張琪，鄭陽(yáng)，楊光華，單雨靜，趙永魁，張博，陳建立，張國(guó)志，王長(zhǎng)友

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，唐山063000)

胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)對(duì)鏈脲佐菌素所致大鼠胰腺損傷的影響

張琪，鄭陽(yáng)，楊光華，單雨靜，趙永魁，張博，陳建立，張國(guó)志，王長(zhǎng)友

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，唐山063000)

目的 探討胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)所致胰島損傷大鼠的影響并探討其機(jī)制。方法 選擇SD大鼠30只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、代謝手術(shù)組各10只。代謝手術(shù)組行改良Roux-en-Y胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)，空白對(duì)照組、模型組僅做單純開(kāi)腹、關(guān)腹處理。手術(shù)7 d后，模型組、代謝手術(shù)組均腹腔注射STZ建立糖尿病模型，空白對(duì)照組腹腔注入等量生理鹽水。分別于造模前1天、造模后第7、14天時(shí)抽取各組大鼠空腹尾靜脈血，檢測(cè)血糖水平。于造模前1天、造模后2 h、造模后第7、14天時(shí)抽取空腹尾靜脈血，采用ELISA法檢測(cè)血漿C肽水平，以評(píng)價(jià)胰島損傷情況。于造模前1天、造模后24 h、造模后第7天時(shí)抽取空腹尾靜脈血，采用ELISA法檢測(cè)血漿TNF-α水平。于造模第2天時(shí)取胰腺組織，采用Western blotting法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)蛋白X(Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤蛋白-2(Bcl2)、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)表達(dá)。結(jié)果 造模后第7、14天時(shí)，模型組血糖高于造模前及同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組，代謝手術(shù)組血糖低于模型組(P均<0.01)。造模后第7、14天時(shí)，模型組血漿C肽水平均低于造模前及同時(shí)點(diǎn)空白對(duì)照組，代謝手術(shù)組血漿C肽水平均低于模型組(P均<0.01)。造模后24 h及第7天時(shí)，模型組血漿TNF-α水平均高于造模前及同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組，代謝手術(shù)組血漿TNF-α水平均低于模型組(P均<0.01)。與代謝手術(shù)組相比，模型組Bcl2蛋白表達(dá)降低，CHOP、Bax蛋白表達(dá)增高(P均<0.01)。結(jié)論 胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)可減輕STZ導(dǎo)致的大鼠胰腺組織損傷，其機(jī)制可能與減輕胰島細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、抑制胰島細(xì)胞凋亡有關(guān)。

糖尿病；代謝手術(shù)；胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)；鏈脲佐菌素；胰島；凋亡；炎癥

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，中國(guó)糖尿病總?cè)藬?shù)已達(dá)9 000萬(wàn)，已經(jīng)成為糖尿病患病率最高的國(guó)家[1]。目前，我國(guó)對(duì)于糖尿病的治療方法仍然是依靠降糖藥物及胰島素注射等傳統(tǒng)藥物方式。糖尿病的外科手術(shù)由減肥手術(shù)演變而來(lái)[2]，隨后Pories等[3]第一次報(bào)道了代謝手術(shù)治療糖尿病的效果。目前，代謝手術(shù)的應(yīng)用主要包含限制性手術(shù)和胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)兩種手術(shù)方式。前瞻性研究指出，在所有手術(shù)方式中，胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)的治療效果最佳，因此，胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)已被作為代謝手術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。多個(gè)臨床研究表明，采用代謝手術(shù)可使糖尿病患者達(dá)到臨床緩解甚至臨床完全“治愈”，但具體機(jī)制尚不清楚。本課題組在進(jìn)行胰島移植實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)，若先行胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)再經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型時(shí)，大鼠胰島的破壞及糖尿病的發(fā)生并沒(méi)有預(yù)想中的出現(xiàn)，即使出現(xiàn)也很輕微[5]。因此我們推測(cè)，胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)可能對(duì)糖尿病大鼠胰島的破壞和功能損傷具有一定的保護(hù)作用，但其是否可用于糖尿病的預(yù)防和治療尚不明確。2016年3～12月，我們對(duì)SD大鼠采用改良Roux-en-Y胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)后再經(jīng)腹腔注射STZ，觀察胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)對(duì)STZ所致大鼠胰島損傷的影響，探討代謝手術(shù)預(yù)防和治療糖尿病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；大鼠C肽酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒及炎性因子TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)于美國(guó)Rapidbio公司；B細(xì)胞淋巴瘤蛋白-2(Bcl2)、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)、B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)蛋白X(Bax)單抗購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；羊抗兔、羊抗鼠IgG/HRP 及Western 印跡相關(guān)試劑購(gòu)于北京Solarbio科技有限公司。

