王 泳，龔建苗，賈 彥，閻亞麗，龐廣昌，趙 培*，陳慶森*

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

乳源酪蛋白糖巨肽作用人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29調(diào)控炎癥活力研究

王 泳，龔建苗，賈 彥，閻亞麗，龐廣昌，趙 培*，陳慶森*

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

為進(jìn)一步闡釋乳源酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）的抗炎及修復(fù)腸道炎癥的功效，本研究在確定了乳源CGMP對脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29NF-κB亞單位p65蛋白的影響和乳源CGMP調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor，NF）-κB信號通路的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建表達(dá)乳源CGMP和NF-κB必需調(diào)節(jié)蛋白（NF-κB essential modulator，NEMO）的質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)HT-29細(xì)胞，免疫共沉淀測定兩個蛋白的相互作用。最后采用線粒體膜電位法測定乳源CGMP對HT-29細(xì)胞的促凋亡作用。結(jié)果表明，乳源CGMP與NEMO（NF-κB essential modulator）30 h共轉(zhuǎn)HT-29細(xì)胞中，乳源CGMP與NEMO蛋白均表達(dá)，且表現(xiàn)出二者的相互作用。乳源CGMP可與NEMO相互作用影響NF-κB信號通路；同時乳源CGMP還促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡，呈時間依賴性，其中0.1 μg/mL的CGMP作用效果最好。乳源CGMP與NEMO相互作用是間接作用于IκB激酶（IκB kinase，IKK）而作用于 IκB，進(jìn)而影響NF-κB信號通路。研究揭示了乳源CGMP調(diào)控NF-κB信號通路的另一種途徑，也充分說明乳源CGMP可通過作用多種抗炎途徑發(fā)揮其調(diào)控作用。

酪蛋白糖巨肽；結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29；NF-κB信號途徑；NF-κB必需調(diào)節(jié)蛋白；細(xì)胞凋亡

引文格式：

王泳, 龔建苗, 賈彥, 等. 乳源酪蛋白糖巨肽作用人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29調(diào)控炎癥活力研究[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(15): 201-207. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715033. http://www.spkx.net.cn

WANG Yong, GONG Jianmiao, JIA Yan, et al. Milk-derived casein glycomacropeptide (CGMP) regulates in fl ammation in human colon carcinoma cells HT-29[J]. Food Science, 2017, 38(15): 201-207. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715033. http://www.spkx.net.cn

食品通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)免疫網(wǎng)絡(luò)、信息傳遞網(wǎng)絡(luò)和代謝網(wǎng)絡(luò)，從而控制機體的健康和生命活動[1-2]。乳源酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）是一種非常重要的乳源生物活性肽[3-4]，到目前為止，人們已經(jīng)從不同角度探討了乳源CGMP對機體健康的生物學(xué)功效，但對功能特性和作用機制進(jìn)行論證與探討的報道不多。本課題組圍繞乳源CGMP的分離純化[5]和生物學(xué)活性評價以及相關(guān)信號通路等方面開展了研究[6-25]，包括從調(diào)控和恢復(fù)腸道潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）的角度，全面地研究并闡述了乳源CGMP對腸黏膜細(xì)胞因子及其網(wǎng)絡(luò)的影響[7,11,14,19]、與保護(hù)腸黏膜完整性有關(guān)的黏膜屏障因子的表達(dá)水平[9-10,21]、對腸黏膜細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[17-18]、對UC小鼠抗凋亡的作用機制[12,20]、對相關(guān)信號通路途徑[15,22-23]和對腸道黏膜以及糞便微生物菌群多樣性的作用[24-25]；同時還從表觀遺傳學(xué)的角度闡述了乳源CGMP對早期結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的抑制作用[16]。本課題組研究成果與Groux等[26]報道的研究結(jié)果一致。前期研究結(jié)果提示，乳源CGMP作為生物活性物質(zhì)通過參與腸黏膜免疫應(yīng)答，促進(jìn)腸黏膜屏障因子的適時表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞亞群的平衡，表現(xiàn)出明顯的抵御腸道炎癥的能力，作為一種營養(yǎng)治療方案有可能成為緩解、修復(fù)和治療炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的一種新功能性成分。

