楊曉虎，林裕輝，徐欣，范隆華

(1南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001；2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院)

合并與不合并2型糖尿病的下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥患者血清差異性蛋白組學(xué)分析

楊曉虎1，林裕輝2，徐欣2，范隆華2

(1南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001；2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院)

目的 通過(guò)蛋白組學(xué)研究，鑒定合并2型糖尿病的下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥(DLASO)患者與不合并2型糖尿病下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥(LASO)患者血清的差異性蛋白，為防治2型糖尿病患者發(fā)生LASO提供依據(jù)。方法 收集DLASO、LASO各15例患者的血清，對(duì)蛋白進(jìn)行提取、定量和酶解，應(yīng)用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2DLC-MS/MS)技術(shù)，鑒定DLASO、LASO患者血清中的蛋白，篩選出DLASO患者與LASO患者的差異表達(dá)蛋白。利用PANTHER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定得到的差異性蛋白進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程、分子作用和細(xì)胞組分分析。結(jié)果 共鑒定出蛋白質(zhì)338種，篩選出差異性蛋白27種，其中DLASO患者出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)蛋白8種、表達(dá)下調(diào)蛋白19種。在生物學(xué)過(guò)程方面，差異性蛋白主要為參與細(xì)胞反應(yīng)(48.1%)、代謝過(guò)程(48.1%)和生物黏附(29.6%)的蛋白；在分子作用方面，差異性蛋白主要為參與細(xì)胞結(jié)合作用(33.3%)、催化活性作用(29.6%)和結(jié)構(gòu)分子活性作用(18.5%)的蛋白；在細(xì)胞組分方面，差異性蛋白主要為位于細(xì)胞區(qū)域(14.8%)、細(xì)胞器(14.8%)和細(xì)胞外區(qū)域(14.8%)的蛋白。結(jié)論 發(fā)現(xiàn)DLASO與LASO患者血清中的差異性蛋白27種，這些差異性蛋白可作為防治DLASO的潛在生物學(xué)靶點(diǎn)。

2型糖尿病；下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥；蛋白組學(xué)；同位素標(biāo)記；二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；差異性蛋白

全球范圍內(nèi)近2億人口患有2型糖尿病，并且其患病率正在快速增加[1]。下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥(LASO)是因動(dòng)脈粥樣硬化累及下肢動(dòng)脈，導(dǎo)致動(dòng)脈狹窄或閉塞而引起的肢體缺血慢性疾病，可以顯著增加心肌梗死、中風(fēng)等嚴(yán)重疾病的發(fā)生率和病死率。合并2型糖尿病時(shí)能加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，并增加外周動(dòng)脈疾病的發(fā)病率。研究發(fā)現(xiàn)，合并2型糖尿病的患者發(fā)生LASO的患病率是不合并糖尿病患者的4倍，但其原因尚不明確[2]。因此，探討合并2型糖尿病時(shí)對(duì)LASO發(fā)病影響的分子機(jī)制，對(duì)2型糖尿病下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥(DLASO)的早期防治具有重要意義。2011年1月～2012年1月，我們應(yīng)用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(2D LC-MS/MS)技術(shù)，鑒定DLASO 與不合并2型糖尿病的LASO患者的血清差異性蛋白，為闡明2型糖尿病影響LASO發(fā)病的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院同期收治的DLASO(DLASO組)和LASO(LASO組)患者各15例。DLASO組中男8例、女7例，年齡(67.40±2.72)歲，踝肱指數(shù)(ABI)為0.58±0.05。LASO組中男8例、女7例，年齡(67.64±3.34)歲，ABI為0.57±0.05。兩組患者均根據(jù)癥狀體征及影像學(xué)檢查確診，均排除急性及慢性感染、腫瘤等系統(tǒng)性疾病。兩組患者一般臨床資料間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，標(biāo)本采集經(jīng)患者本人或家屬的知情同意。

