賀建武, 黎有有, 楊玉婷, 樊 林, 李夢霖, 余 冰, 易 旻, 劉祝祥, 陳義光*

(1.吉首大學(xué) 生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 湖南 吉首 416000; 2. 吉首大學(xué) 杜仲綜合利用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,湖南 吉首 416000；3.酒鬼酒股份有限公司, 湖南 吉首 416000)

酒鬼酒釀造環(huán)境異常球菌屬菌株的生物學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育分析

賀建武1,2, 黎有有3, 楊玉婷1, 樊 林2, 李夢霖1, 余 冰3, 易 旻1, 劉祝祥1, 陳義光1*

(1.吉首大學(xué) 生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 湖南 吉首 416000; 2. 吉首大學(xué) 杜仲綜合利用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,湖南 吉首 416000；3.酒鬼酒股份有限公司, 湖南 吉首 416000)

研究對分離自馥郁香型白酒酒鬼酒制曲和發(fā)酵車間空氣的8株異常球菌屬(Deinococcus)菌株的特征及系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)行研究。采用添加體積分?jǐn)?shù)10%酒鬼酒混合浸汁的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離，挑選并純化與異常球菌屬菌株表型相似的菌株，考察其相關(guān)生理生化特征，并進(jìn)行基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析。通過表型特點篩選，得到23株異常球菌屬疑似菌株。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，23株菌株中有8株屬于異常球菌屬，歸屬于該屬的4個種(D.radiotolerans、D.daejeonensis、D.ficus和D.yunweiensis)。形態(tài)觀察和生理生化實驗表明，這些異常球菌屬菌株在內(nèi)生孢子、革蘭染色、過氧化氫酶實驗、生長溫度范圍、生長pH范圍、多聚物水解等特征方面，與它們系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切的典型菌株之間存在不同程度的差異。

白酒；釀造環(huán)境；異常球菌屬；空氣源微生物；系統(tǒng)發(fā)育分析

傳統(tǒng)白酒釀造過程中，空氣、原料、用水、場地、用具、設(shè)備，甚至人手及鞋等環(huán)境因素中都有功能微生物的參與[1-2]，釀酒環(huán)境空氣聚集有大量有益于釀造的微生物，保持著獨特且穩(wěn)定的動態(tài)平衡，在形成風(fēng)味獨特且無法復(fù)制白酒香型方面發(fā)揮重要作用[3]。湖南吉首、貴州遵義、四川宜賓和瀘州等地存在一個重要的微生物發(fā)酵帶，出產(chǎn)了包括酒鬼酒、茅臺酒、五糧液和瀘州老窖等多種名酒[4]。以馥郁香型為特點的酒鬼酒生產(chǎn)基地位于武陵山區(qū)腹地湘西吉首市，其釀造環(huán)境中存在豐富的產(chǎn)淀粉酶和脂酶的微生物類群[5]，形成了與酒鬼酒特殊香型相適應(yīng)的微生物區(qū)系。異常球菌屬菌株是能對引起細(xì)胞致死效應(yīng)的輻射有抵抗能力的細(xì)菌，有學(xué)者統(tǒng)計異常球菌屬微生物的分離環(huán)境囊括了空氣、土壤、水處理污泥、巖石、動物糞便、動物體及其腸道等[6]，在我國白酒的微生物區(qū)系研究中有只見到少量關(guān)于異常球菌綱的相關(guān)報道[7]。我們在對馥郁香型白酒酒鬼酒的空氣源微生物進(jìn)行相關(guān)分析時，從制曲車間和釀造車間空氣中分離到較多的與異常球菌屬表型特征接近的菌株。異常球菌屬微生物在白酒釀造領(lǐng)域的應(yīng)用開發(fā)中鮮見報道，這些菌株是否可能存在一些與釀酒相關(guān)的特殊生理特點？因此，對該批疑似異常球菌屬菌株進(jìn)行生物學(xué)特征觀察和系統(tǒng)發(fā)育分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 樣品分別采自酒鬼酒有限公司馥郁香型系列白酒制曲車間和發(fā)酵車間，采樣方法為空氣沉降法[8]，分別選取發(fā)酵車間室內(nèi)四角和中央?yún)^(qū)域距墻30 cm以外區(qū)域，高度距地面1 m左右且無人員流動的范圍為采樣點，將裝有培養(yǎng)基的采樣皿暴露于空氣中30 min后快速蓋好皿蓋，24 h內(nèi)帶回實驗室，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基：添加體積分?jǐn)?shù)10%酒鬼酒混合浸汁的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA(牛肉膏粉3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH 7.2～7.4)，酒鬼酒混合浸汁由酒鬼酒糖化熟料、窖泥、黃水和腐殖土組成。產(chǎn)胞外酶基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基：蛋白胨1 g，酵母膏1 g，水1 000 mL；除尿素水解外，其余水解實驗培養(yǎng)基pH調(diào)至7.5～8.0。