各種免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)細(xì)胞所表達(dá)的與炎癥介導(dǎo)物相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)問題也一直是免疫學(xué)領(lǐng)域關(guān)注和研究的熱點。外界刺激分子可以特異性地與免疫細(xì)胞表面的各種受體相結(jié)合，隨后誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的過程，包括受體識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)3 個過程。信號傳導(dǎo)會引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)活性、細(xì)胞膜通透性、基因表達(dá)狀況、細(xì)胞形態(tài)和功能等各方面的變化。Requena等[27]研究發(fā)現(xiàn)，牛乳糖巨肽（bovine glycomacropeptide，BGMP）可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor，NF）-κB和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，上調(diào)人單核細(xì)胞腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-8的分泌，并認(rèn)為BGMP在腸道中可能起到抗炎的作用。本課題組前期從分子生物學(xué)角度開展了口服乳源CGMP干預(yù)UC模型小鼠，研究探討NF-κB p65的表達(dá)水平與UC的發(fā)展?fàn)顩r的相關(guān)性，表明NF-κB p65表達(dá)水平在UC發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[23]。推測作為乳源糖肽的乳源CGMP可能與NF-κB p65分子結(jié)合，阻止了p65上的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（transactivation domain，TAD）與DNA的結(jié)合，從而減弱其活性。說明乳源CGMP可能作為NF-κB活性的負(fù)調(diào)控因子[22]，即可用它的活性狀況作為一個有效治療靶點，為治療炎癥性腸病提供了更有力的理論支撐。

NF-κB必需調(diào)節(jié)蛋白（NF-κB essential modulator，NEMO）是NF-κB信號通路中的小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）修飾蛋白，是細(xì)胞質(zhì)IκB激酶（IκB kinase，IKK）復(fù)合物的一部分，又叫NF-κB基本調(diào)節(jié)器（NF-κB essential modulator，NEMO），其是NF-κB信號通路中的小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）修飾蛋白，是細(xì)胞質(zhì)IκB激酶（IκB kinase，IKK）復(fù)合物的一部分，又叫IκB激酶γ（IκB kinase-gamma，IKKγ），IKKγ對細(xì)胞的DNA損傷起反應(yīng)。本課題組前期研究表明，乳源CGMP可顯著降低NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白IκBα的降解，其機制是抑制了IκBα的磷酸化和泛素化，使p-IκBα和泛素化關(guān)鍵蛋白E3RSIκB和UBC5的表達(dá)均有所下降，進(jìn)而減少了IκBα的降解，增加了IκBα-p65-p50蛋白三聚體的數(shù)量，使NF-κB p65蛋白核移位效應(yīng)降低，進(jìn)而減少下游基因的表達(dá)，闡釋了乳源CGMP是通過調(diào)控NF-κB信號通路以發(fā)揮抗炎的作用。

基于以上分析，據(jù)本課題組前期研究結(jié)果得知，乳源CGMP作為生物活性物質(zhì)在改善、修復(fù)和治療IBD方面具有潛在的功效和優(yōu)勢，本研究采用結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，經(jīng)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激干預(yù)后分別用免疫共沉淀法和線粒體膜電位法測定乳源CGMP對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白的影響，確定相應(yīng)的作用靶點，更進(jìn)一步地探討并闡述乳源CGMP調(diào)控NF-κB信號途徑，為確定乳源CGMP的抗炎分子機制以及維護(hù)相關(guān)腸黏膜內(nèi)環(huán)境生物學(xué)活性功能提供科學(xué)依據(jù)，使乳源CGMP作為功能性食品用于炎癥性腸病的生物免疫治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CGMP 新西蘭Tatua公司；人類結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29江蘇齊氏生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

倒置顯微鏡 日本Nikon公司；CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；多功能讀板機 美國Molecular Devices公司；迷你雙垂直電泳槽、迷你轉(zhuǎn)印電泳槽、電泳儀 北京六一儀器廠；高速冷凍離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 HT-29細(xì)胞培養(yǎng)

[21-22]，HT-29細(xì)胞在含有10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞對數(shù)期時進(jìn)行實驗。

