李佳璇，臧明鑫，謝雙羽，姜艷平，崔文，徐義剛，劉敏，喬薪瑗，王麗，周晗，李一經(jīng)，唐麗杰

東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

藍(lán)舌病病毒4型特異性競爭ELISA檢測方法的建立

李佳璇，臧明鑫，謝雙羽，姜艷平，崔文，徐義剛，劉敏，喬薪瑗，王麗，周晗，李一經(jīng)，唐麗杰

東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

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旨在建立藍(lán)舌病病毒4型 (BTV-4) 特異性抗體ELISA檢測方法，為藍(lán)舌病的免疫學(xué)診斷提供新的技術(shù)。利用制備的兩株抗4型BTV VP2蛋白的單克隆抗體4A-1G7和4B-1B6，建立BTV-4特異性競爭ELISA抗體檢測方法。利用該方法同時對 50份羊和牛 BTV陰性血清進(jìn)行檢測，分別確定兩種方法阻斷率臨界值為49%和40%。利用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清檢測的試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的敏感性、特異性和重復(fù)性符合OIE通用標(biāo)準(zhǔn)。同時，4A-1G7和4B-1B6兩種競爭ELISA方法聯(lián)合作用，可以檢測感染4、18和20型BTV的血清。研究結(jié)果為建立以上各型BTV的檢測方法提供了基礎(chǔ)。

藍(lán)舌病病毒，競爭ELISA，單克隆抗體，VP2蛋白

藍(lán)舌病 (Bluetongue，BT) 是一種烈性非接觸性傳染病，主要經(jīng)節(jié)肢動物 (庫蠓和伊蚊等)傳播，可感染反芻動物如牛、綿羊、山羊、鹿、非洲羚羊、駱駝等[1]。世界動物衛(wèi)生組織將其列為必須通報的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[2]。BT廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)。藍(lán)舌病病毒 (Bluetongue virus，BTV) 血清型眾多，目前至少有27個血清型，新發(fā)現(xiàn)的28型和29型還在鑒定中[3-4]。通過BT流行病學(xué)調(diào)查，中國共在31個省、市 (區(qū)) 發(fā)現(xiàn)BTV抗體陽性家畜，并從云南、湖北和安徽等地自然感染羊體中分離獲得 BTV[5]。據(jù)報道，我國已檢測出BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-10、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-20和 BTV-24等 12種血清型[6-7]，目前 BTV-1、BTV-4和BTV-20是廣西優(yōu)勢的血清型，在全區(qū)廣泛分布；而江蘇、內(nèi)蒙古、云南等地區(qū)均檢測到 BTV-1、BTV-7、BTV-10和 BTV-16型，當(dāng)前國內(nèi)BT流行的血清型有了新的變化[8-10]。

BTV是由10個基因片段組成的雙股RNA病毒，分別編碼7個結(jié)構(gòu)蛋白 (VP1-VP7) 和4個非結(jié)構(gòu)蛋白 (NS1、NS2、NS3/NS3a和NS4)[11]。VP2蛋白是BTV外殼蛋白的主要成分，同時是BTV血清型的主要決定因素[12-13]。VP2蛋白為型特異性蛋白，可以用來區(qū)別BTV各血清型間的不同[14]。

競爭ELISA (C-ELISA) 是檢測BTV抗體的一種常用方法[15]。C-ELISA方法可用于多種動物血清抗原檢測，其特異性和敏感性高、成本低，廣泛用于臨床藍(lán)舌病的診斷檢測中[16-17]。本實(shí)驗(yàn)采用針對BTV4型 (BTV-4) VP2蛋白的型特異性單克隆抗體[18]作為競爭性抗體與待檢測抗體競爭，通過抑制率大小來判定樣品血清的來源動物是否感染 BTV，建立了一種快速、敏感的BTV型特異性檢測方法。

1 材料與方法

1.1 單克隆抗體、動物血清與主要試劑

抗BTV-4 VP2的單克隆抗體4A-1G7 (抗體亞類為 IgG1，抗原表位為160NH161)、4B-1B6 (抗體亞類 IgG1，抗原表位為501SRS503)和 BTV-4 VP2-A/B蛋白由本實(shí)驗(yàn)室保存[12]；1-24型BTV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清 (抗體滴度為 1∶640-1∶1 280)及陰性血清購自The Pirbright Institute藍(lán)舌病參考實(shí)驗(yàn)室；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自中杉金橋有限公司；BTV抗體 ELISA試劑盒 (TSI公司) 購自上海雅吉生物科技有限公司；70份血清樣品中5份綿羊、5份山羊和10份牛血清樣品來自于黑龍江的某養(yǎng)殖場，25份綿羊、25份山羊血清樣品來自于內(nèi)蒙古；TMB顯色液購自北京奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 單抗的大量制備及純化

