王海東，江沛，何昕，宋興發(fā),

(1連云港市第一人民醫(yī)院，江蘇連云港222002；2濟寧市第一人民醫(yī)院；3中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院)

淀粉蛋白前β位分解酶1基因多態(tài)性與癲癇易感性的關(guān)系

王海東1，江沛2,3，何昕3，宋興發(fā)1,3

(1連云港市第一人民醫(yī)院，江蘇連云港222002；2濟寧市第一人民醫(yī)院；3中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院)

目的 分析淀粉蛋白前β位分解酶1(BACE1)基因多態(tài)性與癲癇易感性的關(guān)系。方法 選取湖南地區(qū)238例癲癇患者為觀察組(男129例，女109例)、體檢健康者211例為對照組(男104例，女107例)，均為漢族，采用PCR-連接酶檢測反應(yīng)(LDR)檢測BACE1基因rs535860、rs525493、rs638405位點的多態(tài)性，分析其與癲癇發(fā)病的關(guān)系。結(jié)果 觀察組BACE1基因rs535860基因型AT頻率高于對照組(P=0.041)，攜帶至少1個突變等位基因T(AT+TT)的個體癲癇發(fā)病風(fēng)險是野生AA基因型的1.005倍(95%CI:0.382～2.616，P=0.048)；兩組BACE1基因rs525493、rs638405的基因型和等位基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。觀察組男性癲癇患者BACE1基因s535860基因型AT頻率高于對照組男性人群(P=0.004)，攜帶至少1個突變等位基因T(AT+TT)的男性個體癲癇發(fā)病風(fēng)險是野生AA基因型的2.585倍(95%CI：1.310～5.140,P=0.006 )。兩組男性人群BACE1基因rs525493、rs638405及女性人群rs535860、rs525493、rs638405 的基因型和等位基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均> 0.05)。結(jié)論 BACE1基因rs535860突變雜合子AT基因型與癲癇的發(fā)病有關(guān)，在男性群體中更為顯著。

癲癇；基因多態(tài)性；淀粉蛋白前β位分解酶1；性別差異；漢族；湖南省

癲癇發(fā)病機制十分復(fù)雜，可由多種因素引起，但遺傳因素是其發(fā)病的重要原因[1，2]。β-淀粉樣蛋白由β淀粉樣前體蛋白水解而來，與阿爾茲海默病的發(fā)病密切相關(guān)。阿爾茲海默病與癲癇的發(fā)病存在相關(guān)性，早期顯現(xiàn)智力衰退的癲癇患者會快速發(fā)展為癡呆[3]。淀粉蛋白前β位分解酶1(BACE1)是重要的β-淀粉樣蛋白水解酶，其某些底物和突出損傷可能導(dǎo)致癲癇發(fā)作[4]。因此，探討B(tài)ACE1基因多態(tài)性與癲癇發(fā)病的關(guān)系，有助于癲癇發(fā)作機制及其治療方法的探索。2013年6月～2015年12月，我們采取病例對照研究分析BACE1基因rs535860、rs525493、rs638405的多態(tài)性與漢族人群癲癇易感性的關(guān)聯(lián)性?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院小兒神經(jīng)內(nèi)科收治的癲癇患者238例(觀察組)，男129例、女109例，年齡(14.1±4.4)歲，均為漢族，首次發(fā)病年齡(4.3±2.9)歲，并排除皮質(zhì)發(fā)育不良、腦部外傷、精神發(fā)育遲緩等神經(jīng)精神病變。選擇同期體檢健康者211例(對照組)，男104例、女107例，年齡(14.8±3.2)歲，均為漢族。兩組性別、年齡、民族均具有可比性。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象或監(jiān)護人知情同意。

