缺少LAMA5和LAMC1的信息 (圖1A)。對豬早期胚胎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析也發(fā)現(xiàn)，數(shù)據(jù)中缺少LAMA1、LAMA5和LAMB4的信息 (圖1B)，其原因是豬LN基因家族的注釋尚不完全。對細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞中轉(zhuǎn)錄較為活躍的LAMA4基因，在細胞重編程完成后有所下調(diào)；LAMB1和LAMB2在豬iPS細胞中也有所下調(diào)，但LAMB1在豬iPS細胞中仍占有主要地位，與人多能干細胞中LAMB1高表達的情況類似 (圖 1A)。對胚胎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，豬LN的表達在桑葚胚期前后存在明顯的界限。在卵母細胞至 8細胞時期，LAMB1、LAMC1和LAMC3呈現(xiàn)高表達，且隨著發(fā)育過程逐漸減少，表明這 3個基因可能為母源基因，在豬胚胎阻滯期之前發(fā)揮重要的發(fā)育調(diào)控作用。在桑葚胚時期，所有LN均呈現(xiàn)低表達情況，說明阻滯期過后，母源RNA利用殆盡。之后的囊胚期，LAMB1、LAMB3、LAMC1和LAMC3重新上調(diào)，預(yù)示這些基因作為早期合子激活基因，對胚胎進一步分化和發(fā)育發(fā)揮重要調(diào)控作用 (圖1B)。

2.2 豬 LAMA5基因序列的預(yù)測、鑒定和同源分析

LAMA5基因在大多數(shù)物種中都有報道或注釋，但是，UCSC和NCBI序列數(shù)據(jù)庫中沒有豬LAMA5相關(guān)序列和注釋。以人 (NM_005560.4)、牛 (XM_019972687.1)、羊 (XM_018057585.1) 的LAMA5基因RNA區(qū)段序列為模板，利用BLAST和BLAT對豬基因組整合序列 (Sscrofa10.2) 進行比對，也未找到相似的序列 (圖2A)。我們推測，豬LAMA5基因序列無法查找可能有兩個原因：1) 豬基因組數(shù)據(jù)庫 (Sscrofa10.2) 的內(nèi)容不夠完整，而LAMA5的信息恰好位于缺失的序列當中；2) 豬在進化中發(fā)生了 LAMA5基因的丟失。因此，我們選擇牛第13號染色體上LAMA5基因組上游的SS18L1/LSM14B和下游的RPS21/CANLES2兩對基因為位置參照，與豬基因組序列進行了比對。結(jié)果表明，豬17號染色體上有上述基因的相鄰分布，且在SS18L1和RPS21之間有一段80 kb的序列中存在序列缺口(Gap)。

2016年12月6日，最新的豬基因組數(shù)據(jù)庫(Sscrofa11.1) 更新并上傳至NCBI網(wǎng)站的Assembly數(shù)據(jù)庫。在豬17號染色體SS18L1和RPS21之間的序列增加至 168 kb，且新序列中不再有序列缺口 (圖2A)。利用GeneWise在線預(yù)測軟件，將人 LAMA5蛋白序列 (XP_006723859.1) 與186 kb豬基因組序列進行逆向比對 (GeneWise軟件提供的逆翻譯算法，可將蛋白序列逆翻譯為可變RNA序列，并與提供的基因組DNA序列進行比對)，預(yù)測到一段 11 363 bp的同源mRNA序列，并將之命名為 P1；與牛 LAMA5蛋白序列 (XP_014333141.1) 比對預(yù)測到一段11 750 bp的同源mRNA序列，將之命名為P2。將P1和P2序列進行同源性比對，兩者之間存在3個差異區(qū)段。將跨P1、P2間最大的差異區(qū)段進行引物設(shè)計 (圖2B)，經(jīng)RT-PCR擴增并進行電泳檢測，獲得了731 bp的F-1和839 bp的F-2條帶(圖2C)?？寺-1片段進行DNA測序，與預(yù)測序列P2相符。據(jù)此，將獲得的LAMA5基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫 (Accession No. KY622023)。

2.3 豬LN在組織和細胞中表達情況分析

采用RT-PCR檢測LN在豬各種組織 (圖3A)中的表達情況發(fā)現(xiàn)，LN在不同組織細胞中具有不同的表達水平，其中LAMA5和LAMC1在各組織中廣泛表達，LAMA1在腦、卵巢和睪丸中高表達；LAMA2在肝組織中未見表達；LAMA3在肺、腦中高表達。LAMA4在卵巢顆粒細胞組織未見表達。LAMB1在心臟未見表達。LAMC2僅在腦和卵巢顆粒細胞有表達。LAMC3在腦和睪丸中有表達。RT-PCR檢測細胞中LN的表達和細胞 (圖3B–C)。相較于組織，細胞LN的表達更加特異，在肝細胞中只有 LAMA5、LAMB3和LAMC1表達。脂肪細胞和 PEF中 LAMA4、LAMA5、LAMB1、LAMB2和 LAMC1高表達。檢測中還發(fā)現(xiàn)LAMB1只在多能細胞豬iPS中出現(xiàn)兩條特異性條帶。