用腹水法大量制備單抗4A-1G7和4B-1B6。將制備的腹水采用 Protein G蛋白純化柱純化(GE公司)。

1.3 優(yōu)化C-ELISA反應(yīng)條件

將 BTV-4 VP2-A/B蛋白分別以 1 μg/孔、2 μg/孔、5 μg/孔、10 μg/孔包被，分別包被 1 h、2 h、3 h；再將純化的單抗 (4A-1G7和4B-1B6的蛋白濃度分別為 4.2 mg/mL和 5.3 mg/mL)用稀釋液稀釋至1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000倍；BTV-4標(biāo)準(zhǔn)陽性血清用PBS稀釋液進(jìn)行 1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320倍稀釋選擇最佳待檢樣品加入量，進(jìn)行矩陣交叉BTV C-ELISA方法檢測，確定最佳稀釋倍數(shù)，將腹水稀釋液和血清樣品混合加入ELISA反應(yīng)板中；同時，反應(yīng)時間分別設(shè)置為1 h、2 h、3 h，確定各步驟最佳反應(yīng)時間。TMB顯色反應(yīng)時間分別為10 min、15 min、20 min，確定最佳顯色時間。根據(jù)優(yōu)化反應(yīng)劑量和時間的結(jié)果，確定該檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。

1.4 血清樣品的鑒定

按照BTV抗體ELISA試劑盒說明書，檢測70份血清樣品，確定樣品血清的來源動物是否感染BTV。

1.5 判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定

利用1.3建立的檢測方法，同時對50份陰性綿羊、山羊和牛陰性血清進(jìn)行檢測，測得血清OD450，計算阻斷率，計算公式為 PI (阻斷率)={1-(ODx-ODmin)/(ODmax-ODmin)}×100% (ODmax為不加樣品時的吸光值，ODx為樣品的吸光值，ODmin為空白對照孔的吸光值)。計算50份血清樣本 PI值的平均值()和標(biāo)準(zhǔn)方差(s)，根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原則，將+2s設(shè)定為樣本的陰、陽性血清的臨界值。樣本的PI值＞+2s時，可以在99.9%的水平上判為陽性。

1.6 特異性試驗(yàn)

利用兩種C-ELISA分別檢測1-24型BTV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及陰性樣品各10份，按照1∶200稀釋倍數(shù)，每孔 100 μL加樣。分別評價基于4A-1G7和4B-1B6的C-ELISA的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)

將 BTV-4標(biāo)準(zhǔn)陽性血清做 1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160 和 1∶320 7 個稀釋度，分別用基于4A-1G7和4B-1B6單抗建立的 C-ELISA檢測不同稀釋度血清，分析該C-ELISA可以檢測到的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的最小稀釋度，判斷該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

選取10份血清，用3次包被的酶標(biāo)板，各進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，計算其變異系數(shù)，評價重復(fù)性。

1.9 臨床樣品的檢測

以1.3方法確定的最佳反應(yīng)條件，以1.5方法確定的阻斷率臨界值為標(biāo)準(zhǔn)，共檢測了20份BTV陽性血清，并與群特異性BTV抗體ELISA試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清樣品的鑒定

經(jīng)BTV群特異性抗體ELISA試劑盒檢測，70份血清樣品中，50份血清樣品檢測結(jié)果為陰性，20份血清為陽性。

2.2 優(yōu)化反應(yīng)條件

反應(yīng)體系及反應(yīng)條件經(jīng)優(yōu)化后試劑的最佳稀釋度和反應(yīng)條件見表 1、2。該批次檢測用抗原PBS稀釋，待檢樣品每孔加入100 μL。

表1 基于4A-1G7的C-ELISA檢測方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions for the 4A-1G7-based C-ELISA

表2 基于4B-1B6的C-ELISA檢測方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 2 The optimized conditions for the 4B-1B6-based C-ELISA

2.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定

采用優(yōu)化后的基于4A-1G7的C-ELISA檢測方法對50份羊和牛BTV陰性血清進(jìn)行檢測，抑制率和血清份數(shù)分布見圖1。測定OD450值，本次檢測阻斷率平均值為21%，標(biāo)準(zhǔn)差為13%，根據(jù)公式+2s計算，陽性和陰性結(jié)果判定的臨界值為 49%。最終確定陰陽性判定阻斷率臨界值為抗原對照平均 OD450的 49%，即阻斷率大于或等于49%的判為BTV陽性血清。