1.2 BACE1基因基因多態(tài)性檢測方法 采用PCR-連接酶檢測反應(yīng)(LDR)，儀器主要有PCR儀(MJ PTC-200/Gene Amp PCR)、測序儀PRISM 3730(ABI)、生物電泳圖像分析系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司)、Agrose LE(上海捷倍思基因技術(shù)有限公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。按照SQ Blood DNA Kit Ⅱ說明書(D0714-250，美國OMEGA公司)提取全血DNA，測得DNA樣品OD260/OD280在1.7～1.9。采用Primer3.0設(shè)計引物，探針和引物均由上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)公司設(shè)計并合成。rs535860上游引物為5′-AGGGAAACAAGCTTGGTCTC-3′，下游引物為5′-CAGAAGTACTGGCATCACAC-3′；rs525493上游引物為5′-GTCTCTTCCTGAAAGATTGC-3′，下游引物為5′-TTGGCCTTCAGATATAAGGG-3′；rs638405上游引物為5′-TCTCTGGTATACACCCATCC-3′ ，下游引物為5′-TCCTTGCAGTCCATTTTCAG-3′。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：0.5 pmol/L的上下游引物各2 μL，1×PCR緩沖液2 μL，滅菌水12.2 μL，2 mmol/L的TaqDNA聚合酶0.2 μL，2 nmol/L 的dNTP 2 μL，基因組DNA(50 ng/μL)1 μL，3 mmol/L Mg2+0.6 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火100 s，65 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；65 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用3.0%瓊脂糖凝膠于TBE中電泳，觀察PCR反應(yīng)產(chǎn)物，進行PCR產(chǎn)物的LDR。LDR反應(yīng)體系(10 μL)：1×緩沖液1 μL，2 pmol/μL探針混合液1 μL，2 U Taq DNA連接酶0.05 μL，4 μL純化的PCR產(chǎn)物，4 μL ddH2O。LDR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，50 ℃退火25 s，共40個循環(huán)。最終產(chǎn)物應(yīng)用GeneMapper 4.1軟件進行基因分型。利用NCBI網(wǎng)站在線對所獲rs535860、rs525493、rs638405基因型序列進行對比分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。各研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度用Pearsonχ2檢驗，基因型、等位基因頻率比較行χ2檢驗。采用Logistic回歸分析法校正年齡和性別因素后,對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以O(shè)R和95%CI表示BACE1基因多態(tài)性與癲癇易感性的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡分析結(jié)果 各基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，兩組研究對象具有群體代表性。

2.2 BACE1基因多態(tài)性與癲癇易感性的關(guān)系 觀察組BACE1基因rs535860基因型AT頻率高于對照組(P=0.041)，攜帶至少1個突變等位基因T(AT+TT)的個體癲癇發(fā)病風(fēng)險是野生AA基因型的1.005倍(95%CI：0.382～2.616，P=0.048)；兩組BACE1基因rs525493、rs638405的基因型和等位基因分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 兩組BACE1基因rs535860、rs525493、rs638405 位點基因型和等位基因分布比較(例)

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 BACE1 基因多態(tài)性與不同性別癲癇易感性的關(guān)系 觀察組男性癲癇患者BACE1基因s535860基因型AT頻率高于對照組男性人群(P=0.004)，攜帶至少1個突變等位基因T(AT+TT)的男性個體癲癇發(fā)病風(fēng)險是野生AA基因型的2.585倍(95%CI:1.310～5.140,P=0.006)。兩組男性人群BACE1基因rs525493、rs638405及女性人群rs535860、rs525493、rs638405 的基因型和等位基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2、3。

表2 兩組男性人群BACE1基因rs535860、rs525493、rs638405 位點基因型和等位基因分布比較(例)

注：與對照組比較，*P<0.05。

表3 兩組女性人群BACE1基因rs535860、rs525493、rs638405 位點基因型和等位基因分布比較(例)

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

阿爾茨海默病是一種起病隱匿的進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征。癲癇也是一種由臨床表現(xiàn)確定的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的疾病，與阿爾茲海默病有某些相同之處，包括神經(jīng)元死亡、神經(jīng)變化以及感染等。動物及人體研究表明，阿爾茲海默病與癲癇之間存在密切關(guān)系。有研究[5]表明，阿爾茲海默病患者有癲癇病史的概率較大。BACE1基因在阿爾茲海默病的發(fā)病過程中起非常重要的作用，如果其過度表達，神經(jīng)軸突的纖維化將會加重，而這個過程對阿爾茲海默病起重要作用[6]?；诎柶澓Ｄ『桶d癇之間的密切聯(lián)系以及BACE1在阿爾茲海默病發(fā)病過程中起著重要作用。本研究分析了BACE1 基因多態(tài)性與癲癇病之間的關(guān)系，結(jié)果表明rs535860(A>T)的多態(tài)性與癲癇易感性顯著相關(guān)。

BACE1基因多態(tài)性與癲癇的關(guān)系可以從生理基礎(chǔ)研究做出解釋。BACE1是β淀粉樣前體蛋白水解為β淀粉樣蛋白的酶系中的重要成員，在β淀粉樣前體蛋白生成中起重要作用。β淀粉樣蛋白可以在分子、突觸、神經(jīng)元、生物電流等多個水平影響神經(jīng)元活性。Jorge等[7]研究推測，高水平的β淀粉樣蛋白會導(dǎo)致神經(jīng)元活性降低，進而觸發(fā)神經(jīng)異常的補償性活性增強，從而引起癲癇樣癥狀。

