雷 激，黃承鈺

體外消化/Caco-2細(xì)胞模型分析發(fā)酵對面粉鐵生物利用率的影響

雷 激1，黃承鈺2

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成都 610041）

中國居民膳食以谷物為主食，谷物中鐵吸收率低是造成營養(yǎng)性貧血的主要原因，適當(dāng)?shù)募庸し绞娇删徑夤任镏兄菜?、多酚等物質(zhì)對鐵生物利用率（Fe bioavailability，F(xiàn)e BV）的影響。為考察酵母發(fā)酵對面粉Fe BV的影響，采用體外消化/Caco-2細(xì)胞模型。結(jié)果表明，面團(tuán)在發(fā)酵后pH值呈下降趨勢，酸度呈上升趨勢；多酚、植酸含量降低，植酸酶活性升高，以上各指標(biāo)在發(fā)酵前后差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。發(fā)酵后面粉樣品的Fe BV增加約5%～38%，大多數(shù)面粉Fe BV發(fā)酵前后比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：發(fā)酵可降低面粉的pH值，增加酸度，有利于面粉多酚和植酸的降解以及植酸酶活力的升高，可有效提高面粉Fe BV。

小麥面粉；鐵生物利用率；發(fā)酵；體外消化/Caco-2細(xì)胞模型

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，缺鐵性貧血是全球普遍存在的營養(yǎng)性缺乏癥，其發(fā)生率為兒童43%，非孕期婦女29%，孕婦38%[1]；中國居民膳食以小麥等谷物為主食，缺鐵現(xiàn)象在國內(nèi)尤其是貧困地區(qū)普遍存在。谷物類主食中含有大量的植酸、多酚類等抑制鐵吸收的因子，嚴(yán)重影響了鐵的生物利用率（Fe bioavailability，F(xiàn)e BV），導(dǎo)致人體鐵的普遍缺乏，谷物的鐵吸收率低是造成營養(yǎng)性貧血的主要原因[2]。

植酸、多酚等因素對小麥等谷物中鐵吸收利用的影響已被廣泛認(rèn)同[3-4]，如果能找到一種經(jīng)濟(jì)適用、操作簡便、符合人們飲食習(xí)慣的加工方法對小麥面粉進(jìn)行合理加工，降低面粉中植酸、多酚等抑制因子的含量，可望提高小麥的Fe BV，這對指導(dǎo)人們正確加工面粉、合理食用面粉、充分發(fā)揮小麥的功能、改善缺鐵人群的健康現(xiàn)狀將會產(chǎn)生積極的影響。資料顯示，適當(dāng)?shù)氖称芳庸し绞饺缃?、發(fā)芽、發(fā)酵等可緩解植酸對非血紅素鐵吸收的抑制作用[5-7]，國外有對小麥麩皮添加酵母[8]以及對面團(tuán)進(jìn)行乳酸發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)植酸含量可降低[9]，也有報(bào)道浸泡發(fā)芽處理蠶豆可降解其植酸和多酚[10]，還有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵可降低高粱和小米中多酚含量[11]，而有關(guān)面粉進(jìn)行酵母發(fā)酵對Fe BV的影響還鮮見報(bào)道。對面粉進(jìn)行酵母發(fā)酵是面粉加工常用的方法，人們食用的面包、饅頭、花卷、包子等食物都是面粉經(jīng)酵母發(fā)酵的產(chǎn)物，據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國北方約70%的小麥面粉用來做饅頭。

體外消化/Caco-2細(xì)胞模型法（in vitro/Caco-2 cell culture model）可經(jīng)濟(jì)、快速、簡便地評估食物中Fe BV，目前該模型已成為食物實(shí)驗(yàn)應(yīng)用最廣泛的模型，用于嬰兒食品的開發(fā)、農(nóng)業(yè)中富鐵植物品種的批量快速準(zhǔn)確篩選、藥物生產(chǎn)方面改良鐵補(bǔ)充劑的開發(fā)等，已有實(shí)驗(yàn)證明此法所測得的結(jié)果與人體實(shí)驗(yàn)鐵吸收率顯著相關(guān)[12-14]。

本研究通過對面粉添加酵母進(jìn)行發(fā)酵，采用體外消化/Caco-2細(xì)胞模型法考察發(fā)酵對其Fe BV的影響，從而為通過食品加工途徑改善植物性谷物中Fe BV提供理論依據(jù)，為人們合理加工和食用面粉提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥面粉：選取不同品種的小麥籽粒，采用蒸餾水沖洗并嚴(yán)格控制灰塵等的污染，晾干，Buhler實(shí)驗(yàn)?zāi)ブ品?，?0 種樣品，分別是出粉率78%的京冬8號、安陽中優(yōu)9507、北京中優(yōu)9507、新疆中優(yōu)9507、中麥9號、豫麥18、中麥175、豫麥2號和出粉率40%的豫麥18、中麥175。制粉后嚴(yán)密包裝-20 ℃保存。