圖2 豬LAMA5基因的預(yù)測和分子克隆 (A：人、牛、羊和豬LAMA5基因的定位；B：豬LAMA5基因預(yù)測；C：豬LAMA5基因RT-PCR產(chǎn)物F-1 (720 bp) 和F-2 (839 bp)；D：豬LAMA5克隆產(chǎn)物EcoRⅠ酶切結(jié)果)Fig. 2 Porcine LAMA5 gene prediction and molecular cloning. (A) Alignment of LAMA5 and related gene clusters among human, cattle, goat and porcine. (B) Prediction of porcineLAMA5 gene cluster. (C) RT-PCR amplification of porcineLAMA5 F-1 (720 bp) and F-2 (839 bp). (D) Plasmid of porcineLAMA5 clone was digested byEcoR I. M:marker DL2000.

圖3 豬LN的組織和細胞表達譜分析 (A：用RT-PCR檢測豬不同組織中LN的表達；B：實驗中所用細胞圖片；C：用RT-PCR檢測不同細胞中LN的表達. 內(nèi)參選用β-Actin (簡寫為ACTB))Fig. 3 Expression profile of porcine LN. (A) RT-PCR analysis of porcine LN expression in different tissues. (B) Images of cells used in the experiment. (C) RT-PCR analysis of porcine LN expression in different cells. β-Actin: ACTB.

2.4 LAMB1-a的克隆和在多能干細胞中特異性表達

在對LAMB1的檢測中，使用引物pc-LAMB1在除心、胃組織外均檢測到符合預(yù)期的單一條帶(圖3A)。然而在豬iPS細胞中，則檢測到兩個條帶(圖3C)。分別回收兩個條帶，并經(jīng)克隆測序和同源比對驗證，505 bp條帶與 GenBank數(shù)據(jù)庫中的LAMB1-X1 (XM_003130269.4) 序列只有1個堿基差異。新條帶為639 bp，但與GenBank數(shù)據(jù)庫中的LAMB1-X1和LAMB1-X2 (XM_005667736.2)均不相同但具備較高的同源性，因此確認639 bp的產(chǎn)物為LAMB1一個新的可變剪切體，并將其命名為LAMB1-a (圖4A)。為進一步驗證LAMB1-a表達的特異性，對豬PEF、DOX-iPS細胞，以及分化 3 d (-DOX/3D)、5 d (-DOX/5D) 和二代DOX-iPS (2nd+DOX) 等細胞進行了檢測 (圖4B)。結(jié)果表明，PEF細胞中只表達LAMB1，而對豬iPS細胞中LAMB1的擴增則能同時檢測到LAMB1和LAMB1-a (圖4C)。在對分化過程中的DOX-iPS細胞進行LAMB1表達檢測中，我們還發(fā)現(xiàn)，隨著豬iPS的分化，克隆形態(tài)逐漸消失，LAMB1-a的表達也逐漸降低直至檢測不到 (圖4B–C)。對分化的DOX-iPS細胞恢復(fù)DOX-iPS培養(yǎng)條件，并添加Doxycycline進行連續(xù)傳代后，DOX-iPS的克隆形態(tài)逐漸恢復(fù)，同時LAMB1-a再度表達(圖4B–C)。這表明，LAMB1-a與豬iPS細胞的重編程程度存在明確的相關(guān)性。

3 討論

在對小鼠的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)隨著機體的發(fā)育，不同的組織和細胞中LN基因的表達具有不同的時空特性，從而產(chǎn)生不同的LN蛋白組合來行使不同的作用[24]。本研究通過檢測豬組織和細胞中LN的表達情況證明，在不同組織和細胞中LN的表達均有各自的特征。這些結(jié)果表明，LN作為重要的細胞外基質(zhì)存在于豬的整個生命周期和各種組織當中，并有可能參與不同的信號調(diào)控，對豬的生長發(fā)育產(chǎn)生不同的影響。

圖4 豬LAMB1在多能干細胞中的特異表達分析 (A：LAMB1、LAMB1-a和已經(jīng)注釋的LAMB1-X1 (XM_003130269.4)和LAMB1-X2 (XM_005667736.2) 序列同源分析；B：DOX-iPS細胞圖片添加DOX (+DOX, 2nd+DOX) 和撤去DOX 3 d (–DOX/3D)、5 d (–DOX/5D)；C：RT-PCR檢測LAMB1和LAMB1-a在PEF和豬iPS細胞中的表達)Fig. 4 Specific expression of LAMB1 in porcine pluripotent stem cells. (A) Alignment of DNA sequences of LAMB1 and LAMB1-a with published LAMB1-X1 (XM_003130269.4) and LAMB1-X2 (XM_005667736.2). (B) Images of DOX-iPSCs that were treated with (+DOX, 2nd+DOX) and without DOX in 3-day (–DOX/3D) and 5-day (–DOX/5D).(C) RT-PCR analysis of LAMB1 and LAMB1-a in PEF and piPS cells.