1.3.2 乳源CGMP對HT-29細(xì)胞NF-κB信號途徑中調(diào)節(jié)蛋白NEMO的影響

1.3.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)和測序

通過http://www.ncbi.nih.gov/、http://www.hprd.org/網(wǎng)站查找出目的蛋白編碼基因的序列及結(jié)構(gòu)，由美國復(fù)能基因公司合成序列，并將乳源CGMP全長cDNA構(gòu)建在pCMV-Myc載體上，將NEMO/IKKγ開放閱讀框序列構(gòu)建到pCMV-Flag載體上。測序由生工生物工程股份有限公司完成。

1.3.2.2 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞

接種細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前1 d，用胰酶消化細(xì)胞并計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞以106個/孔鋪入6 孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)液。

準(zhǔn)備DNA-EndoFectinTM復(fù)合物：將DNA、EndoFectinTM試劑和稀釋劑（無血清DMEM高糖培養(yǎng)液）升至室溫。6孔板每孔加入DNA 0.4～6.0 μg，稀釋到50～200 μL，每1 μg DNA需用 3.0 μL EndoFectinTM試劑，EndoFectinTM試劑與DNA稀釋體積一致。一邊輕輕渦旋裝有DNA溶液的試管，一邊將稀釋的 EndoFectinTM試劑滴加至試管中（勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置10～25 min以形成DNA-EndoFectinTM復(fù)合物。

轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞：待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時，直接向每個孔中加入DNA-EndoFectinTM復(fù)合物并輕輕渦旋培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿。在無血清條件下轉(zhuǎn)染時，去除生長培養(yǎng)基，替換成無血清培養(yǎng)基，然后滴加DNA-EndoFectinTM復(fù)合物。轉(zhuǎn)染3 h后，添加1/2體積的含30%血清的生長培養(yǎng)基。

孵育細(xì)胞和分析結(jié)果：在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃條件下下分別孵育細(xì)胞0、20、28、36 h，提取蛋白進(jìn)行檢測。

1.3.2.3 非變性裂解液提取細(xì)胞總蛋白

去除培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗一遍，洗去血清中的IgG。每孔加入添加蛋白酶抑制劑的裂解液200 μL，混勻，使裂解液和細(xì)胞充分接觸，冰上孵育5～10 min，為促進(jìn)細(xì)胞裂解，可用槍頭輕輕吹打。4 ℃、12 000×g離心5 min。盡快將上清液轉(zhuǎn)入一支預(yù)冷的潔凈無菌的微量離心管，即得細(xì)胞總蛋白。

1.3.2.4 轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞的Western blotting檢測