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株（Caco-2） 四川大學(xué)華西藥學(xué)院保藏；低糖高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司。

MWCO15000透析膜 美國Spectrum Medical公司；6 孔板插入環(huán) 美國Corning公司；細(xì)胞培養(yǎng)液、MEM營養(yǎng)液等組成參照文獻(xiàn)[2]；VC、Chelex-100離子交換樹脂 美國Bio-Rad公司；鼠尾Ⅰ型膠原蛋白 美國BD生物公司；豬膽汁提取物、豬胰酶、豬胃酶、植酸鈉、植酸酶 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2孵箱 日本Sanyo公司；純水儀 美國Millipore公司；JY92-Ⅱ細(xì)胞超聲破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；SOLAAR M6原子吸收儀 美國Thermal Element公司；Lyolab 3000型真空冷凍干燥機(jī)、Ultra Freeze 3410型超低溫冰箱 丹麥Heto公司；5810R冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；pHs-3C+型酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞處理與指標(biāo)測定

細(xì)胞培養(yǎng)、樣品體外消化與吸收、細(xì)胞收集、細(xì)胞中蛋白質(zhì)和鐵蛋白測定、面粉植酸磷含量測定等操作參考文獻(xiàn)[2]。

1.3.2 小麥面粉發(fā)酵

按照活性干酵母說明書，每份面粉稱取100 g，加入面粉質(zhì)量0.5%的活性干酵母攪拌混勻，緩慢加入30～35 ℃超純水44～50 mL進(jìn)行攪拌和面，攪拌好的面團(tuán)放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵50 min。將發(fā)酵好的面團(tuán)迅速放入-70 ℃超低溫冰箱中冷凍3 h，取出放入凍干機(jī)中進(jìn)行干燥，36 h后取出粉碎，裝袋密封，于-20 ℃儲存?zhèn)溆肹2]，供發(fā)酵后面粉多酚、植酸（磷）、植酸酶、Fe BV的測定。

1.3.3 指標(biāo)測定

發(fā)酵前后及發(fā)酵過程中面粉pH值和酸度測定參考GB/T 5517—2010《糧油檢驗(yàn) 糧食及其制品酸度測定》方法[15]。各稱取面粉15 g，采用1.3.2節(jié)方法進(jìn)行面粉發(fā)酵，分別發(fā)酵0、10、20、30、40、50 min，于120 ℃加熱迅速終止酵母的作用，然后立即按GB/T 5517—2010方法制備樣液并測定面粉酸度，同時(shí)用酸度計(jì)測定面粉樣液的pH值，酸度以中和10 g糧食試樣所需0.1 mol/L堿液的體積來表示。

面粉總多酚含量采用Folin-Ciocalteu比色法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品[16]。

面粉植酸酶活力測定參考GB/T 18634—2009《飼用植酸酶活性的測定 分光光度法》[17]并稍作修改，反應(yīng)條件改為1.5 mmol/L植酸鈉、55 ℃、pH 5.15。酶活力單位定義為樣品（植酸酶）在55 ℃、pH 5.15條件下每分鐘使1.5 mmol/L植酸鈉溶液釋放1.0 μmol無機(jī)磷，即為一個(gè)植酸酶活力單位（U），其余同國標(biāo)。

1.3.4 面粉Fe BV計(jì)算

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中面團(tuán)pH值和酸度的變化如表1所示，面團(tuán)在發(fā)酵后pH值總體上呈下降趨勢，降幅絕對值為1.28～1.52，酸度則呈上升趨勢，升幅絕對值為0.11～2.28 mL/10 g。

表1 發(fā)酵過程中面粉pH值和酸度的變化Table 1 Changes in pH and acidity in wheat flour dough during yeast fermentation

2.2 發(fā)酵后面粉植酸酶活性和植酸磷含量的變化

表2 面粉發(fā)酵前后植酸磷含量和植酸酶活力變化Table 2 Changes in phytate phosphorus content and phytase activity before and after yeast fermentation

由表2可知，發(fā)酵后面粉中植酸酶活力上升約9%～40%，植酸磷（植酸）降低約6%～31%。經(jīng)t檢驗(yàn)，發(fā)酵前后植酸磷、植酸酶活力差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明發(fā)酵有利于面粉植酸的降解和植酸酶活力的升高。