1.2 分組及干預(yù)方法 應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將30只大鼠分為3組即空白對(duì)照組、模型組、代謝手術(shù)組，每組各10只。代謝手術(shù)組行改良Roux-en-Y胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)[6]。大鼠術(shù)前稱重，按0.2 g/kg水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于手術(shù)臺(tái),取上腹部正中切口進(jìn)入腹腔，結(jié)扎幽門后，于Treitz韌帶以遠(yuǎn)10 cm處切斷空腸并結(jié)扎封閉兩斷端，將遠(yuǎn)端空腸與胃做側(cè)側(cè)吻合，近端空腸于胃-空腸吻合口以遠(yuǎn)15 cm處與遠(yuǎn)端空腸做側(cè)側(cè)吻合。術(shù)后當(dāng)天禁食水，術(shù)后第1天喂食糖鹽水，術(shù)后第2天給予腸外營(yíng)養(yǎng)液，術(shù)后第3天恢復(fù)正常飼養(yǎng)?？瞻讓?duì)照組、模型組僅做單純開(kāi)腹、關(guān)腹處理。

1.3 模型制備 手術(shù)7 d后，模型組、代謝手術(shù)組均按60 mg/kg腹腔注射STZ建立糖尿病模型。空白對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 血糖檢測(cè) 分別于造模前1天、造模后第7、14天時(shí)，抽取各組大鼠空腹尾靜脈血，檢測(cè)血糖水平。

1.5 血漿C肽水平檢測(cè) 分別于造模前1天、造模后2 h、造模后第7、14天時(shí)，抽取各組大鼠空腹尾靜脈血，采用ELISA法檢測(cè)血漿C肽水平，以評(píng)價(jià)胰島損傷情況。

1.6 血漿TNF-α水平檢測(cè) 分別于造模前1天、造模后24 h、造模后第7天時(shí)，抽取各組大鼠空腹尾靜脈血，采用ELISA法檢測(cè)血漿TNF-α水平。

1.7 胰腺組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)胰腺組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl2、CHOP、Bax表達(dá)。于造模第2天，各組隨機(jī)選取2只大鼠處死，取胰腺組織，組織剪剪碎胰腺組織后上勻漿機(jī)充分研磨，RIPA裂解液充分裂解組織，離心收集蛋白。BCA法定量總蛋白，加入等體積2×蛋白上樣緩沖液后100 ℃變性5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆?。進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，行轉(zhuǎn)膜、10%脫脂奶封閉，分別加入Bcl2、CHOP、Bax一抗(1∶1 000)孵育過(guò)夜，二抗(1∶100)37 ℃孵育2 h，熒光顯色。Image J軟件分析灰度值。蛋白表達(dá)量=(所測(cè)蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值)×100%。

2 結(jié)果

2.1 各組血糖比較 造模后第7、14天時(shí)，模型組血糖高于造模前及同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組，代謝手術(shù)組血糖低于模型組(P均<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)血糖比較

注：與空白對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.01；與代謝手術(shù)組同時(shí)點(diǎn)比較，﹟P<0.01。

2.2 各組血漿C肽水平比較 造模后第7、14天時(shí)，模型組血漿C肽水平均低于造模前及同時(shí)點(diǎn)空白對(duì)照組，代謝手術(shù)組血漿C肽水平均低于模型組(P均<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組不同時(shí)點(diǎn)血漿C肽水平比較

注：與空白對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.01；與代謝手術(shù)組同時(shí)點(diǎn)比較，﹟P<0.01。

2.3 各組血漿TNF-α水平比較 造模后24 h及第7天時(shí)，模型組血漿TNF-α水平均高于造模前及同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組，代謝手術(shù)組血漿TNF-α水平均低于模型組(P均<0.01)。

表3 各組不同時(shí)點(diǎn)血漿TNF-α水平比較

注：與空白對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.01；與代謝手術(shù)組同時(shí)點(diǎn)比較，﹟P<0.01。

2.4 各組胰腺組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與代謝手術(shù)組相比，模型組Bcl2蛋白表達(dá)降低，CHOP、Bax蛋白表達(dá)增高(P均<0.01)。代謝手術(shù)組與空白對(duì)照組各蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組胰腺組織Bcl2、CHOP、Bax蛋白表達(dá)比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與代謝手術(shù)組比較，﹟P<0.01。

3 討論

與過(guò)去20年相比，我國(guó)糖尿病發(fā)病率已經(jīng)增加了近4倍，其中，2型糖尿病占93.7%[7]。外科干預(yù)治療2型糖尿病是一種新型方案。目前研究顯示，與傳統(tǒng)內(nèi)科治療方法相比，代謝手術(shù)在緩解2型糖尿病、減少并發(fā)癥發(fā)生、控制體質(zhì)量方面具有更明顯的優(yōu)勢(shì)[8, 9]。薈萃分析研究顯示[10]，在降低患者血糖水平、減少用藥量、降低并發(fā)癥發(fā)生率等方面，對(duì)