用優(yōu)化后的基于 4B-1B6的 C-ELISA檢測方法對50份羊和牛BTV陰性血清進(jìn)行檢測，抑制率和血清份數(shù)分布見圖2。該方法檢測阻斷率平均值為23%，標(biāo)準(zhǔn)差為5%，根據(jù)公式計算，陽性和陰性結(jié)果判定的臨界值為 33%，考慮到個別樣品接近 40%的抑制率，最終確定阻斷率大于或等于40%的判為BTV陽性血清。

2.4 敏感性分析

分別采用優(yōu)化后的檢測方法檢測不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)BTV-4陽性血清，其中基于4A-1G7的C-ELISA檢測結(jié)果為稀釋度1∶80時，PI＞49%；基于4B-1B6的C-ELISA檢測結(jié)果為稀釋度1∶40時，PI＞40%。

圖1 基于4A-1G7的C-ELISA檢測方法對陰性血清抑制率及對應(yīng)血清份數(shù)分布圖Fig. 1 The assay of negative serum samples of the 4A-1G7-based C-ELISA.

圖2 基于 4B-1B6的 C-ELISA檢測方法對陰性血清抑制率及對應(yīng)血清份數(shù)分布圖Fig. 2 The assay of negative serum samples of the 4B-1B6-based C-ELISA.

2.5 特異性分析

采用建立地方法檢測1-24型BTV標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品及標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品，結(jié)果如表 3所示。結(jié)果表明兩種檢測方法可以檢測到BTV-4標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，但是對其他血清型的BTV病毒抗血清有一定的交叉反應(yīng)。然而，兩種檢測方法聯(lián)合應(yīng)用時，當(dāng)兩種方法檢測結(jié)果共同為陽性時，該樣品為BTV-4、BTV-18或BTV-20感染的動物血清，即可以區(qū)分出BTV-4、BTV-18和BTV-20與其他血清型的BTV感染后的動物血清。

表3 BTV-4特異性競爭ELISA的特異性試驗(yàn)檢測結(jié)果Table 3 The specificity test of BTV-4-specific competitive ELISAs

2.6 重復(fù)性分析

利用3批次試劑對10份綿羊血清分別用兩種方法進(jìn)行檢測，所有試劑均為不同批次，檢測結(jié)果表明同一份血清檢測試劑批次間的變異系數(shù)在4%-10%，無顯著差異。

2.7 臨床樣品檢測

將經(jīng)BTV群特異性ELISA試劑盒檢測結(jié)果為陽性的20份BTV血清樣品，經(jīng)基于4A-1G7和4B-1B6的C-ELISA方法檢測均為陽性的樣品含有3個，該檢測樣品為BTV-4、BTV-18或BTV-20感染的動物血清，排除其他血清型的感染，可以初步區(qū)分檢測樣品來源動物感染 BTV的血清型。

3 討論

近些年，隨著全球氣候變暖，藍(lán)舌病在世界各地不斷暴發(fā)，BTV血清型眾多[19]，且各型之間交叉免疫性差[20-21]，因此建立一種可以檢測BTV各血清型的快速、敏感性的檢測方法尤為重要[22]。BT血清抗體效價檢測是了解BT感染情況、檢測疫苗免疫效果的必要手段，目前BT血清抗體檢測的主要方法之一是競爭ELISA[23]。目前，國內(nèi)主要研究了BTV群特異性的競爭ELISA方法，未見有對BTV的型特異性競爭ELISA方法建立。本研究中，分別采用4型BTV VP2-A/B蛋白為包被抗原，分別用抗BTV-4 VP2單克隆抗體4A-1G7、4B-1B6為競爭抗體，建立了兩種競爭ELISA方法。

特異性強(qiáng)和敏感性高是ELISA檢測方法的最大優(yōu)點(diǎn)，微量的樣品就能引起高效的抗原抗體反應(yīng)[24]，因此，準(zhǔn)確選擇抗原的包被濃度和血清樣品的稀釋度是ELISA實(shí)驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)之一。通過對標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品、陰性樣品和臨床樣品的檢測，分析表明這兩種方法具有良好的特異性和敏感性[25-26]。用兩種C-ELISA方法的靈敏度進(jìn)行了檢測，確定該C-ELISA的檢測靈敏度分別為1∶80、1∶40。國外有報道的類似產(chǎn)品可檢測的血清稀釋度范圍為 1∶15–1∶220[25]，可見，兩種方法的靈敏度符合C-ELISA的鑒定范圍。本研究建立的競爭ELISA方法的敏感性、特異性和重復(fù)性符合OIE《哺乳動物、禽類和蜜蜂A和B類疾病診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊》標(biāo)準(zhǔn)[27]。