1.2 標(biāo)本采集及高豐度蛋白去除 于清晨空腹時(shí)抽取兩組患者肘靜脈血，離心10 min，各取1.5 mL。用緩沖液A各稀釋4倍，用0.22 μm離心過(guò)濾器離心1 min，上清利用親和色譜柱Human 14 Multiple Affinity Removal System Columns免疫吸附14種高豐度蛋白。Bradford法對(duì)低豐度蛋白樣品進(jìn)行蛋白定量，每管100 μg分裝，-80 ℃保存。

1.3 低豐度蛋白餾分 應(yīng)用ITRAQ試劑標(biāo)記方法，將低豐度蛋白(100 μg)放入4 ℃解凍后，加入6倍體積凍丙酮，反復(fù)顛倒3次混勻，-20 ℃保存直到沉淀，吸掉丙酮。取兩組丙酮沉淀物100 μg，按ITRAQ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白還原及半胱氨酸修飾。向上述3份樣本加入胰蛋白酶去離子水溶液，渦旋混合，37 ℃孵化過(guò)夜。將iTRAQ試劑放置于室溫凍融，每管iTRAQ試劑加入無(wú)水乙醇70 mL，渦旋混合，使之溶解后轉(zhuǎn)入真空干燥酶解樣品管。兩次技術(shù)重復(fù)中，以iTRAQ試劑116、117標(biāo)記DLASO組，iTRAQ試劑115、117標(biāo)記LASO組，分別取等量(20 μg)的血清、低豐度蛋白、高豐度蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，以評(píng)估親和柱去除高豐度蛋白的效能。

1.4 強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜(SCX)分級(jí)及質(zhì)譜分析 應(yīng)用SCX分級(jí)，經(jīng)過(guò)標(biāo)記的干燥樣本混合品加入200 μL SCX 緩沖液 A (10 mmol/L KH2PO4pH 3.0，25% ACN)復(fù)溶上樣，再經(jīng)B相緩沖液(10 mmol/L KH2PO4pH 3.0，500 mmol/L KCl，25% ACN)以0～100%的濃度梯度、1 000 mL/min流速洗脫75 min。經(jīng)過(guò)收集穿流及洗脫后，得到10個(gè)組分，組分用C18 Cartridge(Sigma)脫鹽并冷凍抽干。分層后樣本經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜脫鹽及分離，然后用LTQ VELOS質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan，San Jose，CA)進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.5 蛋白質(zhì)的鑒定和定量 所有串聯(lián)質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)使用Sequest軟件進(jìn)行搜庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)為International Protein Index(IPI)v3.53人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，Sequest結(jié)果過(guò)濾參數(shù)為：蛋白質(zhì)假陽(yáng)性率(FDR)≤1%；ΔCN≥10%。應(yīng)用Proteomics Tools分析軟件抽提肽段報(bào)告離子峰定量信息，并以iTRAQ標(biāo)記114組為內(nèi)參，對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理分析。以采用軟件計(jì)算的各肽段比值的加權(quán)平均值作為蛋白質(zhì)定量結(jié)果。

1.6 差異性蛋白評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)DLASO組及LASO組蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量后，排除高豐度蛋白，以iTRAQ表達(dá)改變2倍作為閾值選取差異性蛋白，>2.0為DLASO患者的上調(diào)蛋白，<0.5為下調(diào)蛋白。

1.7 差異性蛋白的生物學(xué)功能分析 利用PANTHER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定得到的差異性蛋白進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程、分子作用和細(xì)胞組分的分析。

2 結(jié)果

2.1 差異性蛋白篩選結(jié)果 質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)通過(guò)Sequest軟件搜庫(kù)，共鑒定出蛋白質(zhì)338種。篩選出差異性蛋白27種，其中DLASO組出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)蛋白8種，表達(dá)下調(diào)蛋白19種。見(jiàn)表1、2。

2.2 生物學(xué)功能分析結(jié)果 在生物學(xué)過(guò)程方面，差異性蛋白主要為參與細(xì)胞反應(yīng)(48.1%)、代謝過(guò)程(48.1%)和生物黏附(29.6%)的蛋白；在分子作用方面，差異性蛋白主要為參與細(xì)胞結(jié)合作用(33.3%)、催化活性作用(29.6%)和結(jié)構(gòu)分子活性作用(18.5%)的蛋白；在細(xì)胞組分方面，差異性蛋白主要為位于細(xì)胞區(qū)域(14.8%)、細(xì)胞器(14.8%)和細(xì)胞外區(qū)域(14.8%)的蛋白。

