高月淑， 許敬亮， 袁振宏， 蔣劍春*， 何敏超， 張 寧

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，江蘇 南京 210042; 2.中國(guó)科學(xué)研究院 廣州能源研究所， 廣東 廣州 510640)

黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶的分離純化與鑒定研究

高月淑1， 許敬亮2， 袁振宏2， 蔣劍春1*， 何敏超2， 張 寧1

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，江蘇 南京 210042; 2.中國(guó)科學(xué)研究院 廣州能源研究所， 廣東 廣州 510640)

木聚糖酶的分離純化是對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)研究和分子改良研究的基礎(chǔ)。利用實(shí)驗(yàn)室選育的黑曲霉菌株AspergillusnigerSM24/a進(jìn)行木聚糖酶發(fā)酵，粗酶液經(jīng)過(guò)(NH4)2SO4分級(jí)沉淀Bio-Gel P6除鹽、UNO sphere Q陰離子交換和Enrich SEC70凝膠色譜層析四個(gè)步驟的分離純化，成功獲得了3種木聚糖酶蛋白定義為X-Ⅰ、X-Ⅱ和X-Ⅲ。隨著純化步驟的增加，各組分酶比活力得到顯著提高，其數(shù)值分別為37.41、34.56和53.96 U/mg，純化倍數(shù)分別為3.96、3.66和5.72。經(jīng)質(zhì)譜分析和蛋白氨基酸序列比對(duì)，初步認(rèn)定X-Ⅰ屬于糖基水解酶第十家族內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶，X-Ⅱ和X-Ⅲ均屬于糖基水解酶第十一家族木聚糖酶。

黑曲霉；木聚糖酶；分離純化；鑒定

植物半纖維素的主要組分是木聚糖, 主鏈由β-1,4-糖苷鍵連接吡喃型木糖殘基構(gòu)成。木聚糖主鏈的降解至少需要木聚糖酶(eno-xylanase, EC 3.2.1.8)和β-木糖苷酶(β-xylosidase,EC 3.2.1.37)協(xié)同作用，其中木聚糖酶作用于木聚糖主鏈骨架，將其降解為木寡糖，同時(shí)伴有少量木糖、阿拉伯糖和甘露糖，是降解木聚糖的關(guān)鍵酶[1-2]。另外，外切木聚糖酶(eno-xylanase, EC 3.2.1.37)對(duì)木聚糖到木糖的降解過(guò)程也有明顯促進(jìn)作用[3]。木聚糖酶可廣泛應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化、食品、飼料、造紙等行業(yè)[4-6]，尤其隨著人們對(duì)生物質(zhì)能源的關(guān)注，對(duì)包括木聚糖酶在內(nèi)的纖維素酶系研究日益增多[7-9]，木聚糖酶的分離純化可以為其酶學(xué)性質(zhì)及分子克隆研究奠定基礎(chǔ)。本研究選用黑曲霉菌株AspergillusnigerSM24/a進(jìn)行木聚糖酶發(fā)酵，通過(guò)(NH4)2SO4分級(jí)沉淀、Bio-Gel P6除鹽、UNO sphere Q陰離子交換和Enrich SEC70凝膠色譜，分離純化到3種木聚糖酶，并通過(guò)蛋白質(zhì)譜與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，初步鑒定酶蛋白類型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 黑曲霉AspergillusnigerSM24/a，由中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所生物質(zhì)生化轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室自行篩選，最高木聚糖酶活力可以達(dá)到9 100 U/g干曲。

1.1.2 試劑 BCA法蛋白定量試劑盒，購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖酶活測(cè)定 取適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% 的木聚糖溶液1 mL混勻，50 ℃保溫30 min，用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定還原糖(以木糖為標(biāo)準(zhǔn))含量，以1 min釋放1 μmol木糖的酶量為1個(gè)酶活力單位[10]。

1.2.2 (NH4)2SO4鹽析分級(jí)沉淀 取100 mL木聚糖粗酶液置于冰浴中，按照不同飽和度緩慢加入(NH4)2SO4粉末，12 000 r/min冷凍離心15 min，用0.2 mol/L、pH為5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液復(fù)溶沉淀，上清液繼續(xù)追加到相應(yīng)飽和度，重復(fù)磁力攪拌、冷凍、離心復(fù)溶步驟，至不再有沉淀產(chǎn)生為止。復(fù)溶的液體置于4 ℃冰箱中保藏備用。