卵母細胞發(fā)育過程中，母源 mRNA的積累和編碼的蛋白不僅可以支持卵母細胞到胚胎的發(fā)育，還在合子基因的激活中發(fā)揮重要作用，促使胚胎進一步發(fā)育[25-26]。Elis等[25]發(fā)現(xiàn)，LAMB1和 LAMC1在小鼠早期胚胎發(fā)育階段就可以檢測到，這與豬早期胚胎中LAMB1和LAMC1的表達譜相一致。這些基因隨著胚胎的發(fā)育表達量逐漸減少，到桑葚胚期出現(xiàn)表達量極低的現(xiàn)象。這些基因表達量的下降可能與合子基因未被激活，母源mRNA的消耗、稀釋和降解有關(guān)。到囊胚階段LAMB1、LAMB3、LAMC1和LAMC3表達量再次升高，則說明其可能作為早期的合子激活基因，在隨后的胚胎發(fā)育中具有重要作用。

Domogatskaya等報道，Laminin-511可以使鼠胚胎干細胞在無飼養(yǎng)層條件下保持不分化狀態(tài)達169 d以上[27]。此外Rodin等通過將Laminin-511添加到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)人ES和人iPS細胞，其多能性維持良好，并呈單層分布生長[16,28]?？梢奓aminin-511對人和小鼠多能干細胞多能性的維持具有促進作用。然而，在本文發(fā)表之前，NCBI等數(shù)據(jù)庫中并沒有豬LAMA5基因相關(guān)信息，本研究通過分析最新豬基因組序列數(shù)據(jù)包 (Assembly:Sscrofa11.1)，確認了豬LAMA5基因的存在。同時在檢測中發(fā)現(xiàn)，豬 iPS細胞中也高水平地表達Laminin-511組合，為后續(xù)研究豬Laminin-511是否有利于豬多能性的維持提供了基本條件。

本研究在對豬iPS細胞LN表達情況的檢測過程中，還發(fā)現(xiàn)LAMB1基因在豬多能細胞中出現(xiàn)兩條特異性條帶，經(jīng)過對測序結(jié)果的分析，認定長度為639 bp的條帶是LMAB1的可變剪接體LAMB1-a形式，該剪接體的表達水平與豬iPS細胞的多能性以及重編程程度呈正相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)在小鼠、人和其他物種中均未見報道，因此，這可能是豬多能干細胞與其他物種多能干細胞的一個重要區(qū)別，為豬多能干細胞的研究提供了新的研究方向。

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(本文責編 陳宏宇)

Expression of Laminin gene family in porcine pluripotent stem cells

Huan Li, Tong Yu, Yangyang Ma, and Huayan Wang

Shaanxi Center for Stem Cell Engineering and Technology, College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling 712100,Shaanxi, China

Laminin (LN) proteins are important components of extracellular matrix. These proteins regulate cell proliferation, differentiation, migration, and tissue repair. The LN family has 12 genes that encode 5 α, 4 β, and 3 γ proteins. LamininA5 (LAMA5) as an important gene can support pluripotent cell growth and have been widely studied.However, porcine LAMA5 is absent in all tested porcine genomic databases so far. In this study, we confirmed for the first time the existence of porcine LAMA5 through bioinformatics analysis, and verified this result by cDNA cloning and sequencing. To reveal the expression pattern of Laminin gene family, we detected the expression of Laminin genes in porcine tissues, somatic cells, and porcine induced pluripotent stem cells (piPSCs). The results showed that an alternative splicing variant of Laminin B1 (LAMB1-a) was found exclusively in all tested piPSCs. The expression of this alternative splicing variant is positively correlated with the pluripotent state of piPSCs. The above findings provide evidences and foundations for the father use of LN as extracellular matrix to facilitate the derivation and culture of porcine pluripotent stem cells.

porcine pluripotent stem cells, Laminin, LAMA5, expression pattern

March 12, 2017; Accepted: June 12, 2017

HuayanWang. Tel: +86-29-87080069; E-mail: hhwang101@163.com

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31571521, 31371505).

國家自然科學(xué)基金(Nos. 31571521, 31371505) 資助。