表1 DLASO組與LASO組比較的表達(dá)上調(diào)蛋白

表2 DLASO組與LASO組比較的表達(dá)下調(diào)蛋白

3 討論

LASO是一種常見(jiàn)的慢性、漸進(jìn)性疾病。流行病學(xué)研究表明，2型糖尿病可明顯增加發(fā)生LASO的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致缺血性潰瘍和截肢等功能性損傷的發(fā)生[3]。臨床和基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，DLASO與遺傳、免疫、環(huán)境、生活方式等多種因素有關(guān)，是多因素、多通道導(dǎo)致的復(fù)雜疾病。研究疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)或表達(dá)量改變的差異性蛋白，可以揭示疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，對(duì)于了解差異性蛋白在DLASO的發(fā)病中的不同生物學(xué)作用，闡明DLASO發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

差異蛋白質(zhì)組學(xué)著重尋找和篩選任何有意義的因素引起的2個(gè)樣本之間的差異蛋白質(zhì)譜，可揭示細(xì)胞生理和病理狀態(tài)的進(jìn)程與本質(zhì)、對(duì)外界環(huán)境刺激的反應(yīng)途徑，獲得對(duì)某些關(guān)鍵蛋白的定性和功能分析。差異蛋白質(zhì)組學(xué)反映了蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)本質(zhì)，在生物體及其每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，各種蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾、定位和代謝都在隨時(shí)發(fā)生嚴(yán)格受控的改變。蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)其他蛋白或者被其他蛋白所調(diào)節(jié)，同一種蛋白質(zhì)在不同的時(shí)間、空間上也可能具有不同的生物學(xué)功能。差異蛋白質(zhì)組學(xué)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的前沿，目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用該技術(shù)分析DLASO與LASO差異蛋白表達(dá)鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)蛋白組學(xué)分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，DLASO組與LASO組血清中存在27種差異性表達(dá)蛋白，這些差異性蛋白主要參與了細(xì)胞反應(yīng)、代謝過(guò)程和生物黏附等過(guò)程；差異性表達(dá)的蛋白中，表達(dá)上調(diào)的蛋白8種、表達(dá)下調(diào)的蛋白19種，其中IGFBP5、PCSK9蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，BLVRB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。

IGFBP5蛋白可與胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)結(jié)合，通過(guò)控制IGFs與信號(hào)受體的相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程[4]。同時(shí)IGFBP5蛋白可不依賴IGFs，直接結(jié)合到細(xì)胞表面的假定受體上，或直接調(diào)節(jié)細(xì)胞核中的基因表達(dá)[5]。IGFBP5蛋白參與多種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖、分化、衰老和凋亡[6]。研究證明，IGFBP5蛋白與2型糖尿病所致的細(xì)胞外基質(zhì)積累明顯相關(guān)，參與了2型糖尿病致視網(wǎng)膜病變的病理過(guò)程，2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血管內(nèi)皮細(xì)胞中，IGFBP5蛋白的表達(dá)較非2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者明顯上調(diào)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，DLASO組IGFBP5蛋白表達(dá)較LASO組明顯上調(diào)，提示IGFBP5蛋白在2型糖尿病加速LASO的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起著一定作用。

PCSK9蛋白是哺乳動(dòng)物枯草桿菌蛋白酶家族的一個(gè)成員，由肝臟合成，以轉(zhuǎn)錄后的方式促進(jìn)肝臟LDL受體(LDLR)的降解，從而促進(jìn)循環(huán)中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的積聚[8]。研究[9]證明，PCSK9是導(dǎo)致2型糖尿病患者高胰島素血癥性血脂異常發(fā)生發(fā)展的主要原因，2型糖尿病患者血液中PCSK9水平與LDL-C呈正相關(guān)。血漿中LDL-C是動(dòng)脈粥樣硬化及其相關(guān)的缺血性心血管疾病最重要的致病因素[10]。因此，PCSK9蛋白在2型糖尿病致LASO過(guò)程中可能存在著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，DLASO組PCSK9蛋白表達(dá)較LASO組明顯上調(diào)，提示PCSK9蛋白在2型糖尿病致LASO過(guò)程中參與了動(dòng)脈硬化病理過(guò)程，并起到了重要作用。