同時，利用基于 4A-1G7和 4B-1B6的C-ELISA方法聯(lián)合應(yīng)用可以區(qū)分出 BTV-4、BTV-18或 BTV-20感染的血清型。用基于4A-1G7的C-ELISA方法檢測出的陽性樣品，為BTV-3、BTV-4、BTV-11、BTV-13、BTV-16、BTV-18、BTV-19、BTV-20、BTV-22或 BTV-24感染的動物血清；用基于4B-1B6的C-ELISA方法檢測出的陽性樣品，為BTV-4、BTV-5、BTV-9、BTV-12、BTV-14、BTV-17、BTV-18、BTV-20 或BTV-21感染的動物血清。當(dāng)同一個樣品用兩種方法檢測結(jié)果均為陽性時，該樣品為 BTV-4、BTV-18或BTV-20感染的動物血清，即可以區(qū)分出BTV-4、BTV-18和BTV-20與其他血清型的BTV感染后的動物血清。如果兩種方法檢測結(jié)果均為陰性，待檢樣品可能為BTV-1、BTV-2、BTV-6、BTV-7、BTV-8、BTV-10、BTV-15 或BTV-23型感染的動物血清；如果 4A-1G7的檢測結(jié)果為陽性而 4B-1B6的結(jié)果為陰性，待檢樣品可能為BTV-3、BTV-11、BTV-13、BTV-16、BTV-19、BTV-22或 BTV-24型感染的動物血清；如果4A-1G7的檢測結(jié)果為陰性而4B-1B6的結(jié)果為陽性，待檢樣品可能為 BTV-5、-9、-12、-14、-17或-21型感染的動物血清。BTV-4 VP2 (GenBank Accession No. AM132566356) 與BTV-18 VP2 (No. KX442585.1) 和BTV-22 VP2(No. AJ585141.1) 的氨基酸序列同源性分別為52%和70%。本實(shí)驗(yàn)對比分析4A-1G7 (160NH161)、4B-1B6 (501SRS503) 抗原表位與 BTV-18、BTV-20 VP2氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)BTV-18 VP2的第 163–164位為 NH 片段，395–397位為 SRS片段；發(fā)現(xiàn)BTV-20 VP2 161–162位為NH片段，502–503位為 SRS片段。Maan等推測[12,28]，BTV-18 VP2的 163–164位、395–397位，能夠識別 BTV-18；BTV-20 VP2的 502–503位能夠識別 BTV-20，與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果相符合，即4A-1G7 C-ELISA和4B-1B6 C-ELISA兩種方法檢測BTV-4、BTV-18、BTV-20結(jié)果均應(yīng)為陽性。

本研究采用針對BTV VP2型特異性單克隆抗體4A-1G7和4B-1B6建立C-ELISA，該檢測方法短時間內(nèi) (3-4 h)，可以用于初步區(qū)分不同型BTV感染的動物血清，并且實(shí)驗(yàn)條件要求低，具有型特異性，可用于大規(guī)模的血清抗體普查，并且本研究為下一步建立BTV型特異性檢測方法奠定基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Establishment of two competitive ELISAs for specific detection of bluetongue virus serotype 4

Jiaxuan Li, Mingxin Zang, Shuangyu Xie, Yanping Jiang, Wen Cui, Yigang Xu,Min Liu, Xinyuan Qiao, Li Wang, Han Zhou, Yijing Li, and Lijie Tang

College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China

To develop a clinical diagnosis technique for bluetongue virus infection, we established serotype-specific methods to detect serotype 4 of bluetongue virus (BTV-4). Two monoclonal antibodies (mAbs) against VP2 protein ofBTV-4, named 4A-1G7 and 4B-1B6, were used as competitive antibodies in the competitive enzyme-linked immunosorbent assays (C-ELISA). We detected 50 negative serum samples from sheep, goats and cattle by C-ELISA. The cut-off values of 4A-1G7 and 4B-1B6 mAbs were 49% and 40%, respectively. The results of the sensitivity, specificity and repeatability by detecting standard positive serum, were consistent with the general standard of Office International Des Epizooties.Furthermore, serum samples of BTV-4, BTV-18 and BTV-20 infection could be screened out through the combined C-ELISAs by 4A-1G7 and 4B-1B6 mAbs. Thus, this technique may diagnose BTV-4, BTV-18 and BTV-20 infections.

bluetongue virus serotype 4, competitive ELISA, monoclonal antibody, VP2 protein

March 25, 2017; Accepted: June 5, 2017

s：Lijie Tang. Tel: +86-451-55190824; E-mail: tanglijie@163.com Yijing Li. Tel: +86-451-55190363; E-mail: yijingli@163.com

Supported by: National Key Technology R&D Program of China (No. 2013BAD12B01).

國家科技支撐計劃 (No. 2013BAD12B01) 資助。