1.2.3 Bio-Gel P6凝膠過(guò)濾除鹽 取上述步驟濃縮后的1 mL蛋白清液上樣至Bio-Gel P6層析柱中，以pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡并洗脫，洗脫速度2 mL/min，收集對(duì)應(yīng)各峰的蛋白酶液進(jìn)行酶活性及蛋白含量的測(cè)定。

1.2.4 UNO sphere Q陰離子交換層析 將除鹽濃縮后的1 mL蛋白清液上樣于經(jīng)醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)平衡好的UNO sphere Q陰離子交換柱，A液用醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)作為起始緩沖液，B液用外加1 mol/L NaCl的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)作為洗脫緩沖液，按照0～1 mol/L NaCl線性梯度洗脫蛋白質(zhì)，洗脫速度2 mL/min，收集所有出峰酶液，對(duì)其進(jìn)行酶活性及蛋白含量的測(cè)定。

1.2.5 Enrich SEC70凝膠排阻層析 將經(jīng)過(guò)陰離子交換層析初步純化后的0.25 mL蛋白清液上樣于經(jīng)醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)平衡好的Enrich SEC70凝膠柱中，洗脫速度1.5 mL/min，收集所有出峰酶液，對(duì)其進(jìn)行酶活性及蛋白含量的測(cè)定。

1.2.6 SDS-PAGE蛋白電泳 采用SDS-PAGE不連續(xù)垂直凝膠電泳，電極液采用Tris-甘氨酸緩沖體系，分離膠緩沖液pH 8.8，濃度為10%，濃縮膠緩沖液pH 6.8，濃度為5%，70 V恒壓電泳2.5 h[11]。

1.2.7 木聚糖酶酶譜分析 瓊脂糖板的制備：準(zhǔn)確稱取20 mg木聚糖、400 mg瓊脂，溶于20 mL蒸餾水中，電爐加熱溶解后，灌入已預(yù)熱到60 ℃左右模板中，冷凝后去掉玻璃板即得木聚糖膠板。在樣品制備、分離膠、buffer中不加SDS與巰基乙醇。采用1.2.6中電泳操作方式進(jìn)行凝膠活性電泳后，將凝膠鋪在含木聚糖的膠板上，50 ℃恒溫箱中保溫1 h。電泳膠進(jìn)行染色、脫色，木聚糖膠用0.1%剛果紅染色0.5 h后，再用1 mol/L NaCl漂洗脫色、掃描儀掃描成像[12]。

1.2.8 蛋白質(zhì)譜檢測(cè) 利用德國(guó)布魯克(Bruker Dalton)Autoflex speedTMMALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。UV波長(zhǎng)為355 nm，重復(fù)速率為200 HZ，加速電壓為20 000 V，最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1 500 Da。掃描質(zhì)量范圍為700～3 200 Da，收集信號(hào)。胰酶自切峰為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜儀。利用軟件flexAnalysis(Bruker Dalton)過(guò)濾基線峰、識(shí)別信號(hào)峰。利用BioTools(Bruker Dalton)軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，具體操作由廣州輝駿生物科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶譜和PAGE圖譜

黑曲霉菌株SM24/a木聚糖酶酶譜如圖1所示。該菌株所產(chǎn)粗酶液蛋白條帶復(fù)雜，但經(jīng)木聚糖凝膠板孵育后，木聚糖酶譜圖上有3條清晰的透明條帶即木聚糖酶條帶，可以推斷該粗酶液中至少有3種木聚糖酶，按照分子量大小依次命名為X-Ⅰ、X-Ⅱ、X-Ⅲ。

圖1 木聚糖酶SDA-PAGE(A)和活性酶譜(B)分析Fig.1 SDS-PAGE(A) and Zymogram(B) of culture filitrate