1.1.3 主要儀器及試劑 GNP-9050型恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏公司)，Moticam 2306型光學(xué)顯微鏡(Motic公司)，5810R型離心機(Eppendorf)，PE-9600型PCR儀(BIO-RAD公司)；細(xì)菌基因組DNA提取和純化試劑、酶及細(xì)菌通用PCR引物均購自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司(Sangon)，其他分析試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株形態(tài)特征 根據(jù)菌落的顏色、大小、邊緣、濕潤度、透明度、與培養(yǎng)基結(jié)合程度等特征挑取培養(yǎng)皿上的單菌落進(jìn)行四分體劃線純化。細(xì)胞形態(tài)用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，菌株的表型特征、生理生化特性參照常見細(xì)菌鑒定系統(tǒng)手冊[9]。

1.2.2 細(xì)菌DNA提取及PCR擴(kuò)增 DNA提取及16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增參照Li等[10]使用的方法，通用引物Primer A 8-27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和Primer B 152-1504R：(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)，PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%～1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純度測試后送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行16S rRNA基因序列測定。

1.2.3 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 將16S rRNA基因序列導(dǎo)入NCBI網(wǎng)站和EzTaxon server網(wǎng)站[11]在GenBank/EMBL/DDBJ等公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性序列搜索，選出同源性最高的相關(guān)典型菌株的16S rRNA基因序列組成序列集，通過軟件包Clustal X[12]進(jìn)行比對分析，使用BioEdit軟件[13]進(jìn)行序列剪輯，根據(jù)Kimura模型[14]估算系統(tǒng)進(jìn)化距離矩陣；應(yīng)用MEGA軟件[15]，采用鄰位相接法(Neighbour-Joining)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建；并用bootstrap法[16]重復(fù)取樣1 000次自展以評估系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

采用添加混合浸汁的NA培養(yǎng)基，從制曲和發(fā)酵車間空氣源中分離培養(yǎng)共得到192株純培養(yǎng)物，結(jié)合細(xì)菌鑒定手冊[9]以及張玉琴等[17]報道的異常球菌屬特點，挑選出細(xì)胞呈球形或短桿狀、無鞭毛不具運動性，且菌落顏色呈鮮紅、桔紅或者粉紅色的疑似異常球菌屬(Deinococcus)菌株23株，其表型特征見表1。

表1 酒鬼酒制曲和發(fā)酵車間空氣樣品中疑似異常球菌屬菌株的表型特征

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

在與已發(fā)表的關(guān)于異常球菌屬微生物形狀描述對比的基礎(chǔ)上，對23株可能為異常球菌屬的菌株進(jìn)行了16S rRNA基因序列擴(kuò)增和測序，所得序列提交至GenBank注冊。經(jīng)在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對后確定其分類地位，結(jié)果顯示23株疑似異常球菌中有8株(登錄號見圖1)與異常球菌-棲熱菌群(Deinococcus-Thermus)異常球菌科(Deinococcaceae)的異常球菌屬(Deinococcus)的菌株發(fā)育關(guān)系最為密切。

從系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)來看，JSM 2175016與異常球菌屬典型菌株DeinococcusficusCC-FR2-10T的基因序列相似度為97.4%，JSM 2215060 與DeinococcusdaejeonensisMJ27T的基因序列相似度為97.9%，菌株JSM 2215109和JSM 2155001與該屬的DeinococcusradiotoleransC1T發(fā)育關(guān)系最為密切，基因序列相似度分別為97.6%和96.9%，菌株JSM 2215105、JSM 2145010、JSM 2215108和JSM 2175012與該屬的典型菌株DeinococcusyunweiensisYIM 007T以大于99%的16S rRNA基因序列相似度和極高的自展值(boostrap value, 100%)聚為進(jìn)化樹的一個穩(wěn)定的分支。

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的8株異常球菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of 8 Deinococcus strains

2.3 生理生化特征

考察異常球菌屬菌株JSM 2145010、JSM 2155001、JSM 2175012、JSM 2195006、JSM 2215105、JSM 2215108、JSM 2215109和JSM 22150608在5～50 ℃，pH 4～13范圍內(nèi)耐受范圍，同時考察其內(nèi)生孢子、革蘭染色、過氧化氫酶、明膠液化、脂酶、脲酶等情況，結(jié)果見表2和表3。

表2顯示菌株JSM 2175016、JSM 2215060、JSM 2215109和JSM 2155001 與各自進(jìn)化距離最近的典型菌株生理生化指標(biāo)的對比情況。菌株JSM 2175016與最接近的D.ficusCC-FR2-10T比較，呈革蘭陰性反應(yīng)，生長溫度和對pH的耐受范圍呈現(xiàn)差異，明膠水解能力較弱，脂酶和脲酶反應(yīng)呈陰性。JSM 2215060與典型菌株D.daejeonensisMJ27T比較，對高溫的耐受性要強，同時表現(xiàn)出典型菌株不具備的脲酶陽性反應(yīng)。JSM 2215109和JSM 2155001與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切的典型菌株比較，表現(xiàn)出典型菌株D.radiotoleransC1T所不具備的明膠水解和產(chǎn)脂酶的能力。