BACE1基因動態(tài)性與癲癇關(guān)系的具體機制需要進一步分析，但現(xiàn)有研究表明其可能通過作用于相關(guān)其他底物和離子通道而影響癲癇的發(fā)作。Sez6 基因、神經(jīng)調(diào)解蛋白1基因等[8,9]幾個同家族基因都是BACE1的底物，均為在人體和小鼠體內(nèi)都存在的基因。在BACE1被阻斷后，Sez6 會出現(xiàn)明顯的功能紊亂。有研究證實，Sez6 基因的表達與癲癇發(fā)作相關(guān)，所以BACE1基因多態(tài)性可能通過作用于與類似Sez6 基因的底物，從而影響癲癇的發(fā)病。癲癇的發(fā)病基礎(chǔ)是神經(jīng)不規(guī)則的放電，離子通道活性對神經(jīng)元放電有重要作用。鈉離子通道和鉀離子通道是兩種研究最廣泛的離子通道，鈉離子通道的α和 β亞基突變都與癲癇有關(guān)。有研究[10～12]證明，BACE1缺失小鼠的神經(jīng)元較正常小鼠的鈉離子通道數(shù)有所減少。鉀離子通道中的KCNQ2 和KCNQ3亞家族是神經(jīng)元M電流通道中主要成分，可以通過抑制或激活神經(jīng)元調(diào)節(jié)M電流通道的平衡，而M電流通道的平衡與癲癇綜合癥狀密切相關(guān)[13～15]。由于BACE1可以對離子通道產(chǎn)生影響閉合電流平衡等作用[16]，所以其也可能通過作用于離子通道影響癲癇的發(fā)作。

本研究中男性患者BACE1基因rs535860(A>T)位點的基因型和等位基因分布與健康男性對照者差異有統(tǒng)計學(xué)意義，即男性患者多于女性患者，這與癲癇流行病學(xué)的研究結(jié)果一致[17]。Peters 等[18]在一項用KCNQ2顯性失活轉(zhuǎn)基因小鼠所作的研究中發(fā)現(xiàn)，實驗中大部分雄性突變小鼠顯示癲癇癥狀，但是在雌性突變小鼠個體中沒有發(fā)現(xiàn)類似表現(xiàn)。本研究結(jié)果也表明，BACE1對離子通道的影響可能在不同性別中有差異，進而造成不同性別癲癇易感性的不同。

本研究分析了BACE1基因的3個位點多態(tài)性與癲癇發(fā)病的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)rs535860(A>T)位點與癲癇發(fā)作有相關(guān)性，尤其與男性癲癇患者關(guān)系密切。本研究存在樣本來源有限的缺陷，需要進一步擴大樣本量驗證，但仍能為癲癇發(fā)病機制的闡述提供依據(jù)。

[1] 邱文娟,胡小偉,張正春.癲癇發(fā)病機制及治療的研究進展[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版), 2014,8(10):1920-1924.

[2] Ngugi AK, Bottomley C, Kleinschmidt I, et al. Estimation of the burden of active and life-time epilepsy: a meta-analytic approach [J]. Epilepsia, 2010,51(5):883-890.

[3] Zhang C.Natural compounds that modulate BACE1-processing of amyloid-beta precursor protein inAlzheimer′s disease[J]. DiscovMed, 2012,14(76):189-197.

[4] Yu ZL, Jiang JM, Wu DH, et al. Febrile seizures are associated with mutation of seizure-related (Sez) 6, a brain-specific gene[J]. J Neurosci Res, 2007,85(1):166-172.

[5] Filser S, Ovsepian SV, Masana M, et al. Pharmacological inhibition of BACE1 impairs synaptic plasticity and cognitive functions[J]. Biol Psychiatry, 2015,77(8):729-739.

[6] Kuhn PH, Koroniak K, Hogl S, et al. Secretome protein enrichment identifies physiological BACE1 protease substrates in neurons [J]. EMBO J, 2012,31(14):3157-3168.

[7] Jorge J, Palop, Lennart M. Epilepsy and cognitive impairments in alzheimer disease [J]. Arch neurol, 2009,66(4):435-442.

[8] Mei L, Nave KA Neuregulin-ERBB signaling in the nervous system and neuropsychiatric diseases [J]. Neuron, 2014,83 (1):27-49.