NEMO轉(zhuǎn)染總蛋白含量測定參照文獻(xiàn)[22]，乳源CGMP分子質(zhì)量約為7 kD，采用小分子Tricine-PAGE電泳，具體操作如下：1）Tricine-PAGE凝膠制備（雙面）：將玻璃板用蒸餾水清洗干凈，再用75%的酒精去脂，干燥后固定在灌膠支架上；按配方4.522 mL分離膠貯存液、3.333 mL分離膠緩沖液、1.067 mL甘油、2.233 mL雙蒸水、34 μL 10%過硫酸銨（ammonium persulfate，AP）和4 μL四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）制備分離膠，加入TEMED后輕輕振蕩混勻，迅速注入安裝好的玻璃板的間隙中，留出足夠的空間（分離膠厚度約4 cm、堆積膠厚度約1.5 cm、空間膠厚度約2 cm）。在丙烯酰胺溶液上覆蓋一層水飽和的正丁醇，以防止空氣擴散到凝膠中抑制聚合作用；在室溫條件下，凝膠應(yīng)在60 min左右聚合完成。倒掉覆蓋層并用蒸餾水清洗凝膠頂部數(shù)次，并用濾紙條吸凈殘留的蒸餾水。按配方0.6 mL分離膠貯存液、0.667 mL分離膠緩沖液、1.38 mL雙蒸水、43 μL10% AP和3 μL TEMED制備空間膠，加入TEMED后輕輕振蕩混勻，迅速注入分離膠上方，在丙烯酰胺溶液上覆蓋一層水飽和的正丁醇；在室溫條件下，凝膠應(yīng)在40 min左右聚合完成。倒掉覆蓋層并用蒸餾水清洗凝膠頂部數(shù)次，并用濾紙條吸凈殘留的蒸餾水。按配方0.741 mL堆積貯存液、0.542 mL堆積膠緩沖液、2.94 mL雙蒸水、43 μL 10% AP和3 μL TEMED制備堆積膠，加入TEMED后輕輕振蕩混勻，迅速注入空間膠上方，立即插入干凈的梳子，不要混入氣泡，以免影響凝膠的聚合；在室溫條件下，凝膠應(yīng)在30 min左右聚合完成。堆積膠聚合后小心移去梳子，避免破壞加樣孔，用蒸餾水小心清洗加樣孔，以除去未聚合的丙烯酰胺。2）加樣：將凝膠固定在電泳裝置上，電泳上槽內(nèi)加入陰極緩沖液沒過加樣孔，并確保沒有陰極緩沖液從電泳上槽漏出；電泳下槽內(nèi)加入陽極緩沖液，傾斜整個裝置以趕走凝膠下面可能留有的氣泡。按預(yù)定順序加樣，每孔加入20 μL。3）電泳：將電泳裝置與電源連接進(jìn)行電泳，樣品在堆積膠和空間膠階段電壓為70 V，而在分離膠階段電壓調(diào)整為120 V。直到溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底部后，關(guān)閉電源，這個過程大約需要3 h。4）濕法轉(zhuǎn)膜：取出玻璃板并撬開，留取所需分離膠置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，預(yù)先裁好與膠條大小相同的濾紙和PVDF膜，將PVDF膜于甲醇中活化1 min后，將其與濾紙一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15 min。轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極板、2 層濾紙、PVDF膜、凝膠、2 層濾紙、陰極板的順序放好，濾紙、凝膠與PVDF膜精確對齊，每一步必須確保除去氣泡，然后用迷你濕式轉(zhuǎn)印電泳槽200 mA恒流轉(zhuǎn)移1 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5）后續(xù)Western blotting操作參見文獻(xiàn)[22]。

蛋白條帶的灰度積分值分析：將得到的膠片進(jìn)行拍照，利用QuantityOne凝膠成像分析軟件得到各個目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度積分值，確定轉(zhuǎn)染效果，進(jìn)行后續(xù)操作。

1.3.2.5 免疫共沉淀法測定乳源CGMP與NEMO的相互作用

將含有Flag、Myc標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)載體共轉(zhuǎn)HT-29細(xì)胞，轉(zhuǎn)染30 h后用預(yù)冷的PBS沖洗3 次，收集細(xì)胞（離心后的細(xì)胞沉淀于-80 ℃保存）。蛋白提取和蛋白含量測定參照文獻(xiàn)[22]。采用c-Myc Taq IP試劑盒，取Handee?離心柱管，將底部的塞子塞上，加上適量的細(xì)胞裂解液到離心管。用150 μL TBS稀釋50 μL c-Myc標(biāo)簽作為陽性對照。在分配之前迅速翻轉(zhuǎn)小瓶幾次達(dá)到完全重懸抗c-Myc標(biāo)簽瓊脂糖（不要渦旋），用寬口槍頭將10 μL抗c-Myc標(biāo)簽瓊脂糖懸濁液（5 μg抗c-Myc標(biāo)簽抗體）分配到每個標(biāo)記的離心管中，擰緊蓋子。在4 ℃條件下上下翻轉(zhuǎn)孵育混合至少1 h，最佳的孵育時間從2 h至過夜。松開離心管的上蓋，拔掉底部的塞子，將收集管放在離心管的底部，離心10 s，丟掉液體（或者收集后用于將來的分析）。加入0.5 mL TBST到每個管中。輕輕擰緊蓋子并輕柔的翻轉(zhuǎn)帶收集管的離心管2～3 次，離心10 s。去掉洗脫液（或者收集后用于將來的分析），重復(fù)該步驟兩次。將離心管放到新的收集管中。加入25 μL 2×非還原性樣本緩沖液到抗c-Myc標(biāo)簽瓊脂糖，輕輕擰上蓋子，并輕輕敲打管子以混勻。95～100 ℃加熱裝配的離心柱/收集管5 min，離心10 s。準(zhǔn)備Western blotting，用Myc沉淀，檢測Flag標(biāo)簽的NEMO蛋白，方法參照文獻(xiàn)[22]。