2.2 硫酸銨分級(jí)沉淀

沉淀用0.2 mol/L、pH為5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液復(fù)溶到10 mL，測(cè)定其木聚糖酶活力以及蛋白量。隨著硫酸銨飽和度的增加，沉淀中的蛋白量以及木聚糖酶活力都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)硫酸銨飽和度低于40%時(shí)，酶活力和蛋白量都很低；當(dāng)飽和度在50%～70%時(shí)，沉淀中蛋白量以及木聚糖酶活力達(dá)到最高；當(dāng)飽和度高于70%時(shí)，蛋白量繼續(xù)增加但是酶活力卻明顯下降，說(shuō)明在此飽和度下雜蛋白開始逐漸增多；當(dāng)飽和度超過(guò)80%時(shí)，蛋白量比例繼續(xù)增大，酶活力降得很低。為了提高蛋白純化的效果和得率，確定最佳硫酸銨飽和度為40%～80%。

2.3 Bio-Gel P6脫鹽

經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀后酶液脫鹽結(jié)果如圖2所示。由于蛋白分子量較大，在經(jīng)過(guò)Bio-Gel P6脫鹽柱時(shí)，只是在填料顆粒間隙中流動(dòng)，所以很快被洗脫下來(lái)，而小分子物質(zhì)和鹽則會(huì)通過(guò)大量微孔，需在柱內(nèi)停留更長(zhǎng)的時(shí)間才被逐漸洗脫。圖2中有兩個(gè)主要的峰，大部分酶蛋白在第一管A1中洗脫下來(lái)，此時(shí)電導(dǎo)率較低，而小分子的鹽逐漸在后面洗脫，電導(dǎo)率逐漸升高后降低。

2.4 UNO sphere Q陰離子交換層析

脫鹽后的酶液經(jīng)過(guò)陰離子交換層析的洗脫圖譜如圖3所示。圖3中出現(xiàn)3個(gè)比較明顯的洗脫峰，取A1、A9 和A14管，分別記為Q1、Q9和Q14，進(jìn)行酶譜和凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖4、5。

圖2 Bio-Gel P6 脫鹽圖譜Fig.2 Bio-Gel P6 desalting chromatogram

圖3 UNO sphere Q 陰離子交換層析圖譜Fig.3 UNO sphere Q ion exchange chromatogram

圖4 木聚糖酶SDA-PAGE(A)和離子交換后組分活性酶譜分析(B)Fig.4 SDA-PAGE (A) and Zymogram (B) of xylanases seperated by ion exchange chromatogram

圖5 離子交換后組分SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE of different compositons seperated by ion exchange chromatogram

從圖4的活性酶譜分析可以看出，Q1與Q9分別含有一個(gè)木聚糖酶蛋白分子X-Ⅰ與X-Ⅱ，Q14中含有兩個(gè)木聚糖酶蛋白，其中一個(gè)分子量大小與X-II相近，推斷二者為同一蛋白，而另一個(gè)木聚糖酶蛋白分子為X-III。同時(shí)圖5中SDS-PAGE結(jié)果顯示這三個(gè)洗脫峰中含有其他雜帶，因此，為達(dá)到純化分離效果需進(jìn)一步的色譜層析。

2.5 Enrich SEC70(10×300)凝膠色譜層析

凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同而達(dá)到分離效果，高分子量的蛋白質(zhì)在填料顆粒間隙中流動(dòng)，比小分子量蛋白更早被洗脫下來(lái)。為了實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的分離純化，對(duì)Q1、Q9和Q14中的酶液進(jìn)行凝膠色譜層析，結(jié)果如圖6、7和8所示，Q1蛋白成分相對(duì)簡(jiǎn)單，得到兩個(gè)主要的峰，記為Q1-S11和Q1-S12；Q9中出現(xiàn)3個(gè)峰，取對(duì)應(yīng)的洗脫液記為Q9-S5、Q9-S7和Q9-S8，Q1和Q9都很好地實(shí)現(xiàn)了基線分離；Q14的蛋白成分復(fù)雜，前面幾個(gè)峰相互重疊，僅取最后一個(gè)單一峰記為Q14-S13，同時(shí)將所有出峰位置對(duì)應(yīng)洗脫液組分收集進(jìn)行酶活測(cè)定，最后測(cè)得Q1-S12、Q9-S8和Q14-S13三個(gè)組分有木聚糖酶活力。將這3個(gè)組分進(jìn)行木聚糖酶譜和SDS-PAGE驗(yàn)證，結(jié)果如圖9和10所示，在Q1-S12、Q9-S8和Q14-S13中獲得純度較高的不同蛋白條帶，分別對(duì)應(yīng)粗酶液酶譜上的木聚糖酶蛋白分子X-Ⅰ、X-Ⅱ和X-Ⅲ。