表3顯示菌株JSM 2215105、JSM 2145010、JSM 2215108和JSM 2175012與典型菌株D.yunweiensisYIM 007T系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，在生理生化指標(biāo)方面，與典型菌株D.yunweiensisYIM 007T相比而言，對溫度的耐受范圍窄，對pH的耐受范圍廣，革蘭染色、過氧化氫酶、明膠水解、脂酶、脲酶等生理生化指標(biāo)接近。

表2 JSM 2175016等4株異常球菌屬菌株與該屬相近菌株典型種特征比較

注:D.ficus、D.daejeonensis和D.radiotoleranss數(shù)據(jù)引自 Lai等[20]、Srinivasan等[18]和Ferreira等[21]；“+”表示陽性，“-”表示陰性，下表同

表3 JSM 2215105等4株異常球菌屬菌株與該屬相近菌株典型種特征比較

注：D.yunweiensis數(shù)據(jù)引自Zhangt等[18-19];W表示生長或反應(yīng)很弱

3 討 論

我國傳統(tǒng)白酒釀造主要依賴于環(huán)境中的微生物，長期的生產(chǎn)過程對釀酒環(huán)境微生物也進(jìn)行了馴化，形成了獨特的釀酒微生物區(qū)系[22]。馥郁香型酒鬼酒的制曲車間和釀造車間空氣源中存在較高比例的淀粉酶活性和酯酶活性菌株[23-24]，同時還存在較高的類群多樣性。在其他香型的白酒中，目前未見異常球菌屬微生物的有效報道，本次分離出的8株異常球菌屬微生物，拓展了釀酒微生物在分類學(xué)中的范疇。

對比了分離自馥郁香型酒廠空氣源中異常球菌屬微生物與各自分類地位接近的典型菌株的生理生化指標(biāo)，考察結(jié)果顯示分離自該酒廠的異常球菌屬微生物表現(xiàn)出不同程度的明膠水解、脂酶和脲酶的特征，脂酶是傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)形成的物質(zhì)基礎(chǔ)[25-26]，現(xiàn)有報道這些生理特點主要以抗輻射特征為主的異常球菌，是否與馥郁香型酒鬼酒獨特的風(fēng)味物質(zhì)形成有一定的相關(guān)性，還需進(jìn)一步深入研究。

Biological Characteristic and Phylogenetic Analysis ofDeinococcusStrains Isolated from Fermentation Environment ofJiuguiLiquor

HE Jian-wu1, 2, LI You-you3, YANG Yu-ting1, FAN Lin2, LI Meng-Lin1, YU Bing3, YI Min1, LIU Zhu-xiang1, CHEN Yi-guang1

(1.Coll.ofBiol. &Environ′tSci.,JishouUni;2.Nat′l&LocalUnitedEngin.Lab.ofIntegrat.Utilizat′nTechnol.ofEucommiaulmoides; 3.JiuguiLiquorCo.Ltd.,Jishou416000)

Strain characteristics and phylogenetic analysis results of eightDeinococcusstrains isolated from air in fermentation and leaven making workshops ofJiuguiliquor offuxiangstyle using nutrition medium adding 10%Juiguiliquor mixed immersed juice and selecting and purifying phenotype similarDeinococcusstrains were reported in this paper. The results showed that 23 ambiguousDeinococcusstrains of were obtained through phenotype characteristics screening. Then, 8 out of 23 strains were investigated by means of phylogenetic analyses based on 16S rRNA gene sequence comparisons. The results suggested that, these 8 strains were the members of 4 species of the genusDeinococcus(D.radiotolerans,D.daejeonensis,D.ficus, andD.yunweiensis). Morphology and physiological and biochemical experiments show that the spores, gram staining, catalase, growth temperature range, pH range, polymer hydrolysis and other characteristics of theseDeinococcusstrains have different degree of imparities with the closest phylogenetic relations of the typical strains.

spirit;brewingenvironment;Deinococcus; airborne microbes; phylogenetic analysis

國家自然科學(xué)基金項目(30970007)；湖南省重點學(xué)科建設(shè)項目(JSU071312Z01)；湖南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊支持計

賀建武 男，實驗師。研究方向為微生物資源與生態(tài)。E-mail:hejsu@jsu.edu.cn

* 通訊作者。男，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向為微生物資源與分類。Tel:0743-8564416，E-mail:mchenjsu@aliyun.com

2016-06-27；

2016-08-15

Q939.97

A

1005-7021(2017)03-0033-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.006

劃項目(201208Z01)；酒鬼酒股份有限公司委托項目(JGKJ2012-JD03)