BLVRB蛋白是膽綠素還原酶的亞型，由206個(gè)氨基酸組成，質(zhì)量為21 kD。BLVRB蛋白主要在肝臟合成，具有黃素還原酶和鐵還原酶的活性[11,12]，與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)的調(diào)控密切關(guān)系，可能在保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷中有重要作用[13～15]。大量的研究證明，氧化應(yīng)激是2型糖尿病并發(fā)血管疾病的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，DLASO組BLVRB蛋白表達(dá)較LASO組明顯下調(diào)，提示氧化應(yīng)激在DLASO病理過(guò)程中起到了一定作用，但其功能尚不清楚。

總之，本研究應(yīng)用iTRAQ結(jié)合2D LC-MS/MS技術(shù)對(duì)DLASO和LASO患者血清進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共篩選出27種差異性蛋白，這些差異性蛋白主要為參與細(xì)胞反應(yīng)、代謝過(guò)程和生物黏附等過(guò)程的蛋白，表明這些生物過(guò)程可能參與了DLASO的病理過(guò)程，這些差異蛋白可作為DLASO患者防治的潛在生物學(xué)靶點(diǎn)。但本研究?jī)H為初步性蛋白篩選研究，而且樣本量相對(duì)較少，需要進(jìn)一步大樣本驗(yàn)證，并進(jìn)行臨床和實(shí)驗(yàn)研究，以明確不同的差異性蛋白在DLASO中的作用和分子機(jī)制。

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Proteomics analysis on serum differential proteins between lower limb arteriosclerosis obliterans patients with and without type 2 diabetes mellitus

YANGXiaohu1,LINYuhui,XUXin,FANLonghua

(1TheAffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China)

Objective To identify the differentially expressed proteins between lower limb arteriosclerosis obliterans patients with type 2 diabetes mellitus (DLASO) and patients without type 2 diabetes mellitus (LASO) by the proteomic research. Methods Serum samples were separately collected from DLASO patients and LASO patients (15 cased in each group). Isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ)-tagging combined with two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry (2D LC-MS/MS ) analysis were used to identify the differentially expressed proteins between DLASO patients and LASO patients. The differentially expressed proteins were analyzed for biological processes, molecular effects and cell composition by using PANTHER database. Results Compared with LASO patients, a total of 27 differentially expressed proteins were identified in DLASO patients, 8 proteins were significantly up-regulated while 19 proteins were significantly down-regulated. Biological process analysis showed that the differential protein was mainly involved in cell reaction (48.1%), metabolic process (48.1%), and bioadhesion (29.6%). The results of molecular analysis showed that the differential protein was mainly involved in cell binding (33.3%), catalytic activity (29.6%), and structural molecule activity (18.5%). Cell composition analysis showed that the differential proteins were mainly located in the cell region (14.8%), organelles, (14.8%) and extracellular regions (14.8%).Conclusion Totally 27 differentially expressed proteins between DLASO and LASO patients are identified by proteomic research, which may be used as potential biological targets for the prevention and treatment of DLASO.

type 2 diabetes mellitus; lower limb arteriosclerosis obliterans; proteomics; isotope labelling; two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry; differentially expressed proteins

上海市科學(xué)技術(shù)發(fā)展基金資助項(xiàng)目(11ZR1406900)。

楊曉虎(1986-)，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)檠芗澳[瘤介入。E-mail: 3245941668@qq.com

范隆華(1968-)，男，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)檠芡饪啤-mail: fan.longhua@zs-hospital.sh.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.30.005

R543.5；R587.1

A

1002-266X(2017)30-0018-04

2017-02-16)