圖6 Q1 樣品的Enrich SEC70凝膠色譜圖Fig.6 Enrich SEC70 size exclusion chromatogram of Q1

圖7 Q9 樣品的Enrich SEC70凝膠色譜圖Fig.7 Enrich SEC70 size exclusion chromatogram of Q9

圖9 Q1-S12、Q9-S8和Q14-S13木聚糖酶活性酶譜Fig.9 Xylanase zymogram of Q1-S12、Q9-S8 and Q14-S13

圖10 Q1-S12、Q9-S8和Q14-S13SDS-PAGE圖譜Fig.10 SDS-PAGE of Q1-S12、Q9-S8 and Q14-S13

2.6 3種木聚糖酶的質(zhì)譜檢測(cè)

將純化后的3條木聚糖條帶從電泳膠板切下，進(jìn)行蛋白質(zhì)譜檢測(cè)，利用BioTools(Bruker Dalton)軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，明確鑒定的蛋白質(zhì)類型。質(zhì)譜所得肽段與多肽蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)X-I蛋白與AspergilluskawachiiIFO 4308、AspergillusnigerCBS 513.88等菌株所產(chǎn)木聚糖酶系中內(nèi)切-β-1, 4木聚糖酶同源性較高，屬于糖基水解酶中的第10家族；X-Ⅱ蛋白與Aspergillusniger某些菌株所產(chǎn)木聚糖酶系中木聚糖酶同源性較高，屬于糖基水解酶中的第11家族；X-Ⅲ蛋白與Aspergillusniger某些菌株所產(chǎn)木聚糖酶系中木聚糖酶同源性較高，屬于糖基水解酶中的第11家族。

2.7 純化回收率的計(jì)算

通過(guò)幾種純化方法的結(jié)合可以順利實(shí)現(xiàn)粗酶液整個(gè)純化過(guò)程。將100 mL粗酶液各個(gè)純化步驟所得組分用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和DNS法分別進(jìn)行蛋白質(zhì)和酶活力的測(cè)定，比酶活、純化倍數(shù)及回收率結(jié)果見表1。分析表中數(shù)據(jù)可知，(NH4)2SO4分級(jí)沉淀會(huì)造成部分木聚糖酶蛋白損失，同時(shí)也有一定純化效果，經(jīng)過(guò)分級(jí)沉淀后木聚糖酶純化倍數(shù)為1.8倍。經(jīng)過(guò)Bio-Gel P6脫鹽步驟，蛋白損失相對(duì)較少，沉淀后的酶液獲得進(jìn)一步的純化，純化倍數(shù)為2.13倍。經(jīng)過(guò)陰離子柱UNO sphere Q和凝膠色譜柱Enrich SEC70后，各個(gè)收集管中的木聚糖酶蛋白組分得到更進(jìn)一步的提純。由于粗酶液中還有其他內(nèi)切酶組分，而實(shí)驗(yàn)只選取其中酶活較高、雜蛋白較少的組分進(jìn)行重點(diǎn)分析，其他組分均被去除，酶的損失很大。分離純化后獲得了3種木聚糖酶組分，各組分酶比活力得到顯著提高，其數(shù)值分別為37.41、34.56和53.96 U/mg，其純化倍數(shù)分別為3.96、3.66和5.72。同時(shí)單一酶組分的回收率均較低下，這與覃擁靈等[13]和楊云龍等[14]純化結(jié)果相似，其原因可能是由于純化過(guò)程操作步驟較繁瑣，導(dǎo)致木聚糖酶部分失活[15-16]。

表1 Aspergillus niger SM24/a的木聚糖酶純化結(jié)果

3 討 論

本文研究了黑曲霉AspergillusnigerSM24/a所產(chǎn)木聚糖酶的純化體系，經(jīng)過(guò)飽和度40%～80% (NH4)2SO4沉淀、Bio-Gel P6除鹽、UNO sphere Q陰離子交換和Enrich SEC70凝膠色譜層析，成功實(shí)現(xiàn)了其粗酶液中3種木聚糖酶蛋白X-Ⅰ、X-Ⅱ和X-Ⅲ的分離純化。經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析和蛋白氨基酸序列比對(duì)，初步認(rèn)定X-Ⅰ屬于糖基水解酶第十家族內(nèi)切-β-1, 4木聚糖酶，X-Ⅱ和X-Ⅲ均屬于糖基水解酶第十一家族木聚糖酶。研究結(jié)果為研究其酶學(xué)性質(zhì)和分子改良提供材料，同時(shí)為進(jìn)一步利用該酶進(jìn)行木質(zhì)纖維素酶解及低聚木糖制備奠定基礎(chǔ)。