圖1 各組Bcl2、CHOP、Bax蛋白表達(dá)比較(Western blotting法)

2型糖尿病患者最有效的手術(shù)方式為胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)。目前，胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)已成為代謝手術(shù)中最有效且常用的手術(shù)方式。代謝手術(shù)方式中的胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)在治療糖尿病上的效果已經(jīng)越來(lái)越得到學(xué)術(shù)界專家的認(rèn)可，在臨床上也得到了多次的驗(yàn)證，但是對(duì)于胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)治療糖尿病的機(jī)制目前仍不明確。本課題組前期中發(fā)現(xiàn)，先行胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)再經(jīng)腹腔注射STZ時(shí)，大鼠胰島的破壞并不明顯，糖尿病也并未出現(xiàn)，因此推測(cè)胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)可能對(duì)糖尿病大鼠胰島的破壞和功能損傷具有一定的保護(hù)作用。

目前研究認(rèn)為，代謝手術(shù)治療糖尿病的主要機(jī)制是通過(guò)改變胃腸道的解剖結(jié)構(gòu)，使近端消化道分泌的抑制胰島β細(xì)胞功能、產(chǎn)生胰島素抵抗的胰島抑制性激素減少，遠(yuǎn)端消化道分泌的腸促胰島激素增加，進(jìn)而刺激胰島β細(xì)胞對(duì)胰島素的分泌和釋放[11, 12]、增強(qiáng)胰島素的敏感性[13]、促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖[14]?？崭寡獫{C肽水平與胰島功能呈正比關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，造模后第7、14天時(shí)，模型組血糖水平均高于造模前及同時(shí)點(diǎn)空白對(duì)照組和代謝手術(shù)組，模型組血漿C肽水平均低于造模前及同時(shí)點(diǎn)空白對(duì)照組和代謝手術(shù)組，提示代謝手術(shù)對(duì)于STZ所致的胰島損傷具有保護(hù)作用，可以提高大鼠胰島功能，保護(hù)胰島細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮降低血糖作用[15]。

炎癥因子和胰島β細(xì)胞凋亡在胰島素抵抗及2型糖尿病發(fā)病機(jī)理中的作用也逐漸受到學(xué)者們的關(guān)注[16～18]。胰島素抵抗和2型糖尿病均呈現(xiàn)出一種慢性低度的炎癥反應(yīng)狀態(tài)，表現(xiàn)為TNF-α等炎性因子水平升高，而TNF-α可通過(guò)使胰島β細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多的自由基并誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而使之凋亡[19, 20]。研究證實(shí)，代謝手術(shù)后患者炎癥因子水平明顯降低，并且對(duì)胰島素抵抗和2型糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的遠(yuǎn)期改善率有益[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，造模后24 h及第7天時(shí)，模型組血漿TNF-α水平高于空白對(duì)照組，且代謝手術(shù)組血漿TNF-α水平低于模型組，提示糖尿病大鼠血漿TNF-α水平增高，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，而代謝手術(shù)可以減輕STZ所致的胰島細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)凋亡的重要信號(hào)分子，當(dāng)出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)CHOP可被大量激活，進(jìn)而改變Bcl家族成員的表達(dá)，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[22]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠胰腺組織CHOP蛋白的表達(dá)較空白對(duì)照組和代謝手術(shù)組增高，提示糖尿病大鼠的胰腺組織存在CHOP介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡活性增強(qiáng)，而代謝手術(shù)可有效干預(yù)CHOP蛋白的表達(dá)，從而改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、減少細(xì)胞凋亡，這可能是代謝手術(shù)保護(hù)胰島損傷的作用機(jī)制之一。另外，代謝手術(shù)組大鼠胰腺組織Bcl2蛋白表達(dá)較模型組顯著升高、Bax蛋白表達(dá)明顯降低，提示代謝手術(shù)可能是通過(guò)下調(diào)Bcl2/Bax表達(dá)水平、抑制糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)胰腺組織的保護(hù)作用。

綜上所述，胃腸轉(zhuǎn)流術(shù)可減輕STZ導(dǎo)致的大鼠胰腺組織損傷，其機(jī)制可能與減輕胰島細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、抑制胰島細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目(20150085)；河北聯(lián)合大學(xué)科學(xué)研究基金項(xiàng)目任務(wù)(Z201427)

王長(zhǎng)友(E-mail: fhbj-2004@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.30.009

R587.1

A

1002-266X(2017)30-0033-04

2017-04-03)