[9] Dislich B, Wohlrab F, Bachhuber T, et al. Label-free quantitative proteomics of mouse cerebrospinal fluid detects β-site APP cleaving enzyme (BACE1) protease substrates in vivo [J]. Mol Cell Proteomics, 2015,14 (4):2550-2563.

[10] Wong HK, Sakurai T, Oyama F, et al. Beta subunits of voltage-gated sodium channels are novel substrates of beta-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme (BACE1) and gamma-secretase [J]. J Biol Chem, 2005,280(24):23009-23017.

[11] Gersbacher MT, Kim DY, Bhattacharyya R, et al. Identification of BACE1 cleavage sites in human voltage-gated sodium channel beta 2 subunit [J]. Mol Neurodegener, 2010,5:61.

[12] Kim DY, Gersbacher MT, Inquimbert P, et al. Reduced sodium channel Na(v)1.1 levels in BACE1-null mice [J]. J Biol Chem, 2011, 286(10):8106-8116.

[13] Wang JJ, Li Y. KCNQ potassium channels in sensory system and neural circuits [J]. Acta Pharmacol Sin, 2016,37(1):25-33.

[14] Currò D. The Modulation of potassium channels in the smooth muscle as a therapeutic strategy for disorders of the gastrointestinal tract [J]. Adv Protein Chem Struct Biol, 2016,104 (1): 263-305.

[15] Maljevic S, Wuttke TV, Seebohm G, et al. KV7 channelopathies [J]. Pflugers Arch, 2010,460(2):277-288.

[16] Symonds JD, Zuberi SM, Johnson MR, et al. Advances in epilepsy gene discovery and implications for epilepsy diagnosis and treatment [J]. Curr Opin Neurol, 2017, 30 (2):193-199.

[17] Kotsopoulos IA, van Merode T, Kessels FG, et al. Systematic review and meta-analysis of incidence studies of epilepsy and unprovoked seizures[J]. Epilepsia, 2002,43(11):1402-1409.

[18] Peters HC, Hu H, Pongs O, et al. Conditional transgenic suppression of M channels in mouse brain reveals functions in neuronal excitability, resonance and behavior [J]. Nat Neurosci, 2005,8(1):51-60.

Relationship between BACE1 gene polymorphisms and epilepsy susceptibility

WANGHaidong1,JIANGPei,HEXin,SONGXingfa

(1TheFirstPeople′sHospitalofLianyungang,Lianyungang222002,China)

Objective To analyze the relationship between the β-secretase 1 (BACE1) gene polymorphisms and epilepsy susceptibility. Methods BACE1 gene rs535860, rs525493 and rs638405 polymorphisms were detected by the PCR-ligase detection reaction (LDR) in 238 children with epilepsy (observation group, 129 males and 109 females) and 211 healthy controls (control group, 104 males and 107 females) of Han population in Hunan Province, and their correlations with epilepsy susceptibility was analyzed.Results The frequency of genotype AT for BACE1 rs535860 (A>T) was significantly higher in the observation group than in the control group (P=0.041). The incidence rate of patients that carried the T allele (AT+TT) was 1.005 times higher than that carried AA wild genotype (95%CI0.382-2.616,P=0.048). However, no statistically significant differences were found in the genotype and allele distributions of rs525493 (G>T) and rs638405 (C>G) between the two groups (allP>0.05). The genotype AT frequency of BACE1 gene s535860 in male patients with epilepsy of the observation group was higher than that in the control group (P=0.004). The risk of epilepsy in male individuals carrying at least one mutant allele T (AT+TT) was 2.585 times higher than that of males with wild AA genotype (95%CI: 1.310-5.140,P=0.006).There was no significant difference in genotype and allele distribution of BACE1 gene rs525493, rs638405 of males as well as BACE1 gene rs535860, rs525493 and rs638405 of females between these two groups (allP>0.05).Conclusion The mutant heterozygote AT genotype of BACE1 gene rs535860 is associated with the onset of epilepsy and is more significant in males.

epilepsy; gene polymorphism; β-secretase 1; gender difference; Han nationality; Hunan area

國家自然科學(xué)基金資助項目(81602846)。

王海東(1986-)，男，碩士研究生，主管藥師，主要研究方向為醫(yī)院藥學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)。E-mail: wanghaidong7924046@163.com

宋興發(fā)(1968-)，男，副主任藥師，主要研究方向為醫(yī)院藥學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)。E-mail: sxf_198@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.30.007

R742

A

1002-266X(2017)30-0026-04

2016-11-28)