2.3 發(fā)酵后面粉多酚含量的變化

10 種面粉發(fā)酵后多酚含量均呈下降趨勢，降幅約15%～42%，結(jié)果見表3。經(jīng)t檢驗(yàn)，發(fā)酵前后面粉多酚含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明發(fā)酵有利于面粉多酚的降解。

表3 發(fā)酵前后面粉多酚含量的變化Table 3 Changes in polyphenol content before and after yeast fermentation

2.4 發(fā)酵后面粉Fe BV的變化

表4 發(fā)酵前后面粉Fe BV比較Table 4 Fe bioavailability in 10 wheat flours before and after fermentation

由表4可知，發(fā)酵后10 個(gè)樣品的Fe BV比發(fā)酵前增加約5%～38%，對每一種面粉發(fā)酵前后的Fe BV進(jìn)行t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)除了40%出粉率的豫麥18和中麥175以及78%出粉率的新疆中優(yōu)9507之外，其余面粉的Fe BV在發(fā)酵后都顯著高于發(fā)酵前（P＜0.05），這說明發(fā)酵可顯著改善和提高大多數(shù)面粉Fe BV。

3 討 論

3.1 發(fā)酵過程中pH值變化的原因及其對其他因素的影響

發(fā)酵初期，由于剛攪拌的面團(tuán)中充有大量的空氣，酵母進(jìn)行旺盛的有氧呼吸，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，CO2氣體的不斷增多，面團(tuán)中的CO2是發(fā)酵過程中pH值下降的原因之一，同時(shí)氧氣被消耗，酵母又進(jìn)行無氧發(fā)酵。無氧發(fā)酵中在乙醛向酒精的轉(zhuǎn)化過程中酵母體內(nèi)也可能生成乙酸，會擴(kuò)散到面團(tuán)中，雖然它不是主要產(chǎn)物，但對pH值是有影響的。同時(shí)來自面粉的乳酸菌利用面粉的營養(yǎng)物開始發(fā)酵，生成乳酸等產(chǎn)物，由于乙酸、乳酸等酸的生成，使面團(tuán)的pH值下降[18-19]。

發(fā)酵過程中pH值的降低會使面粉中植酸和多酚含量產(chǎn)生不同程度的降低，從而改善面粉中鐵等微量元素的吸收率，原因如下陳述。

3.2 面粉發(fā)酵前后植酸、植酸酶變化的原因及其對Fe BV的影響

要提高食物中營養(yǎng)素的吸收率，食品加工方法非常重要，應(yīng)該是簡單易懂易接受、易制作的食物，在經(jīng)濟(jì)和勞動(dòng)力方面可行。發(fā)酵是眾所周知的降解植酸的方法之一，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到發(fā)酵后面粉植酸酶活性都有所升高，增幅約為9%～40%，而植酸含量則降低約6%～31%，同時(shí)面粉Fe BV則增加約5%～38%，各指標(biāo)變化在發(fā)酵前、后均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。發(fā)酵使植酸酶活性升高和植酸含量降低的原因與面粉內(nèi)源性植酸酶和外源性植酸酶（來自干酵母）有關(guān)，發(fā)酵過程中pH值降低會激發(fā)植酸酶活性[20-21]。植酸酶是一類水解植酸的磷酸酶類，大多數(shù)微生物植酸酶適宜pH值在酸性范圍內(nèi)，植物植酸酶適宜pH值在4.8～6.0之間。天然植物食品中含有內(nèi)源性植酸酶，一定條件下可以催化其中的植酸水解。酵母菌也會分泌產(chǎn)生植酸酶，Towo等[22]在對高梁粉進(jìn)行發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后高梁粉的植酸含量降低，原因是來自谷物和微生物的植酸酶使植酸含量下降，發(fā)酵時(shí)pH值在5.0左右與植酸酶最適pH值接近；植酸酶存在于多種谷物中，在發(fā)酵過程中會被激活，白色高粱發(fā)酵后植酸下降可溶性鐵大大增加；Frontela等[23]對出粉率分別為95%和80%的全麥面粉和普通面粉進(jìn)行發(fā)酵、焙烤制作面包，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后兩種面粉的植酸含量均顯著降低；Caputo等[24]發(fā)現(xiàn)一種釀酒酵母能顯著降低全麥面包中植酸的含量（約下降79%）；上述報(bào)道都與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合，面粉發(fā)酵過程中可達(dá)到植酸酶的最適pH值，因此推測發(fā)酵后面粉植酸含量降低是因?yàn)榘l(fā)酵過程中pH值下降到了植酸酶的最適pH值范圍，來自面粉和酵母菌的植酸酶活性都得到提高，從而降解植酸，由此減少了由植酸導(dǎo)致的對鐵等微量元素吸收的抑制作用，使Fe BV提高。

3.3 面粉發(fā)酵前后多酚變化的原因及其對Fe BV的影響

Prom-u-thai等[25]發(fā)現(xiàn)在糙米中Fe BV與多酚含量負(fù)相關(guān)，說明除植酸外多酚也可能是低生物利用率的原因之一，由于多酚往往與谷物顏色有關(guān)，其將水稻谷皮的顏色作為高Fe BV水稻篩選的指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)面粉發(fā)酵后多酚含量減少約16%～43%，面粉Fe BV增加約5%～38%，這2 個(gè)指標(biāo)在發(fā)酵前后的變化均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。面粉發(fā)酵所致多酚含量降低的原因可能是兩方面：發(fā)酵后多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性升高及有機(jī)酸的生成。PPO可氧化多酚生成醌類化合物，導(dǎo)致食品褐變，表現(xiàn)出面粉顏色加深[26]，這方面的研究很多[27]；同時(shí)PPO也可用于含多酚類的植物中以提高鐵等微量元素的利用率。多酚成分中有鄰位-二羥基基團(tuán)，可螯合鐵離子，使其在胃腸不被吸收。酚類物質(zhì)氧化后可減少螯合的鐵離子，從而提高鐵利用率[28-29]。Elyas等[30]發(fā)現(xiàn)珍珠米發(fā)酵后PPO活性被激活，多酚含量降低，Matuschek等[28]對去除了植酸的高單寧高粱粉用多種水果汁孵育，發(fā)現(xiàn)高梁粉經(jīng)果汁處理后多酚含量降低，體外可利用鐵增加，究其原因，主要還是水果中豐富的PPO使多酚氧化，其次是水果中有機(jī)酸的作用，提高了鐵利用率。這與本實(shí)驗(yàn)有相似之處，面粉發(fā)酵后有機(jī)酸生成，酸性條件下鐵溶解性增加，同時(shí)pH值降低后接近小麥PPO的最適pH 6.0[31]，使PPO活性上升，鐵吸收率增加。

4 結(jié) 論

對面粉進(jìn)行酵母發(fā)酵處理，發(fā)酵后面團(tuán)pH值降低，酸度增加，植酸酶活性顯著上升，植酸和多酚含量顯著下降，各方面的因素促進(jìn)了面粉發(fā)酵后Fe BV增加，可以認(rèn)為發(fā)酵可有效提高面粉Fe BV。

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Effects of Fermentation on Iron Bioavailability in Wheat Flour Assessed with an in Vitro Digestion/Caco-2 Cell Model

LEI Ji1, HUANG Chengyu2
(1. School of Food and Biotechnology, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. West China School of Public Health, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Cereals are the most important staple crops in China. However, cereals are low in iron (Fe) absorption, which is attributed as the major reason of nutritional anemia. Proper processing can relieve the inhibition of substances like phytic acid and polyphenol in grains on iron bioavailability (Fe BV). In this experiment, an in vitro digestion/Caco-2 cell model was used to assess the impact of yeast fermentation on Fe BV in wheat flour. Results demonstrated that after fermentation, the pH of wheat flour dough declined and consequently the acidity showed a rising trend. In addition, the contents of polyphenol and phytic acid declined and the phytase activity increased. All the above changes were statistically significant (P ＜ 0.05). Fe BV of flour samples increased by 5%–38% after fermentation, with significant differences (P ＜ 0.05) being observed for most wheat flours compared with that measured before fermentation. Fermentation can reduce the pH of wheat flour and increase the acidity, thereby promoting the degradation of polyphenol and phytic acid, increasing phytase activity, and effectively improving Fe BV in wheat flour.

wheat flour; Fe bioavailability; fermentation; in vitro digestion/Caco-2 cell model

10.7506/spkx1002-6630-201716015

R282.75

A

1002-6630（2017）16-0099-05

雷激, 黃承鈺. 用體外消化/Caco-2細(xì)胞模型觀察發(fā)酵對面粉鐵生物利用率的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 99-103. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716015. http://www.spkx.net.cn

LEI Ji, HUANG Chengyu. Effects of fermentation on iron bioavailability in wheat flour assessed with an in vitro digestion/ Caco-2 cell model[J]. Food Science, 2017, 38(16): 99-103. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716015. http://www.spkx.net.cn

2016-09-04

西華大學(xué)人才基金項(xiàng)目（R0910507）；四川省科技廳項(xiàng)目（2014NZ0078；2016NZYZF0028）

雷激（1966—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：jil765@163.com