1.3.3 乳源CGMP對HT-29細(xì)胞凋亡影響的研究

細(xì)胞分組培養(yǎng)：細(xì)胞以5 000 個/孔傳代于96 孔黑色底透微孔板，每孔100 μL，用含10%的胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞至60%～70%時，用無血清培養(yǎng)基同步化6 h，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌1 次。研究分8 組：空白組（N組）、LPS組（L組）、CGMP組（C1組：0.001 μg/mL、C2組：0.010 μg/mL、C3組：0.100 μg/mL、C4組：1.000 μg/mL、C5組：10.000 μg/mL、C6組：100.000 μg/mL），每組6 個復(fù)孔。37 ℃、5% CO2條件下孵育6、12、24、48 h和72h。

羅丹明123（Rhodamine 123，Rh123）孵育細(xì)胞：到相應(yīng)時間點時，用預(yù)熱到37 ℃的PBS洗2～3次，吸棄PBS后，每孔加入5 μg/mL的羅丹明123 100 μL，37 ℃、5% CO2條件下孵育1 h。

洗滌：用預(yù)熱到37 ℃的PBS洗3 次，每次盡量吸棄液體又保持細(xì)胞表面濕潤，最后一次吸盡液體。

多功能讀板機測定：每孔加入100 μL PBS，測定激發(fā)光波長507 nm，發(fā)射光波長529 nm條件下的熒光強度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，進(jìn)行單因素方差分析，處理結(jié)果以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳源CGMP對HT-29細(xì)胞NF-κB信號途徑中調(diào)節(jié)蛋白NEMO的影響

2.1.1 表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)和測序

通過測定260 nm波長處吸光度測定DNA的質(zhì)量濃度分別為pCMV-Myc 401 ng/μL、pCMV-Flag 466 ng/μL，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，結(jié)果如圖1所示，生工生物工程股份有限公司測序，結(jié)果經(jīng)過比對為正確序列。

圖1 pCMV-Myc-CGMP（A）、pCMV-Flag-NEMO（B）轉(zhuǎn)染細(xì)胞后Western blotting檢測Fig. 1 pCMV-Myc-CGMP (A) and pCMV-Flag-NEMO (B) expression in HT-29 cells after transfection detected by Western blotting

2.1.2 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞

將插入目的片段的pCMV-Myc-CGMP、pCMVFlag-NEMO分別轉(zhuǎn)染到HT-29細(xì)胞中，表達(dá)標(biāo)簽蛋白質(zhì)，其中轉(zhuǎn)染0 h為空白組（N）。細(xì)胞裂解液樣品用Western blotting法檢測，得到分子質(zhì)量正確的蛋白質(zhì)條帶（圖1）。其中Myc-CGMP在20 h就有較高的表達(dá)量，而Flag-NEMO在20 h時表達(dá)量還比較少，隨時間延長，F(xiàn)lag-NEMO表達(dá)量增大，28 h時表達(dá)量已經(jīng)很高。

2.1.3 乳源CGMP與NEMO的相互作用

NEMO/IKKγ作為NF-κB通路機制研究中一個靶點，用免疫共沉淀技術(shù)證實乳源CGMP和NEMO/IKKγ的相互作用。

免疫共沉淀是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。為了確證乳源CGMP與NEMO/ IKKγ的相互作用，用pCMV-Myc-CGMP載體和pCMVFlag-NEMO載體共轉(zhuǎn)染于HT-29細(xì)胞，以Myc作為IP抗體，每組設(shè)立相應(yīng)的陰性對照組，Western blotting法檢測每組Flag-NEMO的表達(dá)（圖2）。

圖2 CGMP與NEMO免疫共沉淀結(jié)果Fig. 2 Verif i cation of CGMP and NEMO/IKKγ interaction by Co-IP

由圖2中WB：Myc、WB：Flag可以看到pCMV-Myc-CGMP質(zhì)粒和pCMV-Flag-NEMO質(zhì)粒共轉(zhuǎn)HT-29后，乳源CGMP與NEMO/IKKγ蛋白均表達(dá)，通過IP：Myc可以看到在過表達(dá)條件下乳源CGMP與NEMO/IKKγ有明顯的相互作用，只是因為兩者分子質(zhì)量相差1 kD條帶分開不明顯，但可明顯看到在lgG（L）表達(dá)量相差不大的情況下，兩者共轉(zhuǎn)后IP經(jīng)Western blotting檢測條帶明顯寬于其中任何一個單獨轉(zhuǎn)染，證明兩者存在明顯的相互作用。