·寫作常識(shí)·

本刊常用的計(jì)量單位

為了更好地執(zhí)行國(guó)務(wù)院發(fā)布的《關(guān)于在我國(guó)統(tǒng)一實(shí)行法定計(jì)量單位的命令》的規(guī)定，根據(jù)國(guó)標(biāo)(GB3100～3102-93)標(biāo)準(zhǔn)，單位符號(hào)一般用英文小寫(正體)，來(lái)源于人名的單位,其符號(hào)的首字母大寫,只有體積單位升例外,它的符號(hào)用“L,(l)”,推薦采用L?，F(xiàn)將本刊常用計(jì)量單位符號(hào)及與之容易混淆的符號(hào)介紹如下，希望作者參照?qǐng)?zhí)行。

時(shí)間：年用a,不用y,yr；星期、周(無(wú)符號(hào)),不用wk;月(無(wú)符號(hào)),不用mo;日用d,不用day；小時(shí)用h,不用hr；分鐘用min,不用m；秒用s,不用sec表示。

溶液濃度：用mol/L,不用M(克分子濃度)和N(當(dāng)量濃度)等非許用單位表示。

百分濃度:務(wù)必注明是重量百分濃度,還是體積百分濃度。

面積:公頃用hm2,不用ha,畝或公畝,換算因數(shù)為 1hm2=15畝。

旋轉(zhuǎn)速度：用r/min，×g,不用rpm。

蒸汽壓力：用Pa或kPa、MPa表示,不用大氣壓at,kg/m2或kg/cm2等。

光密度：用OD(斜體)表示。

生物大分子的分子量：蛋白質(zhì)用u或ku，核酸用bp或kb表示。

Isolation, Purification, and Identification of Xylanase fromAspergillusnigerSM24/a

GAO Yue-shu1, XU Jing-liang2, YUAN Zhen-hong2, JIANG Jian-chun1, HE Min-chao2, ZHANG Ning1

(1.Inst.ofChem.Indust.ofForestProducts,ChineseAcad.ofForestry,Nanjing210042; 2.GuangzhouInst.ofEnergyConvers'n,ChineseAcadofSci.,Guangzhou510640)

Separation and purification of xylanase are the base of carrying out its enzymological study and molecular improvement. Xylanase fermentation was carried out usingAspergillusnigerSM24/a bred in the lab. The crude enzyme solution was fractionally precipitated with (NH4)2SO4, desalinated by Bio-Gel P6, separated and purified with UNO sphere Q anion exchange and Enrich SEC70 gel chromatography, these four steps, and successfully obtained three kinds of xylanase, and named as X-I, X-II, and X-III. As the increment of purification steps, the specific activity of each component was significantly improved, their numerical value respectively were 37.41 U/mg, 34.56 U/mg and 53.96 U/mg, and the purification folds were 3.96, 3.66, and 5.72 respectively. Through mass spectrometry and amino acid sequence comparison, it was initially confirmed that X-I belonged to endo-β-1,4-xylanase of glycosyl hydrolase family 10, and both X-II and X-II belonged to xylanase of glycosyl hydrolase family 11.

Aspergillusniger; xylanase; separation and purification; identification

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20160150)；中國(guó)林科院林業(yè)新技術(shù)所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(CAFYBB2017SY034)；

中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(y507k71001)

高月淑 女，助理研究員，博士。主要從事生物質(zhì)生化轉(zhuǎn)化技術(shù)研究。Tel:025-85482436，E-mail:gaoyueshu2199@163.com

2016-07-13；

2016-09-09

Q554

A

1005-7021(2017)03-0016-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.003

* 通訊作者。男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師。主要從事林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)加工和生物質(zhì)能源開發(fā)技術(shù)研究。Tel：025-85482488，

E-mail:bio-energy@163.com