2.2 乳源CGMP對HT-29細(xì)胞凋亡的影響

本研究對于加入LPS、乳源CGMP后是否對HT-29細(xì)胞的存活有影響，而發(fā)生不科學(xué)的研究數(shù)據(jù)，本實驗選擇Rh123試劑通過熒光信號的強弱來檢測線粒體膜電位的變化和凋亡的發(fā)生。不同劑量乳源CGMP作用下線粒體膜電位的變化見圖3。

圖3 線粒體膜電位測定HT-29細(xì)胞凋亡Fig. 3 Verif i cation of HT-29 cell apoptosis by mitochondrial transmembrane potential

由圖3可知，隨著作用時間延長，各組線粒體膜電位均呈增加趨勢；L組與N組相比線粒體膜電位均略低；相同孵育時間時，CGMP組隨質(zhì)量濃度的增加，線粒體膜電位均先增加后降低，在0.1 μg/mL時膜電位最大。研究發(fā)現(xiàn)CGMP作用6 h時，與N組相比，C2和C3組顯著促進(jìn)了LPS刺激下線粒體膜電位的增加（P＜0.05），其中C3具有極顯著性（P＜0.01），其他各組作用不顯著；與L組相比，C2、C3和C4組顯著促進(jìn)了線粒體膜電位的增加（P＜0.05），C1、C5和 C6組也使線粒體膜電位有所增加，且高于N組，但不具有顯著性。另外CGMP作用12 h時，與N組相比，C2、C3、C4和C5組顯著促進(jìn)了LPS刺激下線粒體膜電位的增加（P＜0.05），其中C3和C4具有極顯著性（P＜0.01）；與L組相比，C2、C3、C4和C5組顯著促進(jìn)了線粒體膜電位的增加（P＜0.05，P＜0.01），C1和C6組也使線粒體膜電位有所增加且高于N組，但不具有顯著性。當(dāng)CGMP作用24 h時，與N組相比，C2、C3、C4和C5組顯著促進(jìn)了LPS刺激下線粒體膜電位的增加（P＜0.05），其中C3和C4具有極顯著性（P＜0.01）；與L組相比，C2、C3、C4和C5組顯著促進(jìn)了線粒體膜電位的增加（P＜0.05），C1和C6組也使線粒體膜電位有所增加且高于N組，但不具有顯著性。當(dāng)CGMP作用48 h時，與N組相比，C1、C2、C3、C4和C5組顯著促進(jìn)了LPS刺激下線粒體膜電位的增加（P＜0.05），其中C3和C4組具有極顯著性（P＜0.01）；與L組相比，C1、C2、C3、C4和C5組顯著促進(jìn)了線粒體膜電位的增加（P＜0.05），其中C3具有極顯著性（P＜0.01）。當(dāng)CGMP作用72 h時，與N組相比，C3和C4組顯著促進(jìn)了LPS刺激下線粒體膜電位的增加（P＜0.05），其他各組作用不顯著；與L組相比，C1、C2、C3、C4和C5組顯著促進(jìn)了線粒體膜電位的增加（P＜0.05），其中C3組具有極顯著性（P＜0.01），C6組雖略高于N組，但不具有顯著性（P＞0.05）。

3 討 論

研究顯示基因毒性應(yīng)力導(dǎo)致NEMO通過位點特異性SUMO-1 結(jié)合于NLS[15,30]。IκB的激活降解依賴IKK，所以，NEMO的SUMO化可以影響NF-κB信號途徑的轉(zhuǎn)錄激活。基因剔除實驗表明，NEMO的完整是IKK活性和NF-κB的激活的前提[31]。DNA損傷反應(yīng)引發(fā)RIP1（death receptor-interacting protein 1）、PIDD（P53-induced death domain protein 1）等活化，導(dǎo)致NEMO的SUMO化并向核內(nèi)遷移促進(jìn)NF-κB活化，在DNA損傷誘導(dǎo)NF-κB激活過程中起關(guān)鍵作用[32]。DNA損傷還激活激酶ATM（DNA損傷感應(yīng)器分子），導(dǎo)致NEMO磷酸化和泛素化，并遷回細(xì)胞質(zhì)調(diào)節(jié)IKK的活化。在氧化應(yīng)激作用下，DNA損傷致DNA雙鏈斷裂，導(dǎo)致連接于NEMO和促進(jìn)S85磷酸化的ATM激活，然后使NEMO泛素化，NEMO和ATM轉(zhuǎn)出細(xì)胞核，轉(zhuǎn)出的NEMO和ATM促進(jìn)IKK的激活，導(dǎo)致IκBα降解而使NF-κB激活[33]。NEMO在NF-κB激活中如此重要，乳源CGMP是否與其相互作用呢？我們用免疫共沉淀技術(shù)探討NEMO/IKKγ和乳源CGMP是否發(fā)生相互作用。分析結(jié)果顯示，分別將插入目的片段的pCMVMyc-CGMP、pCMV-Flag-NEMO轉(zhuǎn)染到HT-29細(xì)胞中，在20 h時Myc-CGMP就有較高的表達(dá)量，F(xiàn)lag-NEMO在20 h時表達(dá)量還比較少，28 h時表達(dá)量已經(jīng)很高，隨轉(zhuǎn)染時間增加，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒目的蛋白表達(dá)的量增加，故選取30 h為轉(zhuǎn)染時間共轉(zhuǎn)HT-29細(xì)胞中。由圖2可以看出，存在兩個條帶，其原因可能是抗體、目的蛋白、Protein A/G beads三者之間是以非共價健結(jié)合在一起，只有Protein A/G與瓊脂糖珠是共價結(jié)合在一起的。因此，最后經(jīng)過添加含巰基乙醇的加樣緩沖液以及煮沸變性并離心出去Protein A/G beads后，離心管只有抗體和目的蛋白以及少量非特異性吸附蛋白。這樣十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中就含有目的蛋白和抗體二種蛋白，由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇從而導(dǎo)致抗體的重鏈與輕鏈之間的二硫鍵被破壞從而使得抗體分子變成重鏈分子（50 kD）和輕鏈分子（20 kD）。因此，Western blotting顯色反應(yīng)中除了能檢測到目的蛋白外，由于本實驗使用的二抗與用于免疫沉淀實驗的抗體分子屬于同一種屬，故還能檢測到重鏈和輕鏈分子。由圖1還可以看到，質(zhì)粒共轉(zhuǎn)HT-29細(xì)胞后，乳源CGMP與NEMO/IKKγ蛋白均表達(dá)，通過IP：Myc可以看到在過表達(dá)條件下乳源CGMP與NEMO/IKKγ有明顯的相互作用，有不少的Flag-NEMO蛋白被沉降下來，只是因為lgG（L）與Flag-NEMO兩者分子質(zhì)量僅相差1 kD，條帶不好分開，但可明顯看到在lgG（L）表達(dá)量相差不大的情況下，兩者共轉(zhuǎn)后IP經(jīng)WB條帶（IP：Myc）第三列第一行條帶明顯寬于其中任何一個單獨轉(zhuǎn)染的條帶，證明兩者存在明顯的相互作用，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的乳源CGMP可以通過一定的作用力與NEMO結(jié)合，進(jìn)而影響其激活NF-κB，但其具體結(jié)合到NEMO的哪個結(jié)合域上還有待進(jìn)一步研究。

研究已經(jīng)證實，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，線粒體會發(fā)生一系列的變化：線粒體通透性增加，大量可溶性蛋白釋放到胞漿（大多數(shù)可溶性蛋白帶負(fù)電荷），使膜間隙的正離子不斷進(jìn)入基質(zhì)，導(dǎo)致內(nèi)膜兩側(cè)的離子梯度消失，從而使膜電位下降[34]，因此用Rh123線粒體膜電位檢測細(xì)胞凋亡。細(xì)胞色素c從線粒體釋放，并與細(xì)胞凋亡激活因子1（apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1）結(jié)合，從而活化caspase-9前體，進(jìn)而激活caspase-3，引發(fā)Caspases級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。圖3表明，各個質(zhì)量濃度的CGMP促進(jìn)了LPS刺激下HT-29細(xì)胞的凋亡，與N組相較，L組細(xì)胞凋亡程度均有所下降，即LPS抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29凋亡，但不具有顯著性。隨作用時間增加，CGMP促進(jìn)細(xì)胞凋亡程度逐漸增大，呈時間依賴性，隨CGMP質(zhì)量濃度增加，各個時間點的細(xì)胞凋亡程度均先增加后降低，其中0.1 μg/mL的CGMP作用效果最好，每個作用時間較N組和L組均具有差異顯著性，此外，0.01 μg/mL和1 μg/mL的CGMP作用效果也較好，除6 h和72 h外，較N組和L組均具有顯著性提高，質(zhì)量濃度最高的100 μg/mL CGMP作用效果最不好，無論與N組還是L組相較均不具有顯著性，說明并非質(zhì)量濃度越高作用效果越好。

4 結(jié) 論

本實驗利用免疫共沉淀技術(shù)驗證了乳源CGMP可與NEMO相互作用，說明乳源CGMP可間接作用于IKK而作用于IκB，實現(xiàn)調(diào)控NF-κB信號途徑的激活。研究闡述了乳源CGMP表現(xiàn)促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡的能力，而NF-κB信號途徑抗細(xì)胞凋亡，這可能是乳源CGMP調(diào)控NF-κB信號途徑的另一方式。進(jìn)一步研究確定乳源CGMP具有顯著的調(diào)節(jié)NF-κB信號途徑，改善炎癥性腸病引發(fā)的結(jié)直腸癌的作用。

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Milk-Derived Casein Glycomacropeptide (CGMP) Regulates Inf l ammation in Human Colon Carcinoma Cells HT-29

WANG Yong, GONG Jianmiao, JIA Yan, YAN Yali, PANG Guangchang, ZHAO Pei*, CHEN Qingsen*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

To further elucidate the anti-inflammatory activity of casein glycomacropeptide (CGMP) and its efficacy in enhancing recovery from intestinal inf l ammation, the effect of CGMP on the NF-κB p65 subunit in colon carcinoma cells HT-29 treated with lipopolysaccharide (LPS) and its role in regulating the NF-κB signaling pathway were determined. Furthermore, plasmids were constructed to express CGMP and NF-κB essential modulator (NEMO) and then used to co-transfect HT-29 cells. Co-immunoprecipitation was used to identify the interaction between the expressed proteins. Finally, we detected the pro-apoptotic effect of CGMP on HT-29 cells by measuring the change in mitochondrial transmembrane potential. The experimental results indicated that after 30 h transfection of HT-29 cells, the co-expression and interaction of CGMP and NEMO were conf i rmed. CGMP affected the NF-κB signaling pathway through its interaction with NEMO with a concomitant increase in apoptosis of HT-29 cells in a time-dependent manner. This effect of CGMP was maximum at 0.1 μg/mL. In conclusion, the interaction of CGMP and NEMO can indirectly affect IKK (IκB kinase) and therefore the NF-κB signaling pathway through IκB. The study revealed another way CGMP could regulate the NF-κB signaling pathway, and fully indicated that there are multiple ways CGMP could execute anti-inf l ammatory effect.

casein glycomacropeptide (CGMP); colon carcinoma cells HT-29; NF-κB signaling pathway; NF-κB essential modulator (NEMO); apoptosis

10.7506/spkx1002-6630-201715033

TS252

A

1002-6630（2017）15-0201-07

2016-09-29

國家自然科學(xué)基金面上項目（31071522）；天津商業(yè)大學(xué)國家基金培育項目（160120）

王泳（1993—），女，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵生物技術(shù)、食源性生物活性物質(zhì)與腸道健康。E-mail：15620616749@163.com

*通信作者：趙培（1978—），女，碩士，研究方向為食源性生物活性物質(zhì)與腸道健康。E-mail：zhaopei@tjcu.edu.cn陳慶森（1957—），男，教授，碩士，研究方向為發(fā)酵生物技術(shù)、食源性生物活性物質(zhì)與